Name: Intubation vermittelte Intratracheale (IMIT) Instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen Delivery System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Lernen Sie die nichtinvasive IMIT-Technik zur präzisen Bakterienapplikation in die Lunge von Mäusen. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zu Atemwegserkrankungen mit über 98%iger Rückgewinnungsrate.

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Die Autoren sind dankbar für die Unterstützung durch das Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller und Jennifer Kraenzle) und Microbiology (Daniel Cramer und Julie Sotsky) Core Facilities. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der NIH (HHSN272201000033I an M.B.L. und J.M.W.) unterstützt.

HINWEIS: Alle hier beschriebenen Verfahren wurden überprüft und von der University of Louisville Institutional Biosafety Committee (Protokoll # 13-056) und Institutional Animal Care und Use Committee (Protokoll # 13-064) zugelassen. 1. Herstellung der Farbstoff <ol><li> Verdünnter 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue in PBS und filtersterilisieren Verwendung eines 0,45 um-Spritzenfilter. </li></ol> 2. Herstellung von Pseudomonas aeruginosa Kultur <ol><li> 15 Stunden vor dem Einträufeln, impfen 3 ml Kulturbrühe mit einem einzigen Bakterienkolonie. </li><li> Die Kultur 15 h bei 37 ° C auf einem Schüttler (200 rpm). </li><li> Zentrifuge 1 ml der Kultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 12.000 × g für 30 sec. </li><li> Entfernen des Mediums und Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS. </li><li> Einen aliquoten des bakteriellen Stoffsuspension 1:10 in PBS und messen die OD 600 der verdünnten Bakteriensuspension auf die BestimmungBakterienkonzentration. </li><li> Verdünnen der Bakterienstammsuspension in PBS auf die gewünschte Konzentration der bakteriellen Impfkultur, mit einem Fördervolumen von 50 &amp; mgr; l für IMIT Inokulation. </li></ol> 3. IMIT Instillation <ol><li> Legen Sie eine Gruppe von Mäusen in Isofluran-Narkose Induktionskammer und betäuben mit einer 2 - 3% Isofluran / Sauerstoff-Gemisch. </li><li> Beim ersten Auftreten von Sedierung, scruff die Maus, die Maus aufrecht, und verwalten 10 ul einer 2% Lidocain-Lösung durch Sondennadel an der Rückseite des Halses und damit die Lösung auf der Epiglottis zu entleeren. Liefert die Maus an den Anästhesieraum. <ol><li> Warten Sie mindestens 5 Minuten, um das Lidocain erlauben volle Wirkung als Lokalanästhetikum zu nehmen. </li></ol></li><li> Bei Mäusen gewünschte Niveau der Sedierung erreicht (Atemgeschwindigkeit von ~ 60 min) und der Verringerung der Isofluran zu 2% bis Sedierung zu erhalten. </li><li> Preload Farbstoff oder Bakterieninokulum in einen 250 ul gasdichtePräzisionsspritze fit mit einem 22 G lange stumpfe Nadel. <ol><li> Zunächst erarbeiten 150 l Luft, durch die Teflon Kolben der Spritze gemessen. Als nächstes erstellen 50 ul Inokulum durch Vorschieben des Teflon Kolben aus der 150 ul Marke, die dem 200 ul Markierung auf dem Spritzenkörper. HINWEIS: Wenn die Probe in einem intubierten Maus ausgestoßen wird, wird das 50 &amp; mgr; l Suspension zuerst durch ein 150 &amp; mgr; Luftkissen, das Inokulum in der gesamten Lunge verteilt werden geliefert, gefolgt. </li></ol></li><li> Entfernen Sie eine Maus aus der Induktionskammer und lag auf dem Rücken auf einer Intubation Plattform. Sichern Sie die Maus auf die Plattform durch Einhaken seine Schneidezähne mit einem O-Ring, um Klettband befestigt und das Klettband befestigen an der Plattform. Heben Sie die Maus auf eine 45 ° Neigung. </li><li> Mit Hilfe eines Mikro Baumwolle Applikator, zurückzuziehen die Zunge mit einer rollenden Bewegung, mit der dominanten Hand. </li><li> Mit der nicht-dominanten Hand, verwenden Sie ein Operations-Otoskop fit mit einer Intubation Trichter sowohl maintain Zungenretraktion und Visualisierung der Stimmritze. </li><li> Mit der dominanten Hand, verwenden Sie ein Führungsdraht durch eine 20 G-Katheter eingeschraubt, um die Maus zu intubieren, Sitz den Katheter auf eine 10 mm Tiefe in die Maus Trachea (Katheter ist fit mit einer Silikonmanschette mit 10 mm der Katheter). Entfernen Sie das Otoskop / Spekula. </li><li> Bestätigen Sie, dass die Maus wurde korrekt durch die Sicherung der Katheter mit dem dominanten Hand, während kurz Anbringen eines Luer angeschlossenen Länge 1/16 &quot;durchsichtigen Schlauch enthält einen Farbstoff intubiert. HINWEIS: Der Farbstoff wird schnell hin und her wandern in Reaktion auf die Atmung. </li><li> Nicht mit den nachfolgenden Schritten fort, wenn eine Bestätigung der Intubation hat an dieser Stelle nicht etabliert. Wenn die Intubation fehlgeschlagen versuchten Zurücksetzen der Katheter und Führungsdraht für einen zusätzlichen Versuch Intubation. HINWEIS: Es ist nicht ratsam, mehr als zwei intubations einer Maus in einer Sitzung ohne Trauma der Maus versuchen. </li><li> Weitersichern Sie den Katheter mit dem dominanten Hand, während Sie den Präzisionsspritze / stumpfe Nadel, die die flüssige Suspension / Luftpolster. </li><li> Abgeben der Flüssigkeit / Luft direkt in die Lunge in einer einzigen fließenden Bewegung und entfernen Sie sofort die Nadel / Katheter von der Maus. </li><li> Liefert die Maus an einen Käfig und eine Wiederherstellung aus der Narkose. </li></ol> 4. Charakterisierung von IMT Liefer <ol><li> Nach IMIT Einträufeln einschläfern die Maus durch CO 2 Asphyxie zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Inokulation. </li><li> Sichern Sie die eingeschläfert Maus auf eine Dissektion Bord und genießen Sie die Brust und Bauch mit 70% EtOH mit Spritzflasche. </li><li> Wenn die Bewertung Verteilung eines Bildgebungsmittel in der gesamten Lunge, entfernen Sie die Lunge aus dem Tier mit steriler Technik und zeigt die Lunge als angemessen für die Bildgebung. HINWEIS:. Lungs können für zusätzliche histologische Färbetechniken durch geeignete Fixierung oder Kryokonservierung vorbereitet werden &lt;/ Li&gt; <li> Wenn die Beurteilung der bakteriellen Belastung von infizierten Lungengewebe, entfernen Sie die Lunge aus dem Tier mit steriler Technik. Platz Lunge in eine sterile, vorgewogen 1 Unze Probenbeutel. Weigh und nimmt das Gewicht des Probenbeutel + Lunge. <ol><li> 1 ml sterilem 1x PBS zu jeder Probe bag + Gewebe. Reseal Probenbeutel. </li><li> Homogenisieren Geweben durch sanftes Rollen einer 25 ml serologische Pipette über dem Probenbeutel + Gewebe. </li><li> Generieren serielle Verdünnungen des Lungenhomogenat in sterilem PBS und Teller auf Agar-Platte (LB, oder gegebenenfalls an die Bakterienarten untersucht): <ol><li> Führen Sie eine sechsfache serielle Verdünnung in einem U-Boden 96 Well-Platte mit Mehrkanalpipette dann Platte dreifachen Proben von Mehrkanal auf der Agarplatte. </li></ol></li><li> Inkubieren Agarplatten über Nacht bei 37 ° C und aufzuzählen koloniebildenden Einheiten des nächsten Tages. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

IMIT Einträufeln bietet wichtige Verbesserungen an bestehenden Modellen Atemwegserkrankungen in der Fähigkeit, reproduzierbar einzuflößen Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle Annäherung, die ideal für ein Team von zwei Forschern, von denen man es schafft die Logistik der Anästhesie und Käfighaltung liegt, und die andere, die das IMIT Technik führt. 3 min pro Maus - Große Studien können unter Verwendung IMIT mit einem durchschnittlichen Zeitaufwand von 2 durchgeführt werden. Da der Ansatz nutzt Isofluran als Anästhetikum, Mäuse erholen sich rasch aus der Narkose, die Verringerung der Haltungszeit der Überwachung Tiere durch Erholung. Die technisch schwierigste Aspekt der IMIT Verfahren ist der erste Schritt der Intubation Mäusen. Menschen lernen IMIT auszuführen in der Lage sind, auf diesem ersten Schritt der Platzierung des Katheters und die Gewährleistung, dass die Intubation wurde durch die visuelle Bestätigung der Farbstoffbewegung erreicht konzentrieren. Der Vorteil des Ansatzes ist, dass Lungen-specific Einträufeln wird durch die Verwendung der Bestätigung der Intubation, die das Vertrauen sowohl der neue Forscher sowie der Experte versucht den schwierigen Tier intubieren erhöht garantiert. Die wichtigsten Elemente der Optimierung der Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Intubation sind: i) Erreichung einer tiefen Sedierung, genügend Arbeitszeit zu ermöglichen, ii) die korrekte Platzierung des Trichtern in den Mund, um eine gute Visualisierung des Kehldeckels ermöglichen, iii) gute Tiefe Platzierung der Trichter, so daß die Zunge bleibt während des Verfahrens zurückgezogen wird, und iv) die Verwendung der Kipp-Plattform, um die Hände des Forschers zu unterstützen, so dass das Verfahren entspannt und mit einem stetigen Ansatz durchgeführt. Eine der Einschränkungen des IMIT Verfahren wird auf die Frequenz des IMIT Instillation Ereignissen. Aufgrund der möglichen Trauma mit einer verpassten Intubation verbunden sind, ist es nicht empfehlenswert, dass mehr als zwei Intubationsbemühungen (bis zu zwei Fehlschüsse) in einer einzigen Sitzung durchgeführt werden. IMIThat ein ausgezeichnetes Potenzial in seiner Fähigkeit verwendet werden, um Therapeutika in das murine Lungen liefern kann jedoch Therapieschemata, die Verwendung von sehr häufige Abgabe von Reagenz in die Lunge zu nicht geeignet für IMIT sein. Es ist möglich, dass IMIT konnte täglich verwendet, um Reagenzien in eine murine Lungen ohne bedeutende Trauma zu liefern, aber nur, wenn sie durch einen hochqualifizierten Forscher durchgeführt, da die Mehrheit der Trauma Intubation assoziiert ist gedacht, um mit einem verpassten Intubation Ereignis zugeordnet werden . Solche Hochfrequenz IMIT sollte mit lokalen Tierärzten und IACUC diskutiert werden. Eine zusätzliche Einschränkung des potentiellen IMIT ist die Größe der Maus, wobei intubiert wird. 22 g, bei einer 20-g-Katheter wurde gefunden, daß eine geeignete Größe für die Luftröhre von Mäusen in diesem Größenbereich sind - das oben beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung IMIT Mäusen von etwa 17 entwickelt. Größere Kathetern wurden erfolgreich in älteren Mäusen verwendet; die anfängliche Entwicklung von IMIT made Verwendung einer 18 G-Katheter in BALB / c-Mäusen, die&gt; 20 g sind. Wichtig ist, dass, wenn alternative Kathetergrößen verwendet werden, sollten stumpfen Nadeln stammen, welche das Lumen des Katheters zu passen und mit einer Länge, die gerade über die Katheterspitze 1 mm erstreckt getrimmt werden. Intubation von Mäusen kleiner als 17 g ist möglich, wird aber nicht durch die erforderliche Fachwissen empfohlen und würde die Verwendung von kleineren Kathetern und Spekula als oben beschrieben erforderlich. Wir haben IMIT für die Lieferung von mehreren Atemwegspathogene neben P. verwendet aeruginosa, einschließlich B. pseudomallei 9 und Klebsiella pneumoniae 10. Die IMIT Modell hat wichtige Fortschritte in unseren Studien von B. gemacht pseudomallei Atemwegserkrankungen, nachdem festgestellt, dass die intranasale Impfung bewirkt eine frühe, URT-Morbidität von Mäusen statt der systemischen Erkrankung Endpunkt in menschlichen Erkrankungen 9 beobachtet. B. pseudomallei ist ein Tier 1 Select Agent der Abwehr von Biowaffen Auswirkungen, und als solche, Modelle Atemwegserkrankungen werden für Aerosolexposition entwickelt, welche Modelle ein potenzieller Biodefense bezogenen Route der Eintrag für waffenKrankheitsErreger. Da aktuelle Aerosolmodelle führen zu Infektion sowohl der URT und LRT, das gleiche Potential früh Morbidität Phänotypen haben wir für die intranasale Modell von B. identifiziert pseudomallei Atemwegserkrankung kann dem Aerosol Modell anzuwenden. Eine zukünftige Anpassung der IMIT Modells könnte eine Intubation vermittelte Aerosolabgabe (IMAD), in dem Mäuse werden für die Zielaerosolabgabe nur in die Lunge intubiert werden. Mechanische Ventilatoren derzeit zur Verfügung stehen Isofluran-Narkose, die angepasst werden kann, um eine aerosolierten, anstatt auf Flüssigkeitsbasis, Erreger Herausforderung liefern zu halten. IMIT wurde zunächst als ein Ansatz entwickelt, um die Abgabe von Bakterien in der Lunge zu optimieren, sondern findet auch Anwendung für die Lieferung von anderen Reagenzien in der Mäuselunge. Als disoben diskutiert, intranasale Verabreichung von Verbindungen in Mäuse führt zu einer geringen Effizienz, sehr variable Lieferung von Reagenzien in das Zielorgan Lunge. Intranasale Verabreichung von Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung Reagenzien zu der Mäuselunge ergab eine 40% Liefereffizienz 11, während wir haben gezeigt, dass IMIT bietet eine hervorragende Alternative zu anderen Lungenliefer nähert mit&gt; 98% Liefer Wirksamkeit und multilobäre Verteilung. Diese Verbesserung in der zielgerichteten Abgabe an die Lunge hat das Potential, die Reproduzierbarkeit der therapeutischen Abgabe zur Behandlung von Lungenerkrankungen. IMIT könnte ähnlich Vorteile anbieten, um Studien über: i) die Auswirkungen von Umweltlungenreizstoffe, ii) Lungenkrebs phänotypische Studien, iii) lungenspezifischen siRNA knock-down.

Mäusen wurden verwendet, um zahlreiche menschliche Krankheitserscheinungen, einschließlich einer Vielzahl von Erkrankungen der Atemwege zu modellieren. Surrogatkrankheitsmodelle sind häufig nicht in der Lage, alle Aspekte eines modellierten Erkrankung rekapitulieren, typischerweise aufgrund von wichtigen physiologischen oder Immun Unterschiede in den beiden Aufnahmemodelle. Somit ist ein Ziel der Verbesserung der Modellsysteme, um Ansätze, die Surrogate, enger spiegeln einen Krankheitsprozess oder Gastgeber Antwort als in der ursprünglichen Host-System beobachtet ermöglichen zu entwickeln. Es gibt mehrere wichtige physiologische Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen in der Mechanismus, durch den sie Luft zu begeistern. In diesen Unterschieden gehören bedeutende ratiometrische Größenunterschiede zwischen den URT und LRT. Es wurde geschätzt, dass Mäuse besitzen&gt; 100 die URT Fläche bezogen auf den Menschen, normalisiert gegen totale Lungenkapazität 1,2 falten. Somit werden die Nasenmuscheln der Maus ermöglichen eine umfangreiche Filterung von eingeatmeten Luft, um eine viel größere Geschwindigkeit von breathi erleichternng, die einen erheblichen Einfluss auf Untersuchungen der Lungenentzündung aufweisen kann, wenn eine Infektion der Nasenhöhle spielt eine bedeutende Rolle bei der Progression der Erkrankung. Es wurden verschiedene Ansätze verwendet, um Bakterien in den Lungen von Mäusen vermitteln, um menschenähnliche Atemwegserkrankungen zu untersuchen. Die häufigste dieser Ansätze ist die intranasale Impfung, bei dem eine flüssige Suspension wird auf einer oder beiden Nasenlöchern einer Maus aufgetragen. Während relativ einfach, Vorbehalte wie Einträufeln Volumen und Art der Anästhesie verwendet wird, kann die Effizienz der Instillation über intranasale Impfung 3-5 in die LRT auswirken. Insbesondere Miller et al. haben gezeigt, dass die intranasale Applikation von Francisella tularensis in Mengen von weniger als 50 &amp; mgr; l nicht in dem Einträufeln der Bakterien führen in die LRT 6 gezeigt. Sie weiterhin beobachtet besser LRT Instillation bei Verwendung inhalativen Isofluran im Gegensatz zu injiziert Ketamin / Xylazin für Anästhesie. Aber unsere experience mit Yersinia pestis intranasale Impfung zeigt konsequenter Impfung kann mit Ketamin / Xylazin erreicht im Vergleich zu Isofluran (MBL, unveröffentlichte Daten) werden. Diese Unterschiede könnten zurückzuführen verwendet Erreger oder bei Laborverfahren Vielfalt, aber wichtiger ist unterstreichen das Potenzial Variabilität in dieser Technik. Weiterhin Lungen kurz nach intranasaler Instillation zeigen, daß ein relativ geringer Prozentsatz der ursprünglichen bakteriellen Inokulums die Lunge erreicht geerntet (in dem Fall von Y. pestis, wurden nur 10% zurückgewonnen 1 h nach der Instillation 7), was darauf hindeutet, dass eine große Anzahl von Bakterien konnte in der URT beibehalten werden (oder in den GI-Trakt Verschlucken). In bestimmten Krankheitsmodellen kann dies signifikante Ablagerung von Bakterien auf der Schleimhaut URT unser Verständnis des Fortschreitens der Krankheit zu verwechseln, wenn der Organismus in der Lage, die Kolonisierung der murine Nasenhöhle in einer Weise, die dem menschlichen Krankheit ist. Zum Beispiel unter Verwendung von in vivo &lt;/ Em&gt; Bildgebung, wurde beobachtet, dass Burkholderia pseudomallei, die den menschlichen URT nicht besiedeln wird, bewirkt eine überwiegende opportunistische Infektion der Nasenhöhle, wenn murine die intranasale Instillation Methode 8 geliefert. Andere Verfahren zum Einträufeln Bakterien in den Lungen der Mäuse wurden auch in Infektionsforschung eingesetzt. Im Vergleich zu intranasale Instillation diese Methoden neigen jedoch dazu, mehr technisches Know-how und / oder teure Ausrüstung, ohne die Beseitigung der Potenzial für Infektion Einleitung an mehreren Standorten (zB Aerosol [URT und LRT] erfordern; transorale [Verdauungstrakt und LRT]; und chirurgische intratracheale [LRT und Blutstrom]). Angesichts der möglichen Komplikationen, die mit sekundären Standorten der Infektion in Verbindung gebracht werden konnte, haben wir versucht, eine intratracheale Ansatz, der die URT umgeht und liefert Erreger direkt in die Lunge von betäubten Mäusen zu entwickeln, sondern begrenzt auch unbeabsichtigte inoculatIon in den Blutstrom oder GI-Trakt. Zu diesem Zweck wurde Intubation vermittelte intratracheal (IMIT) Instillation als nicht-chirurgischen Verfahren, LRT Instillation Inokulum gewährleistet, indem ein Zwischenschritt zur richtigen Platzierung des Katheters vor dem Einträufeln überprüfen entwickelt. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von Farbstoff-Instillation beschrieben visuell nachweisen breite Verteilung des Inokulums in der gesamten Lunge und P. aeruginosa Einträufeln in das hochwirksame Lieferung (&gt; 98% des Inokulums) dieses Verfahrens in die Lunge nachzuweisen. Wichtig ist, während ursprünglich für bakterielle Liefer entwickelt, bietet IMIT auch ein wirksames Instrument für: i) Instillation verschiedener Moleküle für die Untersuchung von anderen Krankheitsmodellen Atem, ii) lungenspezifischen therapeutischen Lieferung und iii) Grundlungenfunktion Studien, einschließlich gezielter siRNA in die Lunge.

<table><tbody><tr><td>Nagetier, Kippbar WorkStand</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>Sockel sollte bei Arbeiten in einem BSC abgenommen werden</td></tr><tr><td>Betriebs-Otoskop</td><td>Kopf Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Otoskop 3,5 V Li Batterie</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>Maus Intubation Spekula kurz, autoklavierbar</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>Schneidezahnschlaufen</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A</td><td></td></tr><tr><td>Applikator aus Baumwolle mit feiner Spitze</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&nbsp;</td><td>Wird für das Zurückziehen der Zunge verwendet</td></tr><tr><td>I.V. Katheter, 20 g</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>Optional: Setzen Sie eine Silikonhülle mit 10 mm freiliegender Katheteroberfläche ein</td></tr><tr><td>Gasdichte Spritze, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td><td>Wird für die Verabreichung des flüssigen Inokulums mit IMIT</td></tr><tr><td>Stumpfe Nadel verwendet, 22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>Auf Länge kürzen, um 1 mm aus dem 20 G Katheter herauszuragen</td></tr><tr><td>Führungsdraht (Glasfaserdraht, 0,5 mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>Auf 6" Länge geschnitten: wird als Führungsdraht für die Intubation</td></tr><tr><td>verwendet Tuberkulin-Spritze, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>Konfektionieren Sie mit Glasfaserdraht als Führungsdraht</td></tr><tr><td>Brilliant Blue R (Coomassie)</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tygon-Schlauch, 1/16"</td> <td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Männlicher Luer 1/16" Widerhaken</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>Weiblicher Luer 1/16" Widerhaken</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>Lidocain, USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>pH Lidocain in Lösung bei 2% (w/v) pH7,0</td></tr><tr><td>Probenbeutel, 1 oz</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>U-Boden 96 Well-Platte, steril</td><td>Greiner</td><td>650161</td><td></td></tr></tbody></table>

intubation vermittelte intratracheale (imit) instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen delivery system

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Atemwegserkrankungen Studien beinhalten typischerweise die Verwendung von murinen Modellen als Ersatzsysteme. Es gibt jedoch signifikante physiologische Unterschiede zwischen dem murinen und menschlichen Atemwege, insbesondere in ihren oberen Atemwege (URT). In einigen Modellen können diese Unterschiede in der murinen Nasenhöhle einen signifikanten Einfluss auf den Krankheitsverlauf und die Darstellung in der unteren Atemwege (LRT) haben bei Verwendung intranasale Instillation Techniken, die Nützlichkeit der Mausmodell limitierender um diese Krankheiten zu untersuchen. Aus diesen Gründen wäre es vorteilhaft, ein Verfahren, um Bakterien direkt in den Mäuselungen um LRT Erkrankung in Abwesenheit der Beteiligung des URT studieren vermitteln zu entwickeln. Wir haben diesen Lungen bestimmte Liefer Technik Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation bezeichnet. Dieses nichtinvasive Technik minimiert das Potential zur Instillation in die Blutbahn, die während invasiver Servier auftreten kannonal chirurgischen intratrachealer Infektion Ansätze, und begrenzt die Möglichkeit der zufälligen Verdauungstrakt Lieferung. IMIT ist ein zweistufiges Verfahren, bei dem Mäuse werden zunächst intubiert, mit einem Zwischenschritt, um die korrekte Platzierung des Katheters in der Luftröhre zu gewährleisten, gefolgt von Einführen einer stumpfen Nadel in den Katheter zur direkten Abgabe von Bakterien in den Lungen zu vermitteln. Dieser Ansatz ermöglicht eine&gt; 98% Wirksamkeit der Zustellung in die Lunge mit hervorragenden Verteilung der Reagenzien in der gesamten Lunge. Somit stellt IMIT einen neuartigen Ansatz zur LRT Krankheit und therapeutische Abgabe direkt in die Lunge zu untersuchen, die Verbesserung bei der Fähigkeit, Mäuse als Surrogate für die menschliche Atemwegserkrankung zu untersuchen verwenden. Darüber hinaus macht die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit dieses Abgabesystem es auch zugänglich Good Laboratory Practice Standards (GLPS), sowie die Lieferung von einer Vielzahl von Reagenzien, die hohe Effizienz in der Lunge erforderlich.

Um die Verteilung des Materials über die instilliert IMIT Verfahren zu visualisieren, wurden 50 ul 0,1% Coomassie Brilliant Blue-Farbstoff in die Lungen eines anästhesierten Maus eingeimpft. Die Maus wurde sofort getötet und die Lungen wurden durch sterile Nekropsie entnommen. 1 zeigt, dass der Farbstoff zu allen Lappen der Lunge zugeführt. Um die Menge der Bakterien in die Lunge über den IMIT Verfahren geliefert, drei Gruppen von Mäusen (n = 3) wurden mit drei verschiedenen Konzentrationen von P. eingeflößt bestimmen, aeruginosa (1,21 x 10 8, 1.21x10 7, und 1,21 x 10 6 koloniebildenden Einheiten [CFU] pro 50 ul). Unmittelbar nach IMIT Instillation wurden die Mäuse getötet, die Lungen entfernt und Bakterienzahlen wurden gezählt und auf die Impfkulturen (2) verglichen. Lieferung des Inokulums ist hoch effizient mittels diesem Verfahren bei&gt; 98% des Inokulums von den Lungen zurückgewonnen von eingeflößtTiere. Weiterhin wurde IMIT Instillation unabhängig von der Konzentration des Inokulums (R 2 = 0,9951) hoch reproduzierbar. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: IMIT Instillation verteilt Inokulum in den Lungen von Lungen von Mäusen, die mit 50 ul 0,1% Coomassie Brilliant Blue zeigen blaue Farbstoff in allen Lappen verteilt tropft.. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> Abbildung 2:. IMIT Einträufeln von Bakterien in die Lungen Mäuse wurden mit P. eingeflößt aeruginosa und die Anzahl der Bakterien in die Lunge eingeträufelt (Log 10 CFU - gewonnen) wurden auf die geschätzte Inokulum Vergleich (Log 10 CFU - geliefert). Jeder Kreis stellt die CFU / Lunge eines einzelnen Maus (n = 3 für jedeBakteriendosis).

Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation von Reagenzien ist ein ausgezeichnetes, nicht-invasive Methode zur Untersuchung Atemwegserkrankungen, sowie ein Verfahren zum Einträufeln therapeutische Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle und hoch reproduzierbare Methode, die sich für vorklinische Tests ist.

Intubation vermittelte Intratracheale (IMIT) Instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Bakterien nicht-invasiv direkt in die Lunge von Mäusen zu bringen. Dazu wird zunächst ein 150-Mikroliter-Luftkissen in eine gasdichte Spritze geladen, gefolgt von 50 Mikrolitern der vorbereiteten Bakteriensuspension. Im zweiten Schritt wird eine anästhesierte Maus mit einem 20-Gauge-Katheter intubiert, wobei ein Führungsdraht verwendet wird, um die Platzierung zu unterstützen.Nachdem der Erfolg der Intubation mit einem einfachen Durchflussmesser bestätigt wurde, wird das bakterielle Inokulum mit einer 22 Gauge langen stumpfen Nadel durch den Katheter direkt in die Lunge eingeführt. Letztendlich kann die Intubations-vermittelte intratracheale oder weggelassene Inokulation verwendet werden, um Erkrankungen der unteren Atemwege bei Mäusen zu untersuchen, wobei die gleichzeitige Beteiligung der oberen Atemwege vermieden wird. Der Hauptvorteil von imit gegenüber internen Inokulationsmethoden besteht darin, dass diese Technik eine genaue und reproduzierbare Abgabe eines Inokulums direkt in die Lunge ermöglicht.Da es sich bei der IIT um eine nicht-chirurgische Technik handelt, reduziert sie auch das Potenzial für Komplikationen, die mit chirurgischen intratrachealen Eingriffen verbunden sind. Obwohl diese Methode einen zuverlässigen Mechanismus zur Abgabe von Bakterien in die Lunge zur Untersuchung der Pathogenese bieten kann, kann IMA auch auf die Verabreichung anderer Reagenzien angewendet werden, wie z. B. Umweltstoffe zur Untersuchung von Lungenschäden, die gezielte Verabreichung von Therapeutika zur Behandlung und die Verabreichung von bildgebenden Sonden oder SRNA zur Untersuchung der grundlegenden Lungenbiologie. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit dem Intubationsschritt, da der Schritt eine sorgfältige Positionierung des Tieres und das automatische Zielfernrohr für das Einführen des Führungsdrahts erfordert.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da die anfängliche Platzierung des Führungsdrahts in der Luftröhre für neue Forscher konzeptionell schwer zu beschreiben ist. 15 Stunden vor der Installation werden drei Milliliter Bouillonkultur mit einer einzigen Bakterienkolonie geimpft und die Kultur bei 37 Grad Celsius und einem Shaker bei 200 U/min gezüchtet. Nach 15 Stunden schleudern Sie einen Milliliter der Zellen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und suspendieren Sie den Gaumen wieder in einem Milliliter PBS.Messen Sie anschließend eine Verdünnung der Bakterienstammsuspension von eins bis 10 bei einem OD 600, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen. Verdünnen Sie dann die Bakterienzellen in PBS auf die gewünschte Bakterienkonzentration pro 50 Mikroliter Inokulum. Für die IIT-Installation werden Mäuse auf die IIT vorbereitet, indem einer leicht anästhesierten Maus eine 2%ige Lidocainlösung mit Sondennadelmäusen verabreicht wird.Eine Rückkehr zur Narkose, während das Lidocain wirkt. Ziehen Sie nun 150 Mikroliter Luft in eine 250-Mikroliter-Gasaufhebungsspritze, die mit einer 22 Gauge langen stumpfen Nadel ausgestattet ist. Schieben Sie dann den Teflonkolben von der 150-Mikroliter-Markierung auf die 200-Mikroliter-Markierung auf dem Spritzenkörper vor, um beim Laden der Spritze 50 Mikroliter des bakteriellen Inokulums aufzusaugen.LA, eine sedierte Maus, die auf einer Intubationsplattform sitzt und das Tier an den Schneidezähnen an einem Ring sichert, der an einem Velcro-Streifen befestigt ist, der mit der Plattform verbunden ist. Heben Sie die Maus auf eine Neigung von 45 Grad an und ziehen Sie dann mit einem Mikro-Baumwollapplikator die Zunge mit einer rollenden Bewegung mit der dominanten Hand zurück. Verwenden Sie als nächstes mit der nicht-dominanten Hand ein Operationsotoskop mit einem Intubationsspiegel, um sowohl die Zungenretraktion aufrechtzuerhalten als auch die Epiglottis sichtbar zu machen.Halten Sie dann einen Führungsdraht, der durch einen 20-Gauge-Katheter gefädelt ist, in die dominante Hand, intubieren Sie die Maus bis zu einer Tiefe von 10 Millimetern in der Luftröhre und entfernen Sie das Otoskop. Befestigen Sie den Katheter mit der nicht dominanten Hand. Befestigen Sie dann kurz eine mit dem Köder verbundene Länge eines 16. durchsichtigen Schlauchs, der einen farbigen Farbstoff enthält, am Katheter.Der Farbstoff sollte als Reaktion auf die Atmung des Tieres schnell hin und her wandern, wenn das Tier erfolgreich intubiert wurde. Führen Sie die stumpfe 22-Gauge-Nadel in den Katheter ein und geben Sie das Inokulum in einer einzigen Flüssigkeitsbewegung direkt in die Lunge ab. Entfernen Sie dann sofort die Nadel und den Katheter vom Tier und bringen Sie die Maus unter Überwachung in ihren Käfig zurück, bis sich das Tier vollständig von der Narkose erholt hat.Um die bakterielle Belastung durch das infizierte Lungengewebe zu bewerten, entfernen Sie die Lunge mit steriler Technik und legen Sie das Gewebe in einen sterilen, vorgewogenen Probenbeutel von einer Unze. Geben Sie nach dem Wiegen des Probenbeutels und der Lunge einen Milliliter steriles PBS in das Gewebe und verkaufen Sie den Probenbeutel weiter. Rollen Sie dann vorsichtig eine 25-Milliliter-Serologiepipette über den Probenbeutel, um das Gewebe zu homogenisieren.Entfernen Sie das verbundene Gewebe durch einen sterilen Polyester-Wandschichtfilter und behandeln Sie das Homogenat mit Tritton X 100 in einer Endkonzentration von 1 %, um die Bakterien freizusetzen. Verwenden Sie anschließend eine Mehrkanalpipette, um eine sechsfache serielle Verdünnung des Homogenats in einer UBO 96-Well-Platte durchzuführen. Verwenden Sie dann einen Mehrkanal mit acht Vertiefungen, um das Homogenat dreifach mit 10 Mikrolitern Aliquoten auf eine LBA-Agarplatte zu plattieren.Zum Schluss inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius und zählen am nächsten Tag die koloniebildenden Einheiten auf. Die Abgabe der Bakterien ist bei dieser Methode hocheffizient, wobei über 98% des Pseudomonas aerogen-Inokulums aus der Lunge der in diesem repräsentativen Experiment eingeträufelten Tiere gewonnen werden. Darüber hinaus ist die IIT-Installation unabhängig von der Konzentration des verabreichten Inokulums in hohem Maße reproduzierbar.Um die Verteilung des instillierten Materials über die IIT-Methode zu visualisieren, können 50 Mikroliter 0,1%iger Kumasi Brilliant Blue Farbstoff in die Lunge abgegeben werden, wie gerade für das Inokulum demonstriert. Beachten Sie, dass die Verteilung des Farbstoffs auf alle Lungenlappen einmal beherrscht ist. Diese Methode kann mit einem Team von zwei Forschern in einer durchschnittlichen Zeit von zwei bis drei Minuten schnell durchgeführt werden, einschließlich Anästhesie, IMA-Impfung und Erholung von der Narkose.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, nicht mehr als zwei fehlgeschlagene Versuche zu unternehmen, die Maus zu intubieren. Eine fehlgeschlagene Intubation kann zu einem möglichen Trauma führen, wenn der Katheter in die Speiseröhre und nicht in die Luftröhre eingeführt wird. Viele Krankheitserreger der Atemwege, einschließlich solcher, die ein ABS L 3-Containment erfordern, können von imed effektiv abgegeben werden, da dieses Verfahren durchgeführt werden kann, wie in Sicherheitswerkbänken und zusätzlich von Forschern mit vollständigem Atemschutz einschließlich eines Gesichtsschutzes gezeigt wird.Wir haben gezeigt, dass imit eine sehr genaue und effiziente Methode für die direkte Verabreichung von Materialien in die Lunge von Mäusen ist. Aufgrund dieser Eigenschaften eignet sich imit gut für GLP-Typstudien, die hochgradig reproduzierbare Modellsysteme erfordern.

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