Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Ziel dieses Verfahrens ist es, die embryonale Cochlea exvivo der Maus zu kultivieren und elektrisch zu operieren. Um verschiedene Aspekte der Cochlea-Entwicklung zu untersuchen, einschließlich der Morphogenese, der Differenzierung und der Wachstumsereignisse, wird zunächst der Kopf von einem embryonalen Mausembryo am 13. Tag entnommen. Als nächstes legen Sie die Innenohren frei, indem Sie das Gehirn entfernen, und isolieren Sie sie vom sich entwickelnden Schläfenbein, indem Sie sie von der Schädelbasis lösen.

Entfernen Sie dann den darüber liegenden Knorpel und öffnen Sie den Cochlea-Gang, um das sensorische Epithel der Cochlear zu erhalten. Der letzte Schritt besteht darin, die präparierte Cochlea mit oder ohne Elektroporation für bis zu einer Woche zu kultivieren. Letztendlich können die Implantate für die Bildgebung von lebenden Zellen oder die fixierte Immunfärbung analysiert und durch konfokale Bildgebung analysiert werden.

Cochlear explan bietet ein hervorragendes System, um verschiedene Aspekte der Organogenese zu untersuchen, wie z. B. Proliferation, Sulfatspezifikation und Polarität in der sich entwickelnden Cochlea und wie diese Ereignisse zum Wachstum und zur Differenzierung beitragen. Diese Technik ermöglicht es also, pharmakologische Manipulationen durchzuführen und Genfunktionen ex vivo zu überwachen. Und so konnte man bei dieser Technik in Verbindung mit dem Gentransfer durch Elektroporation die Expression des interessierenden Gens verändern und seine Funktion auf Einzelzellebene überwachen.

Zu Beginn dieses Verfahrens wird ein E 13-Mausembryokopf in eine sterile Schale mit kalter Präparierlösung gelegt. Unter einem Präpariermikroskop immobilisieren Sie den Embryokopf, indem Sie winzige Stifte um die Augenregion legen. Entfernen Sie dann mit zwei sterilen Pinzetten vorsichtig die Haut und öffnen Sie den Schädel auf der dorsalen Seite entlang der Mittellinie.

Entfernen Sie danach das Gehirn aus der Schädelhöhle. Die Innenohren, die sich innerhalb der Schläfenknochen befinden, sind an der Auskleidung des Blutgefäßes um sie herum zu erkennen. Als nächstes präparieren Sie die Innenohren von den Schläfenknochen, indem Sie die Pinzette unter das Gewebe legen und das Innenohr von der Schädelbasis isolieren.

Übertragen Sie anschließend die präparierten Innenohren in eine neue Schale mit kalter Präparierlösung. Richten Sie nun das Innenohr so aus, dass die Bauchseite nach oben zeigt. Stabilisieren Sie das Innenohr, indem Sie das scharfe Ende der Minuchinstifte vorsichtig durch den vestibulären Teil einführen.

Schneiden Sie mit einer ultrafeinen Pinzette den darüber liegenden Knorpel auf, indem Sie in der Nähe des ovalen Fensters einen Schnitt machen. Achten Sie darauf, dass die Pinzette nicht zu tief in den Knorpel eingeführt wird, da der darüber liegende Knorpel manchmal mit dem Cochlea-Gang verschmolzen ist. Entfernen Sie dann vorsichtig den Knorpel aus der Cochlea.

Legen Sie als Nächstes das sensorische Epithel frei, indem Sie die Pinzette an der Basis oder an der Spitze des Cochlea-Gangs platzieren und das Dach der Cochlea vorsichtig herausziehen. Als letzten Schritt wird das darunterliegende Bindegewebe vorsichtig aus dem freiliegenden sensorischen Epithel entfernt, so dass die Basis des Cochlea-Explans flach ist. Isolieren Sie danach die präparierte Cochlea vom vestibulären Teil des Innenohrs.

Übertragen Sie das präparierte sensorische Epithel der Cochlea in die Basalmembran-Matrix Beschichtete Kulturvertiefung mit einem sterilen 1,5-Millimeter-Schaufel Wenn eine weitere Reinigung erforderlich ist, um zusätzliches Gewebe zu entfernen, kann dies in dieser Phase durchgeführt werden. Richten Sie dann das Cochlea-Explan mit der luminalen Oberfläche des Epithels nach oben aus. Aspirieren Sie die Basalmembranmatrix-DMEM-Lösung, um das Gewebe vorsichtig zu glätten, und geben Sie vorsichtig 150 Mikroliter frisches Nährmedium in die Schale.

Stellen Sie sicher, dass jedes x explan a gut auf dem beschichteten Glasdeckglas haftet und nicht im Nährmedium schwimmt. Übertragen Sie anschließend die mikropräparierte Cochlea vorsichtig in eine sterile 150-Millimeter-Kulturschale und legen Sie sie in einen Gewebekultur-Inkubator. 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für drei bis sechs DIV.

Nach 1D IV.Untersuchen Sie die Kultur unter einem Präpariermikroskop, um sicherzustellen, dass der Cochlea-Explan gut an der Kulturschale haftet. Inkubieren Sie die Kultur dann für den gewünschten Zeitraum in vivo, bevor Sie sie für die Immunhistochemie verarbeiten, um sie für die Elektroporation vorzubereiten. Sterilisieren Sie zunächst eine 100 Millimeter große, mit Zigarren beschichtete Glasschale, indem Sie sie autoklavieren oder etwa 20 Minuten lang in 70%igem Ethanol einweichen.

Lassen Sie es dann vor dem Gebrauch auf einer sauberen Bank an der Luft trocknen. Bereiten Sie nun die DNA aus einem Expressionsvektor Ihrer Wahl mit einem geeigneten Maxi- oder MIDI-Vorbereitungskit vor. Die in diesem Protokoll verwendeten Expressionsvektoren sind ein H-Konstrukt mit einem Ausdruck und ein neuro D-Konstrukt mit einem Expression.

Und die Endkonzentration der DNA sollte mindestens ein Mikrogramm pro Mikroliter in sterilen DNA-RNAs betragen, die frei von Wasser sind, um die DNA in den enic Cochlea-Explan zu elektrobetreiben. Geben Sie 10 Mikroliter Plasma-DNA-Lösung in eine frische, mit 100 Millimeter Zigarre überzogene Schale. Übertragen Sie dann ein vollständig präpariertes Cochlea-Explan mit der luminalen Oberfläche des Epithels nach oben in die DNA-Lösung.

Neigen Sie die Cochlea leicht, so dass sie senkrecht zur Ebene der Schale steht. Platzieren Sie dann das Paddel der negativen Elektrode in Richtung des sensorischen Epithels und das Paddel der positiven Elektrode mit dem Elektroator neben der Basis der Cochlea. Liefern Sie neun bis 10 Impulse mit einer Impulsdauer von 24 Millivolt und 30 Millisekunden.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter warmes Nährmedium in das elektrobewertete Cochlear. Wiederholen Sie die Verfahren für den gesamten Cochlea-Explan und für die DNA aller interessierenden Gene, bevor Sie die elektrobewertete Cochlea zur Beschichtung in die mit Basalmembranmatrix beschichtete Schale übertragen. Kultivieren Sie dann die gesamte elektrisch bewertete Cochlea für den gewünschten Zeitraum in einem 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator, der dann für die Immun-Zytochemie verarbeitet wird.

Diese Bilder zeigen die embryonalen Tag 13 Cochlea-Implantate aus dem Wildtyp CD one Maus Pubs, die mit einem TH one, EEG FP oder Neuro D one EGFP Reporter Konstrukten elektroporiert werden. Sie wurden immunmarkiert mit einem spezifischen Marker für Haarzellen, einem Anti-Myo-Seven-A-Marker oder einem neuronalen Marker von zwei zu eins in Rot. Die elektrobewerteten Zellen, die durch EGFP-Expression sichtbar gemacht werden können, sind in den Zellen des Großen Epithelkamms, des Kleinen Epithelkamms und des sensorischen Epithels zu sehen.

Die Neuro D one transfizierten Cochlea-Epithelzellen nach fünf DIV erwarben den neuronalen Phänotyp mit dendritischen Prozessen, von denen die meisten positiv für zwei Eins oder eine T oh H waren. Transfizierte Zellen waren positiv für myo seven. Ein Ausdruck Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden für den Intel-Liter von acht bis 10 Pops durchgeführt werden.

Dies gibt ausreichend Zeit für die Präparierkultur, die Elektroporation und die Plattierung des Explans.