Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane T-Zellen mit einer definierten Allo-Antigen-Spezifität zu identifizieren, zu isolieren und zu klonen. Dies wird erreicht, indem zunächst T-Lymphozyten aus dem peripheren Vollblut durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert werden. Im zweiten Schritt werden die allo-antigen-spezifischen T-Zellen mit Fluor-4-konjugierten Peptiden, HLA, Tetrameren markiert und durch magnetische Trennung angereichert.

Als nächstes werden die markierten T-Zellen durch Einzelzell-Durchflusszytometrie-Zellsortierung isoliert. Abschließend werden die Einzelzellkulturen mit anti CD 3 und anti CD 25 Antikörpern stimuliert. Letztendlich kann die allo-Reaktivität der antigenspezifischen T-Zellen durch durchflusszytometrische Analyse bewertet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Techniken, wie z. B. der Stimulation von Bulk-Lymphozyten und der Begrenzung der Verdünnung, besteht darin, dass diese Technik die Erzeugung von T-Zell-Klonen mit spezifischer Reaktivität auf wohldefinierte allo-Antigene ermöglicht. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten bei der Kultivierung und Vermehrung der T-Zell-Klone haben. Dies erfordert eine sorgfältige tägliche Überwachung der Kulturen Vor Beginn des Eingriffs.

Aliquotieren Sie vier Milliliter Dichtegradient bei Raumtemperatur in zwei bis vier sterile konische 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 70 % Ethanol, um die Außenseite von ein bis zwei gefüllten Blutentnahmeröhrchen mit grünem Deckel abzuwischen, die das Blut eines gesunden Freiwilligen enthalten, und entfernen Sie dann vorsichtig die Spitzen, füllen Sie das Blut in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um. und dann jedes Sammelröhrchen mit 10 Millilitern PBS erneut befüllen. Mischen Sie die Waschungen mit dem dekantierten Vollblut und mischen Sie vorsichtig eine Lösung, dann inkubieren Sie die Zellen mit 25 Mikrolitern humanem T-Zell-Anreicherungscocktail pro zwei Milliliter Gesamtvolumen des verdünnten Blutes. Nach 20 Minuten mit einer 10-Milliliter-Pipette bis zu 10 Milliliter Blut sanft auf das Dichtegradientenmedium aufschichten, dabei darauf achten, die Oberfläche des Gradienten nicht zu stören.

Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang und übertragen Sie dann mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vorsichtig die Leukozytenschicht von der Grenzfläche des Dichtegradienten und des verdünnten Plasmas in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Bringen Sie das Volumen der gesammelten peripheren Blutlymphozyten mit PBS auf bis zu 50 Milliliter und mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig an. Zählen Sie dann die Zellen und entnehmen Sie ein Aliquot von einem Milliliter für die Analyse.

Nachdem Sie die Zellreanimation heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter Durchflusszytometrie-Puffer und mischen Sie 50 Mikroliter des verdünnten Allo-Antigen-Peptids MHC-Tetramer in die Zellsuspension. Übertragen Sie die Zellen in ein steriles Fünf-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Zellen nach 30 Minuten in zwei Millilitern Puffer-Reanimation. Suspendieren Sie den Gaumen in 100 Mikrolitern Sortierpuffer und inkubieren Sie die Zellen dann 15 Minuten lang in 10 Mikrolitern Biotin Selection Cocktail.

Inkubieren Sie die Zellen anschließend 10 Minuten lang in fünf Mikrolitern magnetischen Partikeln und mischen Sie dann die Zellsuspension vorsichtig mit 2,5 Millilitern Sortierpuffer. Entfernen Sie ein 100-Mikroliter-Aliquot für die Analyse von Putzanreicherungszellen und setzen Sie das Röhrchen dann in den Zelltrennmagneten ein. Halten Sie nach fünf Minuten das Röhrchen und den Magneten zusammen und füllen Sie den Inhalt in ein frisches Fünf-Milliliter-Röhrchen um.

Nehmen Sie dann das Röhrchen vom Magneten und waschen Sie die Zellen in zwei Millilitern Sortierpuffer, resuspendieren Sie das Pellet in kaltem Sortierpuffer und aliquotieren Sie die Zellen in zwei Millilitern kaltem Sortierpuffer pro Probentyp. Nachdem Sie die Proben erneut heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie die Pellets wieder in 25 Mikrolitern kaltem Sortierpuffer und inkubieren Sie die Zellen in fünf Mikrolitern humanem FC-Block auf Eis für 20 Minuten. Inkubieren Sie anschließend die Röhrchen mit 20 Mikrolitern des entsprechenden Antikörpercocktails.

Waschen Sie die Zellen nach 20 Minuten in zwei weiteren Millilitern Kaltsortierpuffer und resuspendieren Sie die Pellets bei ein bis 2 Millionen Zellen pro Milliliter. In mehr Puffer aliquotieren Sie dann 100 Mikroliter humanes T-Zell-Kulturmedium in jede Vertiefung einer 96-Well-Zellkulturplatte mit rundem Boden und lagern Sie die Platte auf Eis, bis die Sortierung abgeschlossen ist. Nach dem Sortieren zentrifugieren Sie die Platte und legen die Zellen dann bei 37 Grad Celsius in einen 6%CO2-Inkubator.

Mischen Sie anschließend das entsprechende Volumen der Aktivatorkügelchen durch Vortexen und geben Sie das entsprechende Volumen der Kügelchen in ein steriles Fünf-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie die Kügelchen auf dem Magneten gewaschen haben, dekantieren Sie die Waschlösung und geben Sie 100 Mikroliter humane T-Zellkultur, Medium pro 0,5 Mikroliter Mikrokügelchen, in das Röhrchen. Aliquotieren Sie dann 100 Mikroliter der Aktivatorperlensuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator zurück.

Kleine Cluster proliferierender Zellen können mikroskopisch nach fünf bis sieben Tagen Kultur und 14 Tage nach der Zellisolierung beobachtet werden. Ersetzen Sie vorsichtig 100 Mikroliter Medium von der Oberseite der Kulturen durch 100 Mikroliter frische menschliche T-Zellkultur. Mittelgroße Zellcluster sollten zwei bis drei Tage nach der Fütterung mikroskopisch sichtbar sein; makroskopische Zellpellets sollten in den 14 Tagen nach dem Mediumwechsel sichtbar werden.

Nach 28 Tagen nach der Zellisolierung wird das gesamte Volumen der wachstumspositiven Kulturen von 200 Mikrolitern in einzelne Vertiefungen einer 48-Well-Gewebekulturplatte mit 200 Mikrolitern humanem T-Zell-Kulturmedium überführt. Geben Sie dann 12,5 Mikroliter des Stimulans anti CD three, anti CD 28 Mikrokügelchen in 100 Mikroliter humanes T-Zell-Kulturmedium und stellen Sie die Platte drei bis fünf Tage nach der Restimulation wieder in den Inkubator. Das Medium sollte anfangen, strohgelb zu werden.

Übertragen Sie die Kulturen zu diesem Zeitpunkt in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatte und fügen Sie jeder Kultur 500 Mikroliter humanes T-Zell-Medium hinzu. Sammeln Sie schließlich 10 bis 14 Tage nach der Restimulation 200 Mikroliter jeder T-Zellkultur, um ihre Allo-Antigen-Spezifität durch durchflusszytometrische Analyse ihres Peptids zu beurteilen. MHC-Tetramer-Bindung: Die erwartete Ausbeute an allo-Antigen-spezifischen T-Zellen hängt vom Spender, dem verwendeten allo-Antigen und der entsprechenden Häufigkeit reaktiver T-Zellen im Spender ab.

Zum Beispiel hat ein durchschnittlicher gesunder Spender 4.500.000 bis 10 Millionen Leukozyten pro Milliliter Blut, von denen etwa 20 % T-Lymphozyten sind. Diese Punktdiagramme veranschaulichen die Ergebnisse der Messung der Bindung von T-Zellen von einem vier negativen HLAD-Donor an ein spezifisches allo-Antigen. Zum Beispiel wurde in diesem Experiment eine Häufigkeit von einer von 4.776 allo-antigenspezifischen T-Zellen aus einer Startanzahl von 20 Millionen Leukozyten aus dieser Ausgangszellpopulation gezählt.

88 einzelne Temer-markierte T-Zellen konnten isoliert werden. Nach zwei Runden der Mikrobead-Stimulation und -Kultur wurden zwei wachstumspositive Kulturen durch eine mikroskopische Untersuchung identifiziert und ihre Allo-Antigen-Spezifität durch Untersuchung ihrer Bindung an das A 2 30 48 HLA DR bewertet. Vier Tetramere. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Zellkulturen täglich zu überwachen, um Zelltod und Überwachsen der Kulturen zu verhindern. Nach diesem Verfahren können die T-Zell-Klone verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. um die Biochemie der allogenen Ligandenerkennung zu untersuchen und wie sich dies in effektive Immunantworten umsetzen lässt.