Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Stammzelleigenschaften von humanen Ovarialkarzinomzellen mit Hilfe von Multi- und Einzelzell-basierten Kugel-Assays zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst SOX-Zellen mit zwei Reporter-RFP-Lentiviren ausgewählt werden, die durch Pur-Mycin-Behandlung transduziert werden. Im zweiten Schritt werden die RFP-positiven und RFP-negativen Zellen isoliert und als Einzel- oder Mehrzellkolonien pro Vertiefung plattiert. Als nächstes wird die primäre Kugelbildung mikroskopisch analysiert und dann werden die primären Kugelkulturen dissoziiert und für die Analyse der sekundären Kugelbildung neu plattiert.

Letztendlich werden diese Kugel-Assays verwendet, um den Anteil der mutmaßlichen Eierstockkrebs-Stammzellen zu berechnen, die eine Kugelbildungskapazität aufweisen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Krebsstammzellen zu beantworten, z. B. welche potenziellen Krebsstammzellpopulationen es gibt und wie hoch die Häufigkeit im gesamten Tumorbeutel ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die Identifizierung von Stammzellen von Eierstockkrebs geben kann, kann sie auch zur Isolierung von Krebsstammzellen aus anderen soliden Tumorentitäten wie dem Mammakarzinom angewendet werden.

24 Stunden nach der Transduktion menschlicher Ovarialkarzinomzellen mit lentiviralen Partikeln ist der Virusüberstand zu entfernen und die Zellen in PBS-Kultur zu waschen. Die Zellen sind 48 Stunden lang in vollständigem Medium. Wechseln Sie dann das Medium und fügen Sie nach fünf Tagen 10 Mikrogramm pro Milliliter Piro Mycin hinzu.

Behandeln Sie die Kulturen am nächsten Tag mit Schild in einer Verdünnung von eins bis 1000. Waschen Sie die Zellen in PBS und lösen Sie sie dann mit 0,05 % Trips in EDTA. Stoppen Sie die Reaktion nach drei Minuten mit vollständigem Medium.

Zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300-facher G-Temperatur und Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 0,5 bis einem Milliliter sterilem PBS und seihen Sie dann die resultierende Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Filter. Stellen Sie die Zellen auf eine Verdünnung von fünf mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter ein und fügen Sie dann 100 Mikroliter Kugeln Medium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem geringer Bindung als nächstes für einen einzelzellbasierten Kugel-Assay hinzu.

Verwenden Sie den Einzelzellenmodus, um eine Zelle in jede Vertiefung der Platte zu sortieren. Bewerten Sie dann die Zellen mikroskopisch, um die Beschichtungseffizienz zu beurteilen. Inkubieren Sie die Zellen in frischen Kugeln, Medium bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 mit täglicher Supplementierung des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors und des epidermalen Wachstumsfaktors.

Nach einer Woche wird lichtmikroskopisch die Anzahl der entstehenden Tumorsphären und das Vorhandensein des Fluoreszenzsignals aus dem integrierten Reportersystem fluoresziert. Zählen Sie die Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 100 Mikrometern als große Kugeln und die Kugeln mit einem Durchmesser von 50 bis 100 Mikrometern als kleine Kugeln. Achten Sie darauf, echte Kugeln und keine Zellcluster zu zählen.

Berechnen Sie dann den Anteil der Kugel, die RFP-positive oder RFP-negative Zellen gemäß der Formel zum Durchgang bildet. Die Kugeln beginnen damit, den Inhalt jeder Vertiefung in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Spülen Sie dann jede Vertiefung drei- bis fünfmal mit PBS aus, um sicherzustellen, dass alle Kugeln gesammelt sind, und schleudern Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 300-facher G-Temperatur und Raumtemperatur herunter.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation die Schlinge und die Wiederbelebung und suspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern 0,05 % EDTA bei 37 Grad Celsius in einem weichen Shaker für fünf Minuten. Wenn nach fünf Minuten keine großen Kügelchen sichtbar sind, tritrieren Sie die Zelllösung vorsichtig mit einer 100-Mikroliter-Pipettenspitze und fügen Sie 500 Mikroliter vollständiges Medium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Spin-Down-Zellen resuspendieren die Pellets vorsichtig in Kugelmedium und leiten die resultierende Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Filter ab, wie gerade bewertet.

die serielle Replattierung der Einzelzellen einzelne Zellen aus einer Primärkugel in 100 Mikrolitern Kugeln, Medium pro Well, in einer neuen 96-Well-Platte mit extrem geringer Bindung gesät. Verwenden Sie dann die gleiche Formel wie für den Primärkugel-Assay, um den Anteil der kugelbildenden Zellen in den sekundären Kugeln zu bewerten. Assays in mehrzellbasierten Sphären führten zu einer individuellen Tumorsphäre im Assay von fast 40 % der RFP-positiven humanen Ovarialkarzinomzellen im Vergleich zu nur 20 % der RFP-negativen Zellen zu einer individuellen Tumorsphäre im primären Sphären-Assay.

Überraschenderweise wird eine höhere Anzahl von Kugeln aus einer geringeren Anzahl plattierter Zellen sowohl in MGEM- als auch in D-M-E-M-F 12-basierten Medien gezählt, was zeigt, dass die Plattierungsmodalitäten die Ergebnisse in diesem Assay stark verzerrt haben. Im Gegensatz dazu ist bei der Immobilisierung von Zellen durch die Zugabe von 1%Methylcellulose die Effizienz der Kugelbildung in mehrzellbasierten Kugelkulturen weitgehend unabhängig von der Zelldichte. Etwa 35 % der Zellen aus den RFP-positiven Kugeln verlieren nach siebentägiger Kultur ihr rot fluoreszierendes Signal, was darauf hindeutet, dass diese Zellen eine Differenzierung durchlaufen haben, während über 65 % der Zellen ein RFP-Signal behalten, was auf eine Selbsterneuerungsfähigkeit hindeutet.

Im Gegensatz dazu bleiben Zellen aus Kugeln, die aus anfänglich RFP-negativen Zellen erzeugt wurden, RFP-negativ, was darauf hindeutet, dass sie unter diesen Bedingungen das Stammzellpotenzial nicht wiederherstellen können. Die Fluoreszenzmikroskopie an Kugeln, die aus einzelnen Zellen erzeugt wurden, bestätigt diese Daten und zeigt, dass einzelne Kugeln, die von RFP-positiven Zellen abgeleitet wurden, sowohl RFP-positive als auch RFP-negative Zellen enthalten. Während Kugeln, die von RFP-negativen Zellen abgeleitet werden, nach diesem Verfahren das Fehlen eines roten Signals behalten.

Andere Methoden wie Antikörper, Färbung oder Genexpressionsanalyse mittels Quantit-PCR können durchgeführt werden, um die Zellen mit hoher Bildungsfähigkeit weiter zu charakterisieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass In-vivo-Transplantationsassays an immunsupprimierten Mäusen durchgeführt werden müssen, um die Tumorstammzelleigenschaften der Kugel-initiierenden Zellen zu validieren.