Name: TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung von Neurotransmitter-Vesikel-Dynamiken in Neuroblastomzellen mittels pH-sensitiver GFP-Sonden und TIRFM. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen synaptischer Prozesse.

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Die Autoren bedanken sich bei der Università degli Studi di Milano für die Unterstützung von Eliana Di Cairano (Post-Doktorandenstipendium) und Stefania Moretti (Promotionsstipendium) bestätigen. Diese Arbeit wurde von der University Research Program PUR zu CP unterstützt Wir möchten Prof. Jeremy M. Henley, School of Biochemistry, University of Bristol, Großbritannien, danke ich für das pHluorin bauen und Dr. Francesco Dotti für die Unterstützung bei der Datenanalyse und Silvia Marsicano für die technische Unterstützung.

1. Zellkultur und Transfektion <ol><li> SH-SY5Y-Zellkultur HINWEIS: Die Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung der humanen Neuroblastom-SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y-Zellen zu wachsen als eine Mischung von Floating-Cluster und adhärenten Zellen. Folgen Sie den Anweisungen im Protokoll (Zelldichte, Teilungsverhältnis, etc.) Berichtet, dass Zellen, die fest mit Glasabdeckung, die entscheidend für TIRFM ist angebracht wachsen. <ol><li> Vor dem Start unter laminaren Strömungs Biosicherheit, Kosmetik die gelegene Volumen sterilen Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) und Kulturmedium. <ol><li> Make 50 ml PBS mit Konzentrationen von 150 mM NaCl, 24 mM Phosphatpuffer, pH 7,4. Faltenfilter filtrieren. </li><li> Make 50 ml Zellmedium von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose, 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml), L-Glutamin ( 2 mM) undNatriumpyruvat (1 mM). Faltenfilter filtrieren. </li></ol></li><li> Komplett ausbauen Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit 3 ml PBS. </li><li> Inkubieren Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (6 cm Petrischale) für 5 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und nehmen Zellen mittels Pipette. </li><li> Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 2 ml DMEM und sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, 1 ml DMEM zum Pellet pipettieren und die Lösung auf und ab, um genügend Zellen in eine Einzelzellsuspension zu zerstreuen. </li><li> Splitten 1: 4 in einem neuen 6 cm Durchmesser Petrischale mit 3 ml Komplettmedium. Aufrechterhaltung von Zellen in Kultur in 6 cm Durchmesser Petrischalen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Subkultur einmal pro Woche oder wenn sie 80 abgedeckt - 90% der Fläche. </li></ol></li><li> SH-SY5Y Zellen Beschichtung für die Bildgebung <ol><li> Für TIRFM Experimenten PlatteZellen auf Glasabdeckungen. Beschäftigen Glasabdeckungen mit 0,17 ± 0,005 mm Dicke und einer 1,5255 ± 0,00015 Brechungsindex. Bevor Sie beginnen, bereiten Sie die Deckgläser wie folgt: <ol><li> Saubere Glasabdeckungen mit 90% Ethanol, O / N. </li><li> Gründlich sie in destilliertem Wasser (drei Änderungen destilliertes Wasser). Chemische Glasabdeckungen in einem Trockenschrank. </li><li> Platz erstreckt sich in Petrischalen aus Glas und sterilisieren im vorgeheizten Backofen bei 200 ° C für 3 Stunden. </li></ol></li><li> Der Tag vor der Transfektion, legen jedes Deckglas in einem 3,5 cm Petrischale, 1 ml Kulturmedium und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator. </li><li> Trypsinieren Zellen wie in den Schritten 1.1.3 beschrieben - 1.1.5 Aussetzung des Zellpellets in 1 ml Vollmedium und zu zählen. Berechnen Sie das richtige Volumen der Zellsuspension in zu jeder Petrischale hinzufügen, um 3 x 10 5 Zellen / Vertiefung. Optimale Bedingungen für Zellwachstum und effiziente Transfektion wird diese Dichte erforderlich. Bei 37 ° Cin einer 5% CO 2 -Inkubator O / N. </li></ol></li><li> SH-SY5Ytransfection von Polyethylenimin (PEI) ANMERKUNG: Um synaptischen Vesikeln Dynamik visualisieren pCB6-Vektor, der synapto-pHluorin verwendet. Die synapto-pHluorin durch Fusion im Leseraster mit einem pH-empfindlichen Variante des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 16 und der Vesikelmembran Synaptobrevin 2. Das Konstrukt wurde ausgiebig verwendet, um synaptische Vesikel Eigenschaften innerhalb Neuronen 9 untersuchen erzeugt. <ol><li> Vor dem Beginn der Transfektion machen 10 ml der folgenden Lösungen. Bewahren Sie die Lösungen maximale als 1 Monat. <ol><li> Machen Sie eine 150 mM NaCl-Lösung. Einstellen auf pH 5,5 mit 0,01 N HCl. </li><li> Machen Sie eine PEI-Lösung bei 10% Polyethylenimin (PEI, 25 kDa linear) in 150 mM NaCl-Lösung. Der pH der Lösung steigt auf 8,8. Einstellen des pH auf 7,8 mit 0,01 N HCl. </li></ol></li><li> 24 h nach der Beschichtung, entfernen Sie das Medium und erfrischen mit 1,5 mlVollmedium. Halten der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Unter laminaren Strömungs Biosicherheit Schrank in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, werden 3 ug Plasmid-DNA zu 25 &amp; mgr; l von 150 mM NaCl-Lösung und 100 ul der PEI-Lösung pro 3,5 cm-Petrischale. </li><li> Vortex für 10 sec, dann Inkubieren der DNA / PEI-Mischung für 30 min bei RT. </li><li> Die DNA / PEI Mischung Vorsichtig in die Petrischale mit Deckgläser mit den Zellen und schütteln, um das Reagenz gleichmäßig verteilt in der Petrischale. </li><li> Nach 4 Stunden ändern das Medium und Inkubation der Zellen O / N bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator. Führen Imaging Experimente 24-48 h nach der Transfektion. </li></ol></li></ol> 2. Cell Imaging von Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) <ol><li> Imaging-Setup <ol><li> Führen TIRF Bilderzeugung mit der in Figur 1 beschriebenen Aufbau. Es umfasst eine motorisierte invertiertenMikroskop (Figur 1, Einschub A), die Laserquelle (Figur 1, Einschub B) und der TIRF-Schieber (Figur 1, Einschub C). Erreichen Sie TIRFM Beleuchtung durch eine hohe numerische Apertur (NA 1,45 Alpha Plan-Fluar) 100X Öl, Immersionsobjektiv. </li><li> Für TIRFM Beleuchtung, verwenden ein mit mehreren Leitungen (458/488/514 nm) 100 mW Argonionenlaser. Verwendung eines Monomode-Faser, führen das linear polarisierte Laserlicht in den Strahlengang, über den TIRF-Schieber. Legen Sie die TIRF-Schieber in die Leuchtfeldblendenebene des reflektierten Lichtstrahlengang. <ol><li> Für Weitfeldbeleuchtung, schließen Sie das Mikroskop mit einer herkömmlichen Quecksilber-Kurzbogenlampe HBO weißes Licht. Eine polarisationserhaltende Doppelprisma in dem Schieber sichert die gleichzeitige Kombination TIRF Beleuchtung und weißem Licht. </li></ol></li><li> Filtern Sie das Laserlicht mit einem Anregungsfilter (Bandbreite 488/10 nm) auf einer Filterscheibe, in den Laserpfad eingeführt montiert. Beschäftigeneine hohe Geschwindigkeit, softwaregesteuerte, Auslöser, um eine schnelle Regelung der Laserbeleuchtung ermöglichen. Für pHluorin Analyse, montieren ein Bandpass 525/50 nm Emissionsfilter. Digitalbilder (512 x 512 Bildpunkte) auf einer gekühlten Schnelle CCD-Kamera mit der Bild ProPlus Software. </li></ol></li><li> Das Erreichen TIRF-Beleuchtung (Bild 2) <ol><li> Schalten Sie den Laser, der Computer, die Kamera, das Filterrad und die Shutter-Controller; Dann warten Sie 20 Minuten vor dem Start des Experiments als die Laser benötigen, um sich aufzuwärmen und zu stabilisieren. </li><li> Vor Bildgebung, machen die günstigen Volumen der folgenden Lösungen. <ol><li> Make 50 ml Krebs (KRH) Lösung bei 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) (gepuffert pH 7,4), 2 mM CaCl 2, und 6 mM Glucose. </li><li> Make 10 ml KCl-KRH-Lösung (pH 7,4) bei 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (pH 7,4 gepuffert), 2 mM CaCl 2, und 6 mM Glucose. </li></ol></li><li> Glasabdeckung mit transfizierten Zellen und setzen Sie sie in das entsprechende Imaging-Kammer. Setzen Sie die Kammer und fügen Sie 500 ul von KRH-Lösung in der Mitte des Glases. </li><li> Öl hinzufügen über das Ziel. Legen Sie die Imaging-Kammer auf der Bühne des Mikroskops und positionieren Sie das Ziel unter dem Deckglas. Positionieren Sie die Schutzabdeckung über der Probe. </li><li> Im Epifluoreszenz-Modus, den Schwerpunkt auf das Deckglas (obere Oberfläche), und wählen Sie transfizierten Zellen in der Kammer Zentrums. Markieren Sie die Zellen, deren Fluoreszenzsignal eindeutig mit einer Belichtungszeit von unter 80 ms aufgezeichnet. </li><li> Unter Software-Steuerung, um TIRF-Beleuchtung schaltet in den Live-Modus. </li><li> Um die TIRF-Konfiguration eingestellt, überprüfen Sie die Position des Strahls, der aus dem Objektiv austritt, auf der Probenabdeckung (2B). Wenn der Strahl in der Mitte des T positionierter Objektivlinse (2A, links), ist ein Ort in der Mitte des TIRF Probenabdeckung sichtbar (2B, links) und die Zelle in Epifluoreszenz-Modus abgebildet (mehrere Fokusebenen, hohe Hintergrundfluoreszenz, 2C, links) . </li><li> Um den Grenzwinkel zu erreichen, bewegen Sie den fokussierten Punkt in Y-Richtung (vorwärts oder rückwärts; 2B, Mitte) mit dem Winkel Einstellschraube am TIRF-Schieber (Abbildung 1C). Wenn der Strahl konvergiert auf der Probenebene in einem Winkel größer als dem kritischen Winkel (2A, rechts), der Punkt verschwindet, und eine gerade, dünne, konzentriert Linie zeigt sich in der Mitte der Probenabdeckung (2B, rechts). </li><li> Zur Feinabstimmung der TIRF Winkels verwenden Sie den Zellprobe (2C). Beobachten der Fluoreszenzbild auf dem Video, in diesem Stadium, ist ein Epifluoreszenz ähnliches Bild immer noch sichtbar. Sanft, bewegen Sie die Schraube bis TIRF conBedingung erzielt: nur eine optische Ebene der Zelle im Fokus ist (dh der Plasmamembran in Kontakt mit dem Deckglas), führt dies zu einem flachen Bild mit hohem Kontrast (2C, rechts). </li></ol></li><li> Probenabbildung <ol><li> Stellen Sie den Single-Channel-Zeitraffer-Experiment. Zur Minimierung Bleichen, erfassen Sie das Bild mit niedrigen Belichtungszeit und hoher Verstärkung. Entsprechende Belichtungszeiten zwischen 40 bis 80 ms. Erwerben Sie Bilder mit einem 1 - 2 Hz Abtastfrequenz. Vesikel Kinetik besser gewürdigt Abtastung mit höherer Frequenz (10 Hz) sein. Die regelmäßige Zeit der Beobachtung ist in der Regel 2 min. </li><li> Fügen Sie 500 ul von KRH-Lösung und Rekordzellen in TIRFM Modus. Dies ist der Ruhezustand. Speichern Sie die Zeit aufeinander folgenden Bildern. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der gleichen Zelle und Rekord unter den gleichen Bedingungen von ruhenden (Laserleistung, Belichtungszeit, Rahmennummer). Nach fünf Bilder, fügen Sie 500 ul von KCl-KRH-Lösung und halten KCl in der Kammer.Dies ist der stimulierte Zustand; speichern Sie die Zeit aufeinander folgenden Bildern. </li></ol></li></ol> 3. Bildanalyse und Datenverarbeitung ANMERKUNG: Um Bilder zu analysieren, haben Makros im Labor entwickelt wurde, die auf bestehenden Funktionen der Bildanalyse-Software; ähnliche Makros sind online verfügbar (URL in der Tabelle der Materialien und Geräte zur Verfügung gestellt). <ol><li> Die Fluoreszenzintensität quantifiziert <ol><li> Verwenden Sie ein &quot;Sequence Fluoreszenzintensität&quot; Makro für Fluoreszenzintensität Quantifizierung in einer Region of Interest (ROI) des Bildes, im Laufe des Films. </li><li> Öffnen Sie die zeitlich aufeinanderfolgenden Bildern. Zum Makro-Menü und wählen Sie &quot;Sequence Fluoreszenzintensität. Im Fenster &quot;Analyse&quot; wird &quot;wählen Sie den ROI&quot;. </li><li> Wählen Sie eine der Auswahlwerkzeuge im Menü, um die ROI erstellen. Platzieren 3 ROIs in Bereichen der Zellmembran ohne Flecken (Hintergrund ROI). Beschäftigen this &quot;Hintergrund ROI&quot;, um das Bleichen zu bewerten und die Schwelle für die Fusion Ereignisanalyse (3A) eingestellt. </li></ol></li><li> Photobleichen Korrektur und Schwellenwertbestimmung (3B) <ol><li> Um das Ausbleichen zu bewerten, öffnen Sie die Fluoreszenzintensität Reihen &quot;Hintergrund ROIs&quot; (Abbildung 3Ba). Normalisieren der Fluoreszenzintensitätswerte in jedem Rahmen in die Ausgangsintensitätswert (F0) (F / F0) (Abbildung 3Bb). Der Mittelwert der Werte. </li><li> Markieren Sie die Durchschnittswerte und erstellen Sie ein Liniendiagramm mit den Diagrammmenüoptionen. </li><li> Aus der Datenanalyse-Menü wählen Sie &quot;Trendlinie&quot;, um den Plot-Analyse Dialog zu öffnen. Wählen Sie die Art der Regression. Stellen Sie &quot;exponentiellen&quot; Regression. Wählen Sie dann &quot;Display Gleichung auf Diagramm&quot;. Im Grafik-Fenster, erscheint das Exponentialgleichung und die Parameterwerte werden automatisch zugewiesen, (Abbildung 3Bc </strong&gt;). </li><li> Anwenden des exponentiellen Korrektur der Intensitätswerte in jedem Rahmen wie folgt: Fn (korrigiert) = Fn / exp (n * a) Fn = experimentellen Fluoreszenzintensität gemessen am Rahmen n; n = Anzahl der Rahmen; a = Bleichfaktor (Konstante der Rate der Intensitätsverlust durch Photobleaching zum Ausdruck bringen; &#160; Abbildung 3Bd). </li><li> Um den Grenzwert einzustellen, öffnen Sie eine normierte und korrigiert &quot;Hintergrund ROI&quot;, Berechnung der durchschnittlichen Fluoreszenzsignal und dessen Standardabweichung (SD). Der Mittelwert plus 3 SD stellt die Schwelle (Abbildung 3BE). Verwenden Sie diese Schwelle für die Datenanalyse. </li></ol></li><li> Auswahl der Fusionsereignisse mit einem halbautomatischen Verfahren <ol><li> Öffnen Sie die zeitlich aufeinanderfolgenden Bildern mit Bildanalyse-Software. Tragen Sie eine Gauß-Filter auf den aktiven Bildsequenz. </li><li> Analysieren Sie Bilder mit der &quot;Zählen von Objekten&quot; oder ein Makro, das die Auswahl erlaubteines Objekts, dessen Bildpunkte haben mittlere Fluoreszenz-Intensität in einem definierten Bereich. Stellen Sie die Intensität Bereich manuell mit Hilfe der Schwellenwertfunktion (gehen Sie auf die Bar-Menü, zu setzen Maßnahme → Schwelle den Bereich von Interesse hervorheben). Eine angemessene Schwelle von 30% gegenüber dem lokalen fluoreszierenden Hintergrundsignal. </li><li> Anwenden eines Makros &quot;Filter-Objekte&quot;, um nur die Objekte, die die folgenden Kriterien aus: <ol><li> Bewerben Bereiche Option (min und max einschließlich) für Aspekt. Aspekt berichtet das Verhältnis zwischen der Hauptachse und der Nebenachse der Ellipse entspricht dem Objekt. Aspect ist immer ≥1. Angemessene Werte min = 1, max = 3. </li><li> Bewerben Bereiche für Durchmesser. Durchmesser zeigt die durchschnittliche Länge der Durchmesser gemessen bei zwei Grad-Intervallen Verbinden von zwei Konturpunkte und durch den Schwerpunkt des Gegenstandes. Stellen Sie den Bereich in Pixel (oder um, wenn mit einem kalibrierten System). </li><li> Definieren Sie die optimale Reichweite in preliminary Experimente: Wählen Sie manuell die Punkte von Interesse und messen ihrem Durchmesser mit dem Grundstück Profilfunktion. </li></ol></li><li> Wählen Sie &quot;Anzeigeobjekte&quot;: ausgewählte Objekte werden dem TIRFM Bild (4B) überlagert erscheinen. </li><li> Umfassen in der Analyse nur die Punkte, die eine kurze (1-3 Frames) zeigen transiente Erhöhung der Fluoreszenzintensität, unmittelbar gefolgt von einem deutlichen Verlust des Signals (transient spots) gefolgt. Beschäftigen die Kreisauswahl um eine ROI etwa ein Punktdurchmesser radial um die ausgewählten Vesikel / Spots (experimentell ROIs) erstellen. Führen Sie diesen Schritt manuell. </li><li> Mit den ausgewählten ROIs, die Berechnung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität jeder ROI innerhalb des Films. </li></ol></li><li> Datenanalyse (3C-D) <ol><li> Exportieren Sie den Zeitverlauf der Fluoreszenzänderungen in jedem &quot;experimentellen ROI&quot; in eine Tabellenkalkulation gemessen; (Abbildung 3DA). Normalisieren der Intensitätswert in jedem Rahmen in die Ausgangsfluoreszenzintensität (F / F0), (Abbildung 3dB). </li><li> Anwenden des exponentiellen Korrektur der Intensitätswerte in jedem Rahmen, wie in Schritt 3.2.4 (Fig 3Dc) berichtet. </li><li> Um die Gesamtzahl der Fusionsereignisse (Peak-Zahl), die Zeit jedes Fusion auftritt (Peakbreite) und die Amplitude der Fluoreszenz-Peak (Spitzenhöhe und AUC) berechnet gelten logische Funktionen mit Tabellenkalkulation oder Mathematik-Pakete. Ein Beispiel für eine Fusion Ereignisanalyse mit logischen Formeln ist in Abbildung 3Dd und 3De wiesen. </li><li> Angenommen, die Zunahme der Fluoreszenzintensität der den Schwellenwert (durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität ± 3SD) als Vesikelfusion an die Plasmamembran und die resultierende Spitzen als Fusionsereignis. </li><li> Berechnen der Peakbreite als Differenz zwischen dem letzten und dem ersten X-Wert jedes Peaks. Multiplizieren Sie diesen Wert für 1 / (Sampling-Frequenz). Betrachten Sie diesen Wert einist die Zeit der Fusion von Vesikeln und Haftung an der Plasmamembran vor Vesikel Wieder Versauerung und Recycling (Abbildung 3Dd). </li><li> Berechnen der Gesamtzell-AUC als eine Summe von Werten über dem Schwellenwert. Betrachten Sie diesen Wert als Nettofluoreszenzänderung während der Aufnahmezeit aufgrund der spontanen (Urlaub) oder hervorgerufen (stimuliert) synaptische Aktivität. </li><li> Berechnen der Peakhöhe als die Differenz zwischen der maximalen y-Wert jeder Spitze und dem Schwellenwert. Betrachten Sie diesen Wert als Hinweis auf die Fusionstyp (Einzel vs. gleichzeitige / fortlauf Fusion oder transiente vs. Vollfusion). </li></ol></li></ol>

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<li>Kume, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dibutyryl+cyclic+AMP+induces+differentiation+of+human+neuroblastoma+SH-SY5Y+cells+into+a+noradrenergic+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype.</a> Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).</li>
<li>Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiaspro%2C+A+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).</li>
<li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für Bild und analysieren Vesikel Dynamik in sezernierenden Zellen, unter Verwendung von fluoreszierenden cDNA-kodierten Vektoren und TIRFM. Schlüsselelemente für eine erfolgreiche Bildgebung durch TIRFM sind die Auswahl des Zellmodell und Zelltransfektion mit genetisch codierte optische Anzeigen von Vesikel-Freisetzung und Recycling. TIRFM ist ideal für wachsende Zellen haft auf eine Glasabdeckung und ausreichend eben, um eine stabile Darstellung von Membr...

Chemische synaptische Übertragung zwischen Neuronen ist ein Hauptmechanismus der Kommunikation im Nervensystem. Es beruht auf der Freisetzung von Neurotransmittern durch einen dynamischen Zyklus Vesikelfusion Auslagern in der präsynaptischen Seite. Viele der Proteine ​​in Vesikel Dynamik beteiligt identifiziert worden sind; jedoch ihre spezifischen Beitrag zum Phänomen bleibt zu klären 1. Unser Verständnis teilweise durch die Tatsache, dass die am häufigsten verwendeten Assays zur exo / Endozytose nicht immer am besten geeignet beschränkt. Mehrere Studien zu Vesikelfusion bezogenen und Dynamik setzen auf elektrophysiologischen Techniken. Diese Technik sorgt für eine optimale zeitliche Auflösung und ist ausgezeichnet für die Untersuchung der anfänglichen Fusion von Bläschen an der Plasmamembran aber nicht erkennen viele der molekularen Mechanismen, die präsynaptischen Funktion unterstützen. Elektronenmikroskopie, auf der anderen Seite stellt die feinste morphological Beschreibung jeder einzelnen Schritt, aber der dynamische Aspekt der Veranstaltung können nicht erfasst werden, weil Proben müssen, um fest zu analysieren werden. Das Aufkommen von neuen optischen Aufzeichnungstechniken 2,3, in Kombination mit den Fortschritten in Fluoreszenzmolekularsonden Entwicklung 4-6, ermöglicht die Visualisierung der Exozytose Prozessen in lebenden Zellen, wodurch ein neues Maß an Informationen über die synaptische Struktur und Funktion. Erste Studien genutzt aktivitätsabhängigen Styrylfarbstoffe (FM1-43 und verwandte organische Farbstoffe) 7,8. State-of-the-Art-bildgebenden Verfahren eingesetzt werden pH-sensitive Varianten des Green Fluorescent Protein (GFP) (pHluorin) zu Lumen Vesikel Proteine ​​9 angebunden. Diese Sonden werden in der Regel aus, wenn in den Vesikeln aufgrund der geringen luminale pH vorliegenden geschaltet. Nach der Fusion mit der Plasmamembran, die Vesikelinnenraum zur neutralen Extrazellularraum der pH Einstrahlung<html> abrupt, entlastet den Protonenabhängige Abschrecken pHluorin und das Fluoreszenzsignal schnell angezeigt. Da die Änderung in pHluorin schneller ist als die Fusionsereignis, durch Messen der Fluoreszenz zunimmt, kann Vesikelfusion mit der Membran gemessen und analysiert werden. Da Oberflächen pHluorin-markierte Moleküle Endozytose werden, danach kehrt das Fluoreszenzsignal auf Basisniveau, also das gleiche Konstrukt kann auch Vesikel Recycling 9 Überwachung verwendet werden. Während die Vesikel-markierten pH-Sensor sorgt für die Visualisierung nur dieser Vesikel, die wirklich verschmelzen mit der Plasmamembran wird Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung benötigt, um im Detail zu beschreiben die Schritte in den exo / endozytischen Prozesse. Die optische Technik, die die notwendigen räumlichen und zeitlichen Auflösung bietet, ist Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), eine Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie 10. &quot;&gt; Totalreflexion an der Grenzfläche zwischen dem Glasdeckglas und der Probe. Wenn der Lichtpfad des Glasdeckglas mit einem Einfallswinkel größer als der kritische Winkel erreicht auftritt, wird das Erregungslicht nicht in die Probe übertragen, aber ist vollständig zurückreflektiert wird. Unter diesen Bedingungen wird ein evaneszentes Licht-Wellenformen an der Grenzfläche und breitet sich in dem Medium mit geringer optischer Dichte (der Probe). Da die Intensität des abklingenden Feldes nimmt exponentiell mit dem Abstand von der Schnittstelle (mit einer Eindringtiefe von etwa 100 nm) nur die Fluorophore in unmittelbarer Nähe vom Deckglas angeregt werden, während diejenigen, die weiter vom Rand entfernt liegen nicht. In Zellen, die mit GFP-Konstrukten transfiziert, entspricht diese Tiefe, um Proteine ​​auf der Plasmamembran exprimiert oder vesikuläre Strukturen nähert sie. Als Fluorophore im Zellinneren nicht erregt werden, wird die Hintergrundfluoreszenz minimiert, und ein Bild mit einem sehr hohen Signal / Hintergrund-Ratteio 11 gebildet. Mehrere Eigenschaften machen TIRFM die Technik der Wahl für die Überwachung von Vesikeln Dynamik. Die perfekten Kontrast und die hohe Signal-zu-Rausch-Verhältnis ermöglicht die Detektion von sehr niedrigen Signalen, die aus einzelnen Vesikeln. Chipbasierte Bildaufnahme in jedem Frame bietet die zeitliche Auflösung erforderlich sind, um hochdynamische Prozesse zu erkennen. Schließlich ist die minimale Exposition von Zellen gegen Licht an jedem anderen Flugzeug in der Probe reduziert stark Phototoxizität und ermöglicht langlebige Zeitrafferaufnahme 12. Datenanalyse bleibt die größte Herausforderung und entscheidender Aspekt dieser Technik. Der einfachste Weg, Vesikelfusion überwachen ist die Ansammlung von fluoreszenten Reporter-Proteine ​​auf der Zelloberfläche zu messen, über die Zeit 13. Als Fusions erhöht, Nettofluoreszenzsignal steigt auch. Allerdings kann diese Methode den Prozess zu unterschätzen, insbesondere in großen Zellen und in Ruhebedingungen,weil Endozytose und Bleichen Prozesse versetzt den Anstieg in der Fluoreszenzintensität aufgrund von Bläschen Exocytose. Ein alternatives Verfahren besteht darin, jede einzelne Fusionsereignis 14 zu folgen. Dieses letztere Verfahren ist sehr empfindlich und kann wichtige Informationen über den Fusionsmechanismen offenbaren. Es erfordert jedoch die manuelle Auswahl der einzelnen Ereignisse, weil vollständig automatisierte Verfahren, um Vesikel zu verfolgen und die Fluktuation der Fluoreszenzsignale zu registrieren sind nicht immer verfügbar. Die Beobachtung der Vesikel Dynamik erfordert Sampling-Zellen mit einer hohen Frequenz. Dies erzeugt eine große Menge von Daten, die kaum manuell analysiert werden kann. Der Vorschlag der vorliegenden Arbeit ist es, die TIRFM bildgebendes Verfahren zur Überwachung der basale und stimulierte Freisetzung von Neurotransmittern in der SH-5YSY Neuroblastom-Zelllinie zu optimieren und zu beschreiben, Schritt-für-Schritt wird eine im Labor entwickelt Verfahren, um Daten zu analysieren, sowohl bei Ganzzell-und Single-Vesikel Ebenen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Geräte</td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>491912-9850-000</td><td>invertiertes Mikroskop</td></tr><tr><td>Multiline Argon Laser Lasos 77</td><td><a href="http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lasos</a></td><td>00000-1312-752</td><td>mehrzeiliger (458/488/514 nm), 100&amp;nbsp;mW Argon-Ionenlaser</td></tr><tr><td>Laser TIRF slider</td><td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>423681-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>100X Objektiv</td><td><a href="https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&amp;amp;p=us&amp;amp;f=o&amp;amp;a=v&amp;amp;m=a&amp;amp;id=421190-9900-000&amp;amp;ss=1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>421190-9900-000</td><td>Öl, NA 1.45 Alpha-Plan</td></tr><tr><td>CCD-Kamera RetigaSRV Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> QImaging</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAMBDA 10-3 optischer Filterwechsler mit SmartShutter</td><td><a href="http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sutter Instrument Company</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Image ProPlus 6.3 Software</td><td><a href="http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td></td><td>Spot-Auswahl, ROI-Auswahl, Bestimmung der Fluoreszenzintensität</td></tr><tr><td>Excel</td><td><a href="http://office.microsoft.com/it-it/excel/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td></td><td>Korrektur von Photobleaching, Analysen von Gesamtzell- und Einzelvesikeldaten</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 4.00</td><td><a href="http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad Software, Inc.</a></td><td></td><td>statistische Analyse</td></tr></tbody></table>

tirfm und ph-sensitive gfp-sonden an neurotransmitter-vesikel-dynamics werten in sh-sy5y neuroblastomzellen: cell imaging und datenanalyse

TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis

Synaptischen Vesikeln frei Neurotransmitter an chemischen Synapsen durch einen dynamischen Zyklus der Fusion und den Abruf. Überwachung synaptische Aktivität in Echtzeit und sezieren die verschiedenen Schritte von exo-Endozytose auf Einzel Vesikel Ebene sind entscheidend für das Verständnis der synaptischen Funktionen in Gesundheit und Krankheit. Genetisch kodierte pH-sensitive Sonden direkt an synaptischen Vesikeln und Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) gezielte bieten die räumlich-zeitliche Auflösung erforderlich sind, um Vesikel Dynamik zu folgen. Das abklingende Feld durch interne Totalreflexion erzeugt wird, kann nur Fluorophore in einer dünnen Schicht (&lt;150 nm) über der Glasdeckel an dem Zellen anhaften platziert erregen, genau dort, wo die Verfahren der exo-Endozytose erfolgt. Die entstandenen Bilder mit hohem Kontrast sind ideal geeignet für Vesikel Tracking und quantitative Analyse von Fusions Veranstaltungen. In diesem Protokoll, SH-SY5Y menschlichen neuroblastoma Zellen werden als ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Neurotransmitterfreisetzung an der Single-Vesikel Ebene durch TIRFM aufgrund ihrer flachen Oberfläche und der Gegenwart verteilt Vesikel vorgeschlagen. Die Verfahren zum Züchten von SH-SY5Y als adhärente Zellen und zur Transfektion von ihnen synapto-pHluorin vorgesehen sind, sowie als ein Verfahren, TIRFM und Bildgebung auszuführen. Schließlich wurde eine Strategie mit dem Ziel, zu wählen, zu zählen und zu analysieren Fusion Ereignissen an Ganzzell-und Single-Vesikel Ebenen dargestellt. Um das Bildgebungsverfahren und Datenanalyse-Ansatz zu validieren, die Dynamik des pHluorin-markierten Vesikel unter Ruhe analysiert und stimuliert (depolarisierenden Kaliumkonzentrationen) Bedingungen. Membrandepolarisation erhöht die Frequenz der Fusionsereignisse und verursacht eine parallele Erhöhung des Nettofluoreszenzsignals im ganzen Zelle aufgezeichnet. Single-Vesikel Analyse zeigt Modifikationen Fusionsereignis Verhalten (erhöhte Spitzenhöhe und Breite). Diese Daten legen nahe thbei Kalium-Depolarisation nicht nur induziert eine massive Freisetzung von Neurotransmittern, sondern auch verändert den Mechanismus der Fusion von Vesikeln und Recycling. Mit dem geeigneten fluoreszierenden Sonde kann diese Technik in verschiedenen Zellsystemen eingesetzt werden, um die Mechanismen der konstitutiven und stimulierte Sekretion sezieren.

Die beschriebenen TIRF Bildgebung und Datenanalyse-Verfahren sollen die Vesikel Dynamik in zellulären Systemen zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Signalmolekülen und Medikamente auf Fusionsereignisse und Neurotransmitter-Vesikel Dynamik 17 zu bestimmen. Mit GFP-markierten Plasmamembranproteinen hat die TIRFM Analyse eingesetzt worden, um die konstitutive Handel mit GFP-markierten Glutamattransporter in Gliazellen und Epithelzellen 18,19 charakterisieren. ...

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Synaptic vesicles release neurotransmitters at chemical synapses through a dynamic cycle of fusion and retrieval. Monitoring synaptic activity in real ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen mit Hilfe von pH-empfindlichen Sonden und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie oder Rasenerde zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen auf Glasdeckgläser aufgebracht und mit genetisch kodierten pH-empfindlichen Fluoreszenzsonden der Vesikelfusion und des Vesikelrecyclings durchtrennt werden, die selektiv auf synaptische Vesikel abzielen. Die Proteinexpression wird innerhalb von 24 bis 48 Stunden erwartet.Der zweite Schritt besteht darin, die Vesikeldynamik mittels Totalreflexionsmikroskopie zu erfassen. Dieser Schritt ist besonders wichtig für den Erfolg des Experiments, und es wird eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung gegeben, wie die Rasenkonfiguration erreicht werden kann. Nächster. Sobald die richtige Rasenkonfiguration erreicht ist, können die sequenziellen Bilder von der Software automatisch unter basalen oder stimulierten Bedingungen aufgezeichnet werden.Der letzte Schritt besteht darin, Bilder zu verarbeiten und Daten aus den Videos mit kommerzieller Software oder hausgemachten Algorithmen zu extrahieren. Schließlich wird die Torfmikroskopie verwendet, um die Veränderungen des Fluoreszenzsignals aufzuzeichnen, die von der Vesikelfusion zur Plasmamembran ausgehen. Es ist möglich, Informationen über die Häufigkeit von Fusionsereignissen und die Art der Vesikelfusion zu erhalten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den bestehenden Methoden, wie z.B. der Elektromikroskopie und Elektrophysiologie, besteht darin, dass sie sowohl eine spezielle als auch eine vorübergehende Lösung bietet, die zum Nachweis der Vesikeldynamik erforderlich ist. In der Tat ermöglichen die mit dieser Technik erhaltenen kontrastreichen Bilder die Detektion von Signalen einzelner Vesikel. Die billige Basisbilderfassungsanalyse bietet die vorübergehende Lösung, die zur Erkennung der Dynamik erforderlich ist.Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage im Bereich der Nervenforschung zu beantworten, wie z.B. das Verständnis der Rolle eines bestimmten synaptischen Proteins für die Fahrraddynamik oder des Wirkmechanismus von Medikamenten, die auf die synaptischen Übertragungen wirken. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in diesem Bereich sind, Schwierigkeiten mit dieser Analyse, da vollautomatische Verfahren zur Verfolgung von Vesikeln und zur Registrierung der Fluktuation des PROEs-Signals nicht immer verfügbar sind. Wir kamen auf die Idee dieser Methode, als wir uns entschieden, den Einfluss von pathogenen mutierten oder synaptischen Proteinen auf die Vesikelfreisetzung des Nevo-Transmitters zu untersuchen.Die bestehenden Methoden waren nicht umfassend genug, so dass wir uns entschlossen haben, diese Technik in der Neuroblastom-Zelllinie SH SY five one zu etablieren, um die passende Lösung zu erreichen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da einige wichtige Schritte, wie z. B. das Erreichen einer Tier-Four-Konfiguration und das Extrahieren der quantitativen Daten aus Videos, entscheidend sind, um sie mit Worten zu erklären, während sie verständlicher und überzeugender sein können. Wenn visualisiert.Um die Rasenbildgebung durchzuführen, richten Sie ein motorisiertes inverses Mikroskop, eine Laserquelle und den Rasenschieber ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Um eine Rasenausleuchtung zu erreichen. Entfernen Sie die Glasabdeckung mit den transfizierten Zellen und setzen Sie sie in die entsprechende Bildgebungskammer ein.Bauen Sie die Kammer zusammen und geben Sie 500 Mikroliter Krebs-Ringer-Lösung in die Mitte des Glases. Dann Öl über das Objektiv geben. Stellen Sie die Bildgebungskammer auf den Tisch des Mikroskops und positionieren Sie das Objektiv unter dem Glasdeckglas.Positionieren Sie die sichere Abdeckung im Epi-Fluoreszenzmodus über der Probe. Fokussieren Sie sich auf das Deckglas und wählen Sie transfizierte Zellen aus, die softwaregesteuert in der Kammermitte platziert werden. Wechseln Sie im Live-Modus zur Rasenbeleuchtung.Um die Rasenkonfiguration einzustellen, überprüfen Sie die Position des Balkens, der aus dem Objektiv auf der Probenabdeckung herausragt. Wenn der Strahl in der Mitte der Objektivlinse positioniert ist, ist ein Fleck in der Mitte der Abdeckung der Rasenprobe sichtbar und die Zelle wird im Epi-Fluoreszenzmodus abgebildet. Um den kritischen Winkel zu erreichen, bewegen Sie den fokussierten Punkt mit der Winkeleinstellschraube am Rasenschieber in Y-Richtung.Wenn der Strahl in einem Winkel größer als der kritische Winkel auf die Probenebene trifft, verschwindet der Fleck und eine gerade, dünne, fokussierte Linie ist in der Mitte der Probenabdeckung sichtbar. Um den Rasenwinkel fein abzustimmen, verwenden Sie eine Zellprobe. Sehen Sie sich das Fluoreszenzbild im Video an.Zu diesem Zeitpunkt ist noch ein epi-fluoreszenzähnliches Bild sichtbar. Bewegen Sie die Schraube vorsichtig, bis der Rasenzustand erreicht ist. Hier ist nur eine optische Ebene der Zelle scharf, was zu einem flachen Bild mit hohem Kontrast führt.Um eine Probenbildgebung durchzuführen, stellen Sie das Einkanal-Zeitrafferexperiment auf geeignete Belichtungszeiten zwischen 40 und 80 Millisekunden ein. Erfassen Sie Bilder mit einer Abtastfrequenz von einem oder zwei Hertz. Fügen Sie 500 Mikroliter Krebs-Ringer-Lösung hinzu und zeichnen Sie die Zellen im Rasenmikroskopie-Modus auf.Sparen Sie sich die Zeit sequentieller Bilder des Ruhezustands. Konzentrieren Sie sich auf dieselbe Zelle und zeichnen Sie unter den gleichen Ruhebedingungen auf. Fügen Sie nach fünf Frames fünf Mikroliter Kaliumchlorid-Krebsringer-Lösung hinzu und halten Sie Kaliumchlorid in der Kammer.Sparen Sie Zeit. Sequentielle Bilder des stimulierten Zustands. Verwenden Sie ein Sequenz-Fluoreszenzintensitätsmakro für die Fluoreszenzintensität, die Quantifizierung in einem interessierenden Bereich oder den ROI des Bildes im Verlauf des Films.Öffnen Sie dazu zunächst die zeitlich sequentiellen Bilder. Gehen Sie zum Makromenü und wählen Sie die Fluoreszenzintensität der Sequenz. Navigieren Sie im Analysefenster.Um den ROI auszuwählen, wählen Sie eines der Auswahlwerkzeuge im Menü aus. Um den ROI zu erstellen, platzieren Sie drei ROIs in Regionen der Zellmembran ohne Flecken. Für die Hintergrund-RO verwende ich diesen Hintergrund-ROI, um das Photo-Bleaching zu bewerten und den Schwellenwert für die Analyse des Fusionsereignisses festzulegen.Wenn die ROIs ausgewählt sind, klicken Sie auf OK. Berechnen Sie automatisch die durchschnittliche Fluoreszenzintensität jedes ROI im Verlauf des Films und exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Um das Photobleaching offen zu bewerten, stieg die Fluoreszenzintensität an.Hintergrund-ROIs normalisieren die Fluoreszenzintensitätswerte in jedem Frame auf den ursprünglichen Intensitätswert und mitteln die Werte. Markieren Sie die Durchschnittsdaten und erstellen Sie ein Liniendiagramm mit den Menüoptionen des Diagramms. Wählen Sie im Menü "Datenanalyse" die Option "Trendlinie" aus, um das Dialogfeld "Diagrammanalyse" zu öffnen.Legen Sie den Regressionstyp auf exponentielle Regression fest. Wählen Sie dann Gleichung im Diagramm anzeigen. Im Diagrammfenster wird die Exponentialgleichung angezeigt, und die Parameterwerte werden automatisch zugewiesen.Nachdem Sie die exponentielle Korrektur auf die Intensitätswerte angewendet haben, wie im Textprotokoll beschrieben, stellen Sie den Schwellenwert ein, indem Sie einen normalisierten und korrigierten Hintergrund öffnen. ROI berechnet dann das durchschnittliche Fluoreszenzsignal und seine Standardabweichung. Der Durchschnittswert plus drei Einheiten der Standardabweichung stellt den Schwellenwert dar.So wählen Sie die Fusionsereignisse aus. Öffnen Sie zunächst die zeitlich sequenziellen Bilder mit einer Bildanalysesoftware und wenden Sie einen Gaußschen Filter auf die aktive Bildsequenz an. Analysieren Sie Bilder mit dem Werkzeug Objekte zählen oder einem Makro, das die Auswahl eines Objekts ermöglicht, dessen Pixel eine durchschnittliche Fluoreszenzintensität innerhalb eines definierten Bereichs aufweisen.Legen Sie den Intensitätsbereich manuell mit der Schwellenwertfunktion fest: Makro anwenden, Objekte filtern, um nur Objekte auszuwählen, die bestimmte Kriterien erfüllen. Wenden Sie zunächst die Option "Bereiche" für den Aspekt an. Seitenverhältnis gibt das Verhältnis zwischen der Hauptachse und der Nebenachse der Ellipse an, das dem Objekt entspricht.Angemessene Werte für die Ausrichtung sind mindestens eins und maximal 2,3. Wenden Sie dann Bereiche für das Durchmesserkriterium In Pixeldurchmesser an gibt die durchschnittliche Länge der Durchmesser an, die in Abständen von zwei Grad gemessen werden, wobei zwei umrandete Punkte verbunden werden und die OID des Objekts durchlaufen wird. Wählen Sie als Nächstes Anzeigeobjekte aus.Ausgewählte Objekte werden dem Rasenmikroskopie-Bildhinweis in der Analyse nur die Punkte überlagert, die einen kurzen vorübergehenden Anstieg der Fluoreszenzintensität unmittelbar gefolgt von einem deutlichen Signalverlust zeigen. Verwenden Sie die kreisförmige Auswahl manuell, um einen ROI von ungefähr einem Punktdurchmesser radial um das ausgewählte Vesikel zu erzeugen. Wenn der ROI ausgewählt ist, berechnen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität jedes ROI im Verlauf des Films.Exportieren Sie den Zeitverlauf der Fluoreszenzänderungen, die in jedem experimentellen ROI gemessen wurden, in eine Tabelle. Fahren Sie fort, um den Intensitätswert in jedem Frame auf die anfängliche Fluoreszenzintensität zu normalisieren. Nachdem Sie die Exponentialkorrektur wie zuvor auf die Intensitätswerte in jedem Frame angewendet haben, wenden Sie logische Funktionen mithilfe von Tabellenkalkulationen oder mathematischen Paketen an, um die Gesamtzahl der Fusionsereignisse, die Zeit jeder Fusion und die Amplitude des Fluoreszenzpeaks zu berechnen. Nehmen wir an, dass die Erhöhung der Fluoreszenzintensität über den Schwellenwert hinausgeht, als Vesikelfusion zur Plasmamembran und der daraus resultierende Peak als Fusionsereignis vorliegt.Berechnen Sie die Peakbreite als Differenz zwischen dem letzten und dem ersten X-Wert jedes Peaks. Multiplizieren Sie dann diesen Wert mit eins über die Abtastfrequenz. Betrachten Sie diesen Wert als die Zeit der Vesikelfusion und Adhäsion an der Plasmamembran vor dem Vesikel, der Wiederversäuerung und dem Recycling.Berechnen Sie als Nächstes die gesamte Zellenfläche unter der Kurve als Summe der Werte über dem Schwellenwert. Betrachten Sie diesen Wert als Netto-Fluoreszenzänderung. Während der Aufzeichnungszeit aufgrund der spontanen oder evozierten synaptischen Aktivität berechnen Sie die Peakhöhe als Differenz zwischen dem maximalen y-Wert jedes Peaks und dem Schwellenwert und betrachten Sie diesen Wert als Indikator für den Fusionstyp. Bei der Ganzzellanalyse werden die Gesamtzahl und die Häufigkeit der in der Zelle auftretenden Fusionsereignisse unter Ruhebedingungen analysiert.Gelegentlich nähern sich Vesikel der Plasmamembran und fusionieren mit ihr im Fluoreszenzintensitätsdiagramm. Dies spiegelt sich in einer abrupten Änderung der Fluoreszenzintensität über der Schwelle nach Anwendung des Sekretärsstimulus wider. Unterschiedliche Peaks variabler Fluoreszenzintensität erscheinen plötzlich im Diagramm des Fluoreszenzintensitätsprofils.Beachten Sie die Zunahme der Peakzahl und -höhe nach der Kaliumstimulation. Bei der Single-Peak-Analyse wird jedes einzelne Fusionsereignis analysiert. Es werden zwei Parameter gemessen.Die Peakbreite, die der Zeit des Vesikels, der Adhäsion und der Fusion mit der Plasmamembran entspricht, sowie die Peakhöhe, die den Mechanismus der Peakfusion widerspiegelt. Unter Kaliumdepolarisation nehmen die Höhe und Breite des Peaks zu, was eine Änderung der motorischen Vesikelfusion zur Plasmamembran widerspiegelt. Während der Teilnahme an diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Dosentechnik nur die Visualisierung des Ereignisses ermöglichen kann, das an der Plasmamembran stattfindet oder unmittelbar nach diesem Verfahren.Andere Methoden, wie eine umfangreiche Mikroskopie, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. das Schicksal von internalisierten Fahrrädern, Proteinen in den Zellen nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern, die auf dem Gebiet der Zellbiologie und Physiologie arbeiteten, den Weg, dynamische Ereignisse zu untersuchen, die an der persönlichen Membran ablaufen, wie z. B. die vesikale Exozytose, die Zellmatrixausgabe und die Ionenflüsse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Konfiguration der vierten Ebene erreichen, die vertikale Dynamik aufzeichnen und Daten analysieren.

tirfm-ph-sensitive-gfp-probes-to-evaluate-neurotransmitter-vesicle

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Durch die Kennzeichnung die extrazellulären Domänen von Membranrezeptoren mit superecliptic pHluorin, und durch Abbilden diese Fusion Rezeptoren in kultivierten Maus Neuronen, können wir direkt visualisieren einzelnen vesikulären Insertionsereignisse der Rezeptoren in der Plasmamembran. Diese Technik wird maßgeblich bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Rezeptor-Insertion in die Plasmamembran.

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

Dieses Video zeigt, wie neuronale Vesikel mit spezifischen fluoreszierenden Proteinen markiert werden, um ihre Bewegung zu visualisieren. Zuerst wird ein Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert, mit einem Transfektionsmittel inkubiert und dann in eine Kultur von Neuronen eingeführt. Anschließend werden Bilder der Neuronen aufgenommen und analysiert, um die Bewegung der Vesikel zu verfolgen.

Visualisierung von Vesikelmotilitäten in Neuronen mittels Fluoreszenzbildgebung

Quelle: Daniele, F., et. al TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden zur Bewertung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Zellbildgebung und Datenanalyse. J. Vis. exp. (2015). Dieses Video zeigt die Bildgebung von humanen Neuroblastomzellen mit einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF), um mit Fluorophoren markierte synaptische Vesikel sichtbar zu machen. Die Zellen werden zunächst im Epifluoreszenzmodus fokussiert. Anschließend werden Anpassungen vorgenommen,...

Zellbildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

Quelle: Lacin, E., et al. Konstruktion von zellbasierten Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reportern (CNiFERs) für die optische Detektion von Neurotransmittern in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt eine Technik zur Abbildung der Neurotransmitterfreisetzung in vivo unter Verwendung von zellbasierten Neurotransmitter-Fluoreszenz-Reportern (CNiFERs), spezialisierten Reporterzellen, die in die Hirnrinde der Maus vorinjiziert werden. Die Maus wird unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop...

Bildgebung der Freisetzung von Neurotransmittern mit zellbasierten Neurotransmitter-Fluoreszenz-Reportern

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Synaptischen Vesikel Endozytose wird durch Lichtmikroskopie pHluorin verschmolzen mit synaptischen Vesikel Protein und Elektronenmikroskopie der Vesikel Aufnahme erkannt.

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

Wir beschreiben einen optischen Test zur synaptischen Vesikel (SV) recycling in kultivierten Neuronen. Kombinieren dieses Protokoll mit doppelten Transfektion einer präsynaptischen Marker und Protein des Interesses zum Ausdruck bringen kann wir finden präsynaptischen Websites, deren synaptischen Vesikel Recyclingkapazität, und bestimmen die Rolle des Proteins des Interesses.

Ein optischer Test zum synaptischen Vesicle Recycling in kultivierten Neuronen überexprimiert präsynaptischen Proteine

Neurodegenerative Erkrankungen sind mit dysregulierten Mikrogliafunktionen verbunden. Dieser Artikel beschreibt einen In-vitro-Assay der Phagozytose von Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen. Quantitative Mikroskopie-Auslesungen werden sowohl für die Zeitraffer-Bildgebung mit lebenden Zellen als auch für die High-Content-Bildgebung mit festen Zellen beschrieben.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Die neuromuskuläre Verbindung der Zebrafischlarve ist ein attraktives Modell für die Untersuchung der synaptischen Physiologie. Es ist für viele experimentelle Techniken zugänglich, einschließlich Elektrophysiologie und optischer Bildgebung. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Abbildung der synaptischen Übertragung mit einer pHluorin-basierten Sonde unter einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop.

Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Erfahren Sie die Untersuchung von Neurotransmitter-Vesikel-Dynamiken in Neuroblastomzellen mittels pH-sensitiver GFP-Sonden und TIRFM. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen synaptischer Prozesse.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse (Video) | JoVE Journal

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

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