Name: Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Klonierung alloantigenspezifischer T-Zellen aus peripherem Blut mittels Dichtegradientzentrifugation, magnetischer Separation und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die gezielte Analyse immunologischer Reaktionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Der Autor möchte sich bei der NIH Tetramer Core Facility für die Tetramerproduktion bedanken. Der Autor möchte sich auch bei E.D. O'Connor und K.E. Marquez vom Durchflusszytometrielabor der UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility für die Unterstützung bei der Zellsortierung bedanken. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grant K08AI085039 (G.P.M.) finanziert.

HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert die Verwendung von peripheren Blutproben von Probanden. Alle Forschung mit menschlichen Probanden sollten überprüft und durch eine Menschen Studies Institutional Review Board genehmigt, um die Einhaltung der Deklaration von Helsinki (2013) und dem Health Insurance Portability and Accountability Act von 1996 zu gewährleisten. 1. Isolierung von T-Zellen aus Vollblut <ol><li> Vor dem Start, warm das Dichtegradienten-Medium auf Raumtemperatur. Aliquot 4 ml Dichtegradienten-Medium in 2-4 sterile konische 15 ml-Zentrifugenröhrchen (1 Röhrchen pro 10 ml Gesamtvolumen verdünnt Blut verwendet werden). </li><li> Erhalten 10-20 ml Blut in 1-2 Natrium-Heparin sprühbeschichteten (grün-top) venösen Blutröhrchen. Sammeln Humanproben unter der Aufsicht von ausgebildeten Personen und gemäß einem Institutional Review Board genehmigten Protokoll. </li><li> Wischen Sie die Außenseite der Rohre mit 70% Ethanol. Die Spitzen des fi vorsichtig entfernengefüllt Sammelröhrchen und dekantiert die Blut in ein steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> 10 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu jeder Blutsammelröhrchen. Sammeln Sie die PBS, fügen dem dekantiert Vollblut, und vorsichtig mischen. </li><li> In 25 ul humanen T-Zell Enrichment Cocktail / 2 ml Gesamtvolumen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Verwendung einer 10 ml Pipette Schicht bis zu 10 ml der 1: 1 verdünnten Blut vorsichtig auf der Oberseite der Dichtegradienten-Medium. Achten Sie darauf, nicht die Oberfläche des Dichtegradientenmedium stören. </li><li> Zentrifuge Schicht Blut und Dichtegradienten-Medium bei 1200 × g für 20 min bei 20 o C. </li><li> Die Röhrchen aus der Zentrifuge, dabei die Schnittstelle zwischen dem Dichtegradienten-Medium und der Schicht aus Leukozyten an der Schnittstelle zwischen der Dichtegradienten-Medium und verdünnte Plasma nicht zu stören. Mit einem 5 ml Pipette vorsichtig sammeln die Leukozyten-Schicht und in ein neues steriles 50 ml konischen Wannee. </li><li> In PBS, um das Volumen des gesammelten PBL auf 50 ml zu bringen und vorsichtig mischen. </li><li> Zentrifuge bei 600 × g für 5 min bei 20 o C. Dekantieren. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in 10 ml sterile Durchflusszytometrie Sortierpuffer (sterilfiltriert PBS, enthaltend 1% BSA). Probe 10 &amp; mgr; l der Zellsuspension 1:10 verdünnen Trypanblau (90 ul addieren), um Zellen mit einer Zählkammer zählen (erwartete Ausbeute werden 1 - 4 x 10 6 Zellen / Röhrchen Vollblut). <ol><li> Entfernen 1 ml Aliquot, Transfer zum 5-ml-Tube und auf Eis zu halten für die Analyse von T-Zellen nicht durch Tetramer beschriftet. Halten Zellsuspension auf Eis. </li></ol></li></ol> 2. Magnetische Anreicherung von Alloantigen-spezifischen T-Zellen <ol><li> Verdünnte Alloantigen pMHC Tetramer bis 1: 100 in sterilem Sortierpuffer. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension (9 ml von Schritt 1.11) bei 600 × g für 5 min bei 20 o C. Dekantieren. </li><li> In 50 ul alloantigen pMHC Tetramer verdünnt, um pelletiertZellen (bis zu 10 7 Zellen). Mischen leicht Pipettieren. Transfer zu einem sterilen 5 ml-Tube. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> 2 ml Art Puffer. Zentrifuge bei 600 × g für 5 min bei 20 o C. Dekantieren. </li><li> Zellen in 100 ul Sortierpuffer. In 10 ul Biotin Selection Cocktail und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur. </li><li> In 5 ul Magnetische Nanopartikel und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> In 2,5 ml Art Puffer und vorsichtig mischen. Entfernen 100 ul Aliquot, Transfer zum 5-ml-Tube und auf Eis zu halten für die Analyse der Voranreicherungszellen. </li><li> Legen Sie die 5 ml Röhrchen mit der Zellsuspension in der Zellseparation Magnet. Die Kappe sollte locker oben auf dem Rohr sein. Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Kappe von der Tube. Halten Sie die Röhre und Magnet zusammen, dekantiert man die Tubeninhalt in ein frisches 5-ml-Tube. Tippen Sie nicht oder schütteln die Tubeninhalt zuentfernt die letzten Tropfen Flüssigkeit. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch vom Magnet. 2 ml kaltem Sortierpuffer und vorsichtig mischen. Probe 10 ul Zellsuspension verdünnt 1: 2 (in den 10 ul) Trypanblau um Zellen zu zählen mit einer Zählkammer. </li></ol> 3. Herstellung von T-Zellen für die Einzelzell-Durchflusszytometrie Zellsortierung <ol><li> In kalten Sortierpuffer in alle Röhrchen von Zellen (Tetramer unmarkierten, Tetramer-markierten un-angereichert und Tetramer-markierten angereicherten), um die Lautstärke zu 3 ml zu bringen. </li><li> Zentrifuge bei 600 × g für 5 min bei 4 ° C dekantiert Puffer in Zellen zu gewinnen. </li><li> Resuspendieren pelletierten Zellen in 25 ul kalten Sortierpuffer. In 5 ul menschlichen Fc-Block. Inkubieren auf Eis für 20 min. </li><li> Bereiten Antikörper für die Durchflusszytometrie Sortierung. Mischungs 15 ul Sortierpuffer, 15 &amp; mgr; l anti-CD5, 15 &amp; mgr; l Anti-CD14, und 15 &amp; mgr; l Anti-CD19. </li><li> Mit 20 &amp; mgr; l der Antikörpermischung in jedes Röhrchen der Zellen. Inkubieren auf Eis für 20 min. </li><li> 2 ml kaltem Sortierpuffer in jedes Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 600 × g für 5 min bei 4 ° C dekantiert Puffer in Zellen zu gewinnen. </li><li> Die Zellen in einer Konzentration von 1 -2 x 10 6 Zellen / ml in Sortierpuffer. </li><li> Aliquots von 100 ul des humanen T-Zellkulturmedium (Iscove DMEM mit 2 mM Glutamax, 10 mM HEPES, 50 ug / ml Gentamycin, 50 &amp; mgr; M 2-Mercaptoethanol, 10% hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum und 2,5 ng / ml rekombinanten menschlichen ergänzt IL-2) zu jedem Well einer 96-Well-Rundboden-Zellkulturplatte. Halten Sie auf dem Eis. </li></ol> 4. Isolierung von Tetramer-markierten T-Zellen durch Einzel-Zell-Durchflusszytometrie Sortierung <ol><li> Richten Durchflusszytometrie Gating Parameter alloantigen-pMHC Tetramer markierten T-Zellen (Abbildung 2.a) zu identifizieren. Verwenden Sie die Voranreiche Tetramer markierten Fraktion feststellen Gating Strategien zur Dubletten, Tor auf Lymphozyten zu eliminieren, auszuschließen CD19 exprimieren B-Zellen und CD14exprimierenden Monozyten und T-Zellen zu identifizieren, indem CD5 Ausdruck. Verwenden die Probe nicht mit Tetramer als Fluoreszenz minus einer Steuer markiert die Gating für die Identifizierung von Tetramer bindende T-Zellen zu etablieren (mit 0% von CD5 + CD14 - CD19 - Zellen aus der Probe nicht durch Tetramer markierten innerhalb dieses Tor fällt) . HINWEIS: Gating-Strategien, die nicht ausreichend stringent werden in Isolation von nicht-T-Zellen oder T-Zellen, die nicht antigenspezifisch sind, ergeben, sind, während zu restriktiv Gating Strategien wird die Zahl der T-Zellen isoliert reduzieren. </li><li> Programm den Plattenparameter für die einzelne Zelle sortieren. Richten Sie die Sortierer 1 CD5 + CD14 platzieren - CD19 - Tetramer + Zelle in jede Vertiefung. Richten Sie die eingerichtet, um ein Negativkontrolle (keine Zellen in den gut sortierten) und 1 positive Kontrollvertiefung enthalten (100 CD5 + CD14 - CD19 - Tetramer - Zellen) Platte in jeder Reihe (Abbildung 2.B </strong&gt;). </li><li> Mit dem etablierten Durchflusszytometrie Gating-Strategie und Plattenaufbau isolieren einzelnen Tetramer bindenden T-Zellen direkt in den 96-Well-Platte mit einem durchflusszytometrischen Zellsortierer. </li></ol> 5. Kultur und Ausbau der Alloantigen-spezifischen T-Zellklonen <ol><li> Nach Abschluss der Zellsortierung, Zentrifugenplatte bei 600 × g für 5 min bei 20 o C. Ort Kulturplatte bei 37 ° C in einer 6% CO 2 -Inkubator. </li><li> Vortex stimulierenden anti-CD3 / anti-CD28 Microbeads für 30 Sekunden, um Perlen zu resuspendieren. </li><li> Berechnen Sie Volumen von Aktivator Perlen für Stimulation der T-Zellen erforderlich gesammelt (0,5 ul Aktivator Mikroperlen / Vertiefung). Übertragen berechnete Volumen der Stimulator-Perlen in eine sterile 5 ml Tube. 1 ml Human-T-Zellkulturmedium und Wirbel. </li><li> Zeigen Rohr mit Mikroperlen-Suspension in Magnet. Die Kappe sollte locker oben auf dem Rohr sein. Inkubation für 2 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie vorsichtigdie Kappe von der Röhre. Halten Sie die Röhre und Magnet zusammen, dekantieren Tubeninhalt in ein frisches 5-ml-Tube. Nicht tippen oder bewegen Tubeninhalt. </li><li> Entfernen Sie den Schlauch vom Magnet. Hinzufügen menschlichen T-Zellkulturmedium (100 &amp; mgr; l Medium / 0,5 ul Mikroperlen zunächst hinzugefügt). </li><li> Aliquots von 100 ul Aktivator Perlensuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Inkubieren Kulturplatte bei 37 ° C in einer 6% CO 2 -Inkubator. </li><li> Überwachen Sie das Zellwachstum täglich durch mikroskopische Untersuchung. 7 Tage-Kultur (Abbildung 3.a) - kleine Cluster von proliferierenden Zellen nach 5 mikroskopisch beobachtet werden. HINWEIS: Visualisierung der T-Zellkulturen zu diesem Zeitpunkt kann schwierig sein, und die Abwesenheit von beobachtbaren Zellcluster in diesem Stadium nicht notwendigerweise indikativ für einen Mangel an wachsenden T-Zellen sein. </li><li> 14 Tage nach der Zellisolierung, Futterkulturen durch vorsichtiges Entfernen 100 ul Medium weg von der Spitze der Kultur und mit 100 μ ersetzen; L frische humane T-Zellkulturmedium. Weiter Inkubieren Kulturplatte bei 37 ° C in einer 6% CO 2 -Inkubator. </li><li> Überwachung des Zellwachstums täglich durch mikroskopische Untersuchung und Auswertung der Farbe des Kulturmediums. 3 Tage nach dem Mediumwechsel - große Zellhaufen sollte mikroskopisch 2 sichtbar sein. Makroskopisch sollte Zellpellets während der 14 Tage nach dem Mediumwechsel sichtbar. </li><li> Mit 28 Tagen nach Zellisolierung, identifizieren wachsenden Klone durch mikroskopische Untersuchung. Übertragen die 200 &amp; mgr; l Volumen der wachstums positive 96-Well-Plattenkulturen auf einzelne Vertiefungen einer 48-Well-Gewebekulturplatten, die 200 &amp; mgr; l menschlichen T-Zell-Kulturmedium. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l, enthaltend 12,5 ul stimulierenden anti-CD3 / anti-CD28-Mikroperlen (hergestellt wie in Abschnitt 5.2 beschrieben - 5.6). Inkubieren Kulturplatte bei 37 ° C in einer 6% CO 2 -Inkubator. </li><li> Überwachen Kulturwachstum täglich durch mikroskopische exPrüfung und Bewertung der Farbe von dem Kulturmedium. Wenn T Zellkultur erreicht&gt; 2x10 6 / ml (in der Regel 3-5 Tage nach der erneuten Stimulation, kann von dem Tag, an dem das Medium beginnt geschätzt werden Drehen strohgelb), Transfer Kultur zu einer Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte und fügen Sie 500 ul menschliche T-Zell-Medium. </li><li> Bei 10-14 Tagen folgen Restimulation, sammeln 200 ul T-Zellkultur zu alloantigen Spezifität durch Strömungs beurteilen Zytometrie Analyse pMHC Tetramer Bindung (unter Verwendung der in den Abschnitten 3 und 4.1 beschrieben Kennzeichnung und Gating-Strategie). </li></ol> 6. Langfristige Wieder Stimulation und Kultur von T-Zellklonen <ol><li> Ständig neu zu stimulieren und zu erweitern klonalen T-Zell-Kulturen, die mit der gewünschten Spezifität kann alle 14 Tage. Sammeln T-Zellkulturen in eine sterile 5 ml Tube am Tag 14 nach der letzten Anti-CD3 / CD28 Mikrobead Stimulation. Kombinieren mehrerer Vertiefungen der gleichen T-Zell-Klon in einem einzigen Rohr, bis zu einem Volumen von 2,5 ml. </li&gt; <li> In mittleren bis das Endvolumen auf 2,5 ml zu bringen und vorsichtig mischen. </li><li> Legen Sie die 5 ml Röhrchen mit dem T-Zellkultur in die Zellseparation Magneten an alten Mikroperlen aus der Kultur zu entfernen. Die Kappe sollte locker oben auf dem Rohr sein. Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Kappe von der Tube. Halten Sie die Röhre und Magnet zusammen, dekantiert die Zellsuspension in ein frisches 5-ml-Tube. Nicht tippen oder bewegen Tubeninhalt, um die letzten Tropfen Flüssigkeit zu entfernen. </li><li> Hinzufügen Medium, um das Endvolumen auf 4 ml zu bringen. Probe 10 ul, um Zellen mit einer Zählkammer zählen. </li><li> Erholen T-Zellen durch Zentrifugation bei 600 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Dekantieren. Resuspendieren T-Zellen bei 10 6 Zellen / ml menschlichen T-Zell-Kulturmedium. 1 ml Aliquots in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. </li><li> Wieder stimulieren T-Zellen durch Zugabe von 100 &amp; mgr; l Medium, enthaltend 12,5 ul stimulierenden anti-CD3 / aNTI-CD28 Microbeads (- 5,6 wie in den Abschnitten 5.2 beschrieben). Inkubieren bei 37 ° C in einer 6% CO 2 -Inkubator. </li></ol>

<ol><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).</li>
<li>Morris, G. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+TCR+balances+sensitivity+and+specificity+for+the+recognition+of+self+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens.</a> Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).</li>
<li>Arstilla, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+estimation+of+the+human+%CE%B1%CE%B2+T+cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity.</a> Science. 286 (5441), 958-961 (1999).</li>
<li>Robbins, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+assessment+of+T-cell+receptor+%CE%B2-chain+diversity+in+%CE%B1%CE%B2+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells.</a> Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).</li>
<li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8%2B+T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).</li>
<li>Suchin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+alloreactive+T+cells+in+vivo%3A+new+answers+to+an+old+question%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question.</a> J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).</li>
<li>Felix, N. J., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+T-cell+alloreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Specificity of T-cell alloreactivity.</a> Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).</li>
<li>Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloreactivity+is+limited+by+the+endogenous+peptide+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).</li>
<li>Suri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+APCs%2C+the+autologous+peptides+selected+by+the+diabetogenic+I-Ag7+molecule+are+unique+and+determined+by+the+amino+acid+changes+in+the+P9+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket.</a> J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).</li>
<li>Yssl, H., Spits, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+maintenance+of+cloned+human+T+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and maintenance of cloned human T cell lines.</a> Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Moon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%2B+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).</li>
<li>Chicz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+promiscuity+among+naturally+processed+peptides+bound+to+HLA-DR+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles.</a> J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).</li>
<li>Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ability+to+rearrange+dual+TCRs+enhances+positive+selection%2C+leading+to+increased+allo-+and+autoreactive+T+cell+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires.</a> J. Immunol. In press, (2014).</li>
<li>Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+receptor+T+cells+mediate+pathologic+alloreactivity+in+patients+with+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease.</a> Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).</li>
<li>Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+functional+peptide+complexes+of+class+II+major+histocompatibility+complex+proteins+from+subunits+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Die T-Zell-Alloreaktivität ist ein seit langem untersuchtes und klinisch relevantes Phänomen. Die robusten proliferativen und Effektorreaktionen von T-Zellen auf allogene Stimulation haben umfangreiche Analysen der humanen T-Zell-Antworten in vitro durch relativ einfache gemischte Lymphozytenreaktionen von peripheren Blut-T-Zellen gegen inaktivierte allogene Zellen ermöglicht. Diese primären alloreaktiven T-Zell-Antworten sind jedoch oligoklonal und bestehen aus einer großen Anzahl einzelner T-Zellen, die auf sp...

T-Lymphozyten sind kritische Komponenten des adaptiven Immunsystems. T-Zellen sind nicht nur direkt Vermittlung schützende Immunantworten gegen Pathogene durch eine Vielzahl von Effektor-Mechanismen, sondern auch aktiv Aufrechterhalten immunologischen Selbsttoleranz und Lenken der Antworten von anderen Zellen des Immunsystems verantwortlich. Diese Funktionen werden durch eine Reihe von integrierten Signale, einschließlich T-Zell-Rezeptor (TCR), Ligation, Zytokine und Chemokine und Metaboliten 1 gerichtet. Dieser Signale ist von besonderer Bedeutung der TCR, da sie die charakteristische Besonderheit, die die Rolle der T-Zellen in der adaptiven Immunität definiert. Ein TCR wechselwirkt mit linearen Peptids durch MHC-Antigene (HLA menschliche Ortholog) Moleküle (pMHC-Komplexe) in eine hochspezifische und empfindliche Weise dargestellt, um die Signale, die T-Zell-Effektor-Funktion zu initiieren. Die biochemischen Parameter des TCR Wechselwirkungen mit pMHC Liganden bieten nicht nur die Spezifität für TZellaktivierung, sondern auch über eine qualitative Wirkung auf nachfolgende T-Zell-Funktion 2. So studieren T-Zell-Funktion erfordert häufig die Prüfung der Antworten der klonalen T-Zellen mit definierten Antigenspezifität. Das menschliche T-Zell-Kompartiment, die ungefähr 10 12 αβ T-Zellen, enthält schätzungsweise 7. Oktober - 8. Oktober deutliche αβTCRs 3-4. Diese vielfältigen Repertoire bietet Gelegenheit für die Anerkennung der Vielzahl von Peptiden, die von potenziellen Krankheitserregern, die eine T-Zell-Antwort für eine schützende Immunität erfordern würden. Es wird geschätzt, daß die Frequenz von T-Zellen reagieren auf eine gegebene Fremdantigen durch Selbst MHC präsentiert wird, ist in der Größenordnung von 10 -4 - 10 -7 in der ohne vorherige Immunantwort auf dieses Antigen 5. Die naive T-Zell-Repertoire von Thymus Auswahl geformt, um die Fähigkeit zur Selbst-MHC-Antigene erkennen und präsentieren Peptide Grenze reagiert werdenduktivität gegen Selbstpeptidantigene, die Maximierung der potenziellen Nutzen für die Vermittlung eine schützende Immunität 2. Unter Verstoß gegen diese entwickelt Reaktivität, eine relativ große Frequenz, 10 -3 jedoch - 10 -4, der T-Zellen aus immunologisch naive Individuen reagieren auf die Stimulation mit allogenen Zellen, erkennen sowohl die fremden MHC-Moleküle sowie die endogene Peptide präsentieren sie 6. Die Erkennung von allogenen pMHC Liganden ist strukturell ähnlich der Erkennung von fremden Antigenen durch Selbst-MHC präsentiert; Die TCR macht kritischen biochemischen Wechselwirkungen sowohl mit dem allogenen MHC-Molekül als auch die Peptid 7 dargestellt. Die robuste Natur der Reaktion der T-Zellen allogene Stimulierung resultiert aus der Vielfalt der pMHC-Komplexen auf der Oberfläche einer allogenen Zellen 8 vorhanden. Es wird geschätzt, dass jedes MHC präsentiert etwa 2 x 10 4 unterschiedlichen endogenen Peptidantigene 9. Diese breadth der Antwort auf allogene Stimulation ist ein wesentlicher Aspekt der klinisch relevanten Pathologie, wie etwa Transplantatabstoßung oder Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD), von T-Zell-Alloreaktivität resultieren. Untersuchung der menschlichen T-Zellantworten alloreaktiven traditionell durch Prüfung polyklonalen Reaktionen von naiven T-Zellen nach Stimulation mit allogenen Zellen verlassen. Wiederholte Stimulierung mit dem gleichen allogenen Zelllinie zusammen mit Grenzverdünnungsanalyse ist in der Lage klonalen T-Zellen mit definierten Erkennung von allogenen HLA 10. Jedoch ist dieser Ansatz problematisch für die Prüfung Antworten auf individuelle allogenen pMHC-Liganden, da die großen und vielfältigen Repertoire von endogenen pMHC-Komplexe für eine gegebene allogenen HLA vorliegenden stimuliert ein breites Repertoire an T-Zellen. Diese Massenpopulation Stimulation und Grenzverdünnungs Ansatz Screening einer großen Anzahl von Klonen erforderlich T-Zellen mit der gewünschten Reacti isolierenvität gegen einen einzelnen pMHC Liganden. Zusätzlich ist die Häufigkeit von T-Zellen reagieren auf eine einzelne allogenen pMHC Ligand unter naive T-Zell-Populationen, die ein Hindernis für die effiziente Erzeugung von menschlichen T-Zell-Klone, die auf ein gegebenes Antigen präsentiert relativ gering. Identifizierung und Isolierung von Antigen-spezifischen T-Zellen von polyklonalen Populationen wurden durch die Entwicklung von Fluorophor-markierten pMHC Multimere 11 aktiviert. Dieser Ansatz nutzt spezifische Peptidantigene in rekombinanten löslichen biotinylierten MHC-Moleküle, die durch Bindung an Streptavidin-markierten Fluorophor markiert werden geladen. Multimerisierung pMHC erhöht die Gier, Kompensieren des intrinsisch niedrigen (uM) Affinität der TCR für lösliche pMHC Liganden. Markierten Zellen identifiziert und mittels Durchflusszytometrie getrennt werden. Jedoch ist dieser Ansatz noch von der niedrigen Frequenz von Antigen-spezifischen T-Zellen unter naive T-Zell-Populationen, die in der Regel begrenztum Größenordnungen geringer als die Grenze der genaue Identifizierung und Quantifizierung der meisten Durchflusszytometer. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein Verfahren zum pMHC Tetramer Kennzeichnung und anschließende magnetische Perle Bereicherung Tetramer-markierten Zellen wurden 12 entwickelt. Dieses Verfahren hat eine zuverlässige Erkennung, Zählung und Isolierung des Niederfrequenz-Antigen-spezifischen T-Zellen nachgewiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein wirksames Protokoll für die Herstellung von menschlichen T-Zell-Klone, die spezifisch auf einzelne allogenen pMHC-Liganden reagieren. Das Protokoll gilt pMHC (HLA) Multimer Kennzeichnung und Anreicherung für die Isolierung von Alloantigen-spezifischer menschlicher T-Zellen mit Durchflusszytometrie und Zellsortierung einem robusten Verfahren zur in vitro Kultur von humanen T-Zellen, die Produktion von T-Zell-Klonen, die aus Einzelzellen sortiert (Freigabe Übersicht in Figur 1).

<table><tbody><tr><td>Natrium-Heparin-Venenblutentnahmeröhrchen 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS, 1x ohne Ca oder Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Fluorophor-markiertes pMHC-Tetramer</td><td>NIH Tetramer Facility</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Biotin Selection Kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Selection Magnet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Humane Fc-Blockierungslösung</td><td>Biolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (Klon UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (Klon HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 FITC (Klon HIB19)</td><td>Biolegend</td><td>302205</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's DMEM, ohne b-ME oder L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat (50 mg/ml)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Human-AB-Serum, männlicher Spender</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human-T-Aktivator CD3/CD28</td><td>Leben Technologies</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Medien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellsortierpuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)2</td> <td>ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-Zell-Kulturmedium</td><td></td><td></td><td></td>für humane</tr><tr><td>Zellen DMEM von Iscove's DMEM</td><td>351,6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>0,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol (14,3 M)</td><td>1,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes IL-2 (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human alloantigen-spezifischen t-zellen aus peripherem blut

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Das Studium der menschlichen T-Lymphozytenbiologie beinhaltet oft die Untersuchung von Reaktionen auf aktivierende Liganden. T-Zellen erkennen und reagieren auf prozessierte Peptidantigene, die von MHC-Molekülen (humaner orthologer HLA) über den T-Zell-Rezeptor (TCR) präsentiert werden, und zwar auf hochempfindliche und spezifische Weise. Während die Hauptfunktion von T-Zellen darin besteht, schützende Immunantworten auf fremde Antigene zu vermitteln, die von self-MHC präsentiert werden, reagieren T-Zellen robust auf antigene Unterschiede in allogenen Geweben. T-Zell-Antworten auf Alloantigene können entweder als direkte oder indirekte Alloreaktivität beschrieben werden. Bei der Alloreaktivität reagiert die T-Zelle durch eine hochspezifische Erkennung sowohl des vorgestellten Peptids als auch des MHC-Moleküls. Die robuste oligoklonale Reaktion von T-Zellen auf allogene Stimulation spiegelt die große Anzahl potenziell stimulierender Alloantigene wider, die in allogenen Geweben vorhanden sind. Während die Breite der alloreaktiven T-Zell-Antworten ein wichtiger Faktor bei der Initiierung und Vermittlung der Pathologie ist, die mit biologisch relevanten alloreaktiven Reaktionen wie der Graft-versus-Host-Krankheit und der Allotransplantatabstoßung verbunden ist, kann sie eine Analyse der T-Zell-Antworten auf allogene Liganden ausschließen. Zu diesem Zweck beschreibt dieses Protokoll ein Verfahren zur Erzeugung alloreaktiver T-Zellen aus naiven humanen peripheren Blutleukozyten (PBL), die auf bekannte Peptid-MHC (pMHC)-Alloantigene ansprechen. Das Protokoll wendet die pMHC-Multimermarkierung, die Anreicherung magnetischer Beads und die Durchflusszytometrie auf Einzelzell-In-vitro-Kulturmethoden zur Erzeugung von Alloantigen-spezifischen T-Zell-Klonen an. Dies ermöglicht es, die Biochemie und Funktion von T-Zellen zu untersuchen, die auf allogene Stimulation reagieren.

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung klonaler menschlichen T-Zellkulturen mit Alloantigen Spezifität über eine Magnetperle Anreicherung und Einzelzell Durchflusszytometrie Sortierstrategie festgelegt. Abbildung 1 gibt einen Überblick über den Prozess. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> Figur 1: Protokoll Sicht Das hier beschriebene Protokoll stellt ein zuverlässiges Verfahr...

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung und Vermehrung von menschlichen T-Zell-Klonen, die spezifisch auf ein definiertes Alloantigen reagieren. Dieses Protokoll kann für die Klonierung menschlicher T-Zellen angepasst werden, die für eine Vielzahl von Peptid-MHC-Liganden spezifisch sind.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane T-Zellen mit einer definierten Allo-Antigen-Spezifität zu identifizieren, zu isolieren und zu klonen. Dies wird erreicht, indem zunächst T-Lymphozyten aus dem peripheren Vollblut durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. Im zweiten Schritt werden die allo-antigen-spezifischen T-Zellen mit Fluor-4-konjugierten Peptiden, HLA, Tetrameren markiert und durch magnetische Trennung angereichert.Als nächstes werden die markierten T-Zellen durch Einzelzell-Durchflusszytometrie-Zellsortierung isoliert. Abschließend werden die Einzelzellkulturen mit anti CD 3 und anti CD 25 Antikörpern stimuliert. Letztendlich kann die allo-Reaktivität der antigenspezifischen T-Zellen durch durchflusszytometrische Analyse bewertet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Techniken, wie z. B. der Stimulation von Bulk-Lymphozyten und der Begrenzung der Verdünnung, besteht darin, dass diese Technik die Erzeugung von T-Zell-Klonen mit spezifischer Reaktivität auf wohldefinierte allo-Antigene ermöglicht. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten bei der Kultivierung und Vermehrung der T-Zell-Klone haben. Dies erfordert eine sorgfältige tägliche Überwachung der Kulturen Vor Beginn des Eingriffs.Aliquotieren Sie vier Milliliter Dichtegradient bei Raumtemperatur in zwei bis vier sterile konische 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 70 % Ethanol, um die Außenseite von ein bis zwei gefüllten Blutentnahmeröhrchen mit grünem Deckel abzuwischen, die das Blut eines gesunden Freiwilligen enthalten, und entfernen Sie dann vorsichtig die Spitzen, füllen Sie das Blut in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um. und dann jedes Sammelröhrchen mit 10 Millilitern PBS erneut befüllen. Mischen Sie die Waschungen mit dem dekantierten Vollblut und mischen Sie vorsichtig eine Lösung, dann inkubieren Sie die Zellen mit 25 Mikrolitern humanem T-Zell-Anreicherungscocktail pro zwei Milliliter Gesamtvolumen des verdünnten Blutes. Nach 20 Minuten mit einer 10-Milliliter-Pipette bis zu 10 Milliliter Blut sanft auf das Dichtegradientenmedium aufschichten, dabei darauf achten, die Oberfläche des Gradienten nicht zu stören.Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang und übertragen Sie dann mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vorsichtig die Leukozytenschicht von der Grenzfläche des Dichtegradienten und des verdünnten Plasmas in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Bringen Sie das Volumen der gesammelten peripheren Blutlymphozyten mit PBS auf bis zu 50 Milliliter und mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig an. Zählen Sie dann die Zellen und entnehmen Sie ein Aliquot von einem Milliliter für die Analyse.Nachdem Sie die Zellreanimation heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter Durchflusszytometrie-Puffer und mischen Sie 50 Mikroliter des verdünnten Allo-Antigen-Peptids MHC-Tetramer in die Zellsuspension. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles Fünf-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Zellen nach 30 Minuten in zwei Millilitern Puffer-Reanimation. Suspendieren Sie den Gaumen in 100 Mikrolitern Sortierpuffer und inkubieren Sie die Zellen dann 15 Minuten lang in 10 Mikrolitern Biotin Selection Cocktail.Inkubieren Sie die Zellen anschließend 10 Minuten lang in fünf Mikrolitern magnetischen Partikeln und mischen Sie dann die Zellsuspension vorsichtig mit 2,5 Millilitern Sortierpuffer. Entfernen Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot für die Analyse von Putzanreicherungszellen und setzen Sie das Röhrchen dann in den Zelltrennmagneten ein. Halten Sie nach fünf Minuten das Röhrchen und den Magneten zusammen und füllen Sie den Inhalt in ein frisches Fünf-Milliliter-Röhrchen um.Nehmen Sie dann das Röhrchen vom Magneten und waschen Sie die Zellen in zwei Millilitern Sortierpuffer, resuspendieren Sie das Pellet in kaltem Sortierpuffer und aliquotieren Sie die Zellen in zwei Millilitern kaltem Sortierpuffer pro Probentyp. Nachdem Sie die Proben erneut heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie die Pellets wieder in 25 Mikrolitern kaltem Sortierpuffer und inkubieren Sie die Zellen in fünf Mikrolitern humanem FC-Block auf Eis für 20 Minuten. Inkubieren Sie anschließend die Röhrchen mit 20 Mikrolitern des entsprechenden Antikörpercocktails.Waschen Sie die Zellen nach 20 Minuten in zwei weiteren Millilitern Kaltsortierpuffer und resuspendieren Sie die Pellets bei ein bis 2 Millionen Zellen pro Milliliter. In mehr Puffer aliquotieren Sie dann 100 Mikroliter humanes T-Zell-Kulturmedium in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturplatte mit rundem Boden und lagern Sie die Platte auf Eis, bis die Sortierung abgeschlossen ist. Nach dem Sortieren zentrifugieren Sie die Platte und legen die Zellen dann bei 37 Grad Celsius in einen 6%CO2-Inkubator.Mischen Sie anschließend das entsprechende Volumen der Aktivatorkügelchen durch Vortexen und geben Sie das entsprechende Volumen der Kügelchen in ein steriles Fünf-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie die Kügelchen auf dem Magneten gewaschen haben, dekantieren Sie die Waschlösung und geben Sie 100 Mikroliter humane T-Zellkultur, Medium pro 0,5 Mikroliter Mikrokügelchen, in das Röhrchen. Aliquotieren Sie dann 100 Mikroliter der Aktivatorperlensuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator zurück.Kleine Cluster proliferierender Zellen können mikroskopisch nach fünf bis sieben Tagen Kultur und 14 Tage nach der Zellisolierung beobachtet werden. Ersetzen Sie vorsichtig 100 Mikroliter Medium von der Oberseite der Kulturen durch 100 Mikroliter frische menschliche T-Zellkultur. Mittelgroße Zellcluster sollten zwei bis drei Tage nach der Fütterung mikroskopisch sichtbar sein; makroskopische Zellpellets sollten in den 14 Tagen nach dem Mediumwechsel sichtbar werden.Nach 28 Tagen nach der Zellisolierung wird das gesamte Volumen der wachstumspositiven Kulturen von 200 Mikrolitern in einzelne Vertiefungen einer 48-Well-Gewebekulturplatte mit 200 Mikrolitern humanem T-Zell-Kulturmedium überführt. Geben Sie dann 12,5 Mikroliter des Stimulans anti CD three, anti CD 28 Mikrokügelchen in 100 Mikroliter humanes T-Zell-Kulturmedium und stellen Sie die Platte drei bis fünf Tage nach der Restimulation wieder in den Inkubator. Das Medium sollte anfangen, strohgelb zu werden.Übertragen Sie die Kulturen zu diesem Zeitpunkt in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatte und fügen Sie jeder Kultur 500 Mikroliter humanes T-Zell-Medium hinzu. Sammeln Sie schließlich 10 bis 14 Tage nach der Restimulation 200 Mikroliter jeder T-Zellkultur, um ihre Allo-Antigen-Spezifität durch durchflusszytometrische Analyse ihres Peptids zu beurteilen. MHC-Tetramer-Bindung: Die erwartete Ausbeute an allo-Antigen-spezifischen T-Zellen hängt vom Spender, dem verwendeten allo-Antigen und der entsprechenden Häufigkeit reaktiver T-Zellen im Spender ab.Zum Beispiel hat ein durchschnittlicher gesunder Spender 4.500.000 bis 10 Millionen Leukozyten pro Milliliter Blut, von denen etwa 20 % T-Lymphozyten sind. Diese Punktdiagramme veranschaulichen die Ergebnisse der Messung der Bindung von T-Zellen von einem vier negativen HLAD-Donor an ein spezifisches allo-Antigen. Zum Beispiel wurde in diesem Experiment eine Häufigkeit von einer von 4.776 allo-antigenspezifischen T-Zellen aus einer Startanzahl von 20 Millionen Leukozyten aus dieser Ausgangszellpopulation gezählt.88 einzelne Temer-markierte T-Zellen konnten isoliert werden. Nach zwei Runden der Mikrobead-Stimulation und -Kultur wurden zwei wachstumspositive Kulturen durch eine mikroskopische Untersuchung identifiziert und ihre Allo-Antigen-Spezifität durch Untersuchung ihrer Bindung an das A 2 30 48 HLA DR bewertet. Vier Tetramere. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellkulturen täglich zu überwachen, um Zelltod und Überwachsen der Kulturen zu verhindern. Nach diesem Verfahren können die T-Zell-Klone verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. um die Biochemie der allogenen Ligandenerkennung zu untersuchen und wie sich dies in effektive Immunantworten umsetzen lässt.

generation-of-human-alloantigen-specific-t-cells-from-peripheral-blood

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Papier beschreibt eine einfache Technik, um Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen zu induzieren. Die Technik kann klinisch angewendet werden, um nicht alloreaktive Spenderzellen zu generieren. Infusion dieser Zellen verbessern könnte Immunrekonstitution und reduzieren Toxizität nach allogener Stammzelltransplantation.

Induktion von Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen durch Alloantigen Stimulation mit Co-stimulatorische Signal Blockade

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen regulatorische, Speicher und naive T-Zellen aus einem einzelnen menschlichen Blutspender. Polarisierten Tregs können dann auf andere Teilmengen in einer Vielzahl von genetischen und funktionelle Anwendungen mit genetische Homogenität, einschließlich einer Unterdrückung Assay auch hier detailliert verglichen werden.

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

Wir beschreiben eine wertvolle diagnostische Assays, die möglicherweise verwendet werden könnten, um den Abzug der Immunsuppression nach der Transplantation ohne erhöhten Risiko einer Abstoßungsreaktion zu entscheiden. Der Test basiert auf den Grundsätzen der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ und liefert genaue Beurteilung der beiden Spender spezifischen Effektor-und regulatorischen Immunantworten durch Empfänger montiert.

Trans-vivo Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ Assay für Antigen-spezifische Verordnung

Hier beschreiben wir einen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) Assay zur Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus in getrockneten Blutflecken mit einem einfachen manuellen Proteinfällungsschritt und Online-Säulenextraktion.

Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS

Wir stellen hier eine Methode zur Entwicklung von funktionellen Antigen (Ag)-spezifischen regulatorischen T-Zellen (Tregs) aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) für die Immuntherapie von Autoimmunarthritis in einem Mausmodell vor.

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren zur Alloreaktivität in einer gemischten Population von T-Zellen unter Verwendung von Mess Cytometry Abbildungsströmung.

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum induzieren Toleranz in der Transplantationsmedizin und in Vitro und in Vivo zu bewerten, die unterdrückende unterschiedliche Zelle Teilmengen des Empfängers und der Immunstatus des Empfängers in Richtung Spender oder exogene Antigene.

In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung funktioneller Tumorantigen-spezifischer induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteterCD8- + einzelner positiver T-Zellen mit OP9/DLL1-Kokultursystem.

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14+ -Monozyten

Lernen Sie die Isolierung und Klonierung alloantigenspezifischer T-Zellen aus peripherem Blut mittels Dichtegradientzentrifugation, magnetischer Separation und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die gezielte Analyse immunologischer Reaktionen.

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

Weitere Videos entdecken