Glutamat und Hypoxie als Stress-Modell für die isolierten perfundierten Wirbel Retina

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Glutamat- oder Hypoxie-Stress als mögliches Modell einzuführen, um die Wirksamkeit von neuroprotektiven Wirkstoffen zu testen. Dies wird erreicht, indem zunächst frisch in kernhaltige Rinderaugen gewonnen und eine schnelle, aber dennoch traumatische Aufklärung der Netzhaut durchgeführt wird. Als nächstes werden nach dem Verschmelzen der Netzhäute mit einer speziellen Nährlösung Elektroden verwendet, um eine Reihe von stabilen Basis-Elektroretinogrammen oder ERGs aufzuzeichnen.

Dann wird der Nährlösung Glutamat zugesetzt, oder Hypoxie wird durch Zugabe von 100 % Stickstoff anstelle von Sauerstoff induziert. Schließlich wird ein ERG aufgezeichnet, um die Auswirkungen von Glutamatstress oder Hypoxie auf die Amplituden der A- und B-Wellen zu sehen. Die Ergebnisse zeigen eine Veränderung der Netzhautfunktion bei Exposition gegenüber Hypoxie oder Glutamatstress durch ERG-Aufzeichnungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Zellkultur- oder in vivo-ERG-Aufzeichnungen besteht darin, dass Funktionstests im Gegensatz zu Zellkulturen durchgeführt werden können, ohne die Variabilität zu haben, die durch die Platzierung von Elektroden oder Vollnarkose im Vergleich zu in vivo-Experimenten ausgeübt wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im pharmakologischen Bereich zu beantworten, wie z.B. die Erprobung neuroprotektiver Wirkstoffe. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose akuter oder chronischer Krankheiten.

Mit diesem Stressmodell können nun mögliche neuroprotektive Wirkstoffe getestet werden. Obwohl diese Methode Einblicke in die Neuroprotektion im ophthalmologischen Bereich geben kann, kann sie auch auf andere medizinische Bereiche wie neurodegenerative Erkrankungen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Vorbereitungstechnik Schwierigkeiten haben.

Das Modell selbst wurde von Professor Sickle in Köln entwickelt, und er war ein großer Neurophysiologe. Nachdem Sie Rinderaugen von einem geschlachteten Tier gewonnen haben, legen Sie sie in Sichellösung bei Raumtemperatur für den Transport ins Labor unter schwachem rotem Licht unter dunkelangepassten Bedingungen. Entfernen Sie den vorderen Teil des Auges, führen Sie dann einen äquatorialen Schnitt etwa vier Millimeter hinter dem Limbus durch und entfernen Sie die Hornhaut, den Ziliarkörper und die Linse in einem Stück.

Bewahren Sie die Netzhaut in Sichellösung auf. Lösen Sie anschließend mechanisch die Glaskörperansätze an der Netzhautoberfläche und entfernen Sie den Glaskörper aus der geöffneten Augenmuschel. Teilen Sie dann das Auge in vier Quadranten und stanzen Sie mit einem TR verfeinern runde Bereiche mit einem Durchmesser von etwa sieben Millimetern aus.

Trennen Sie die Netzhaut vorsichtig vom Pigmentepithel und legen Sie sie auf ein Aufzeichnungsgerät, übertragen Sie die Netzhaut auf ein Netz und befestigen Sie sie mit einem Kunststoffring an den Elektroden. Stellen Sie das Aufnahmegerät dann in eine lichtgeschützte Box. Bevor Sie dunkel messen, passen Sie die Netzhaut dann mit kalibrierten Neutraldichtefiltern an und stellen Sie einen Lichtstimulus von 10 Mikrosekunden ein. In Fünf-Minuten-Intervallen wenden Sie einen einzelnen weißen Xenon-Blitz mit einem Hertz zur Stimulation mit einer Intensität von 6,3 der gleichen Lichtintensität oder MLX an der Netzhautoberfläche an.

Nach der Dunkeladaptionsphase bei konstanter Perfusion werden die Amplituden des elektrischen Signals gemessen, bis stabile Wellenamplituden aufgezeichnet werden. Ersetzen Sie zu Beginn des Tests reinen Sauerstoff entweder durch reinen Stickstoff, um auf Hypoxie zu testen, oder durch 250 mikromolares Glutamat. Zeichnen Sie die elektrischen Reaktionen 45 Minuten lang alle fünf Minuten auf.

Messen Sie die B-Wellen-Amplitude vom Tal der A-Welle bis zum Höhepunkt der B-Welle, um die Wirkung von Hypoxie oder Glutamat auf das Photorezeptorpotential zu untersuchen. Unter skotopischen Bedingungen fügen Sie der Nährlösung ein millimolares Aspartat hinzu, um die B-Welle zu unterdrücken, um die Daten statistisch auszuwerten, verwenden Sie den Coof-Smirnoff-Test, um eine Normalverteilung für alle Daten sicherzustellen. Berechnen Sie die Verringerung der Amplituden und Prozentsätze der A- und B-Wellen nach der Belichtungsphase.

Vergleichen Sie im Vergleich zur letzten Messung vor der Exposition die Verringerung der ERG-Amplituden nach 45 Minuten am Ende der Expositionszeit mit der vor der Anwendung gemessenen ERG. Vergleichen Sie die a- und b-Welle am Ende der Auswaschphase mit der entsprechenden Amplitude vor der Exposition. Um eine mögliche Wiederherstellung für die statistische Analyse zu untersuchen, verwenden Sie die Statistiksoftware JMP oder SPSS.

Berechnen Sie die Daten durchgehend als mittlere Plus- oder Minus-Standardabweichung. Verwenden Sie den entsprechenden statistischen Test, um die Signifikanz zu schätzen, wie hier gezeigt. Nach einer einstündigen Perfusion der Netzhautpräparate mit sauerstoffgesättigter Standardlösung stabilisierte sich die ERG-Amplitude und zeigte eine geringere Variation der Amplituden zwischen den einzelnen Messungen.

pH, osmotischer Druck, Temperatur und PO zwei wurden bei allen Tests konstant gehalten. Um das Photorezeptorsignal vom Signal der inneren Netzhaut zu isolieren, wurde der Standardlösung ein millimolares Aspartat zugesetzt, um die B-Welle zu unterdrücken. Unter hypoxischen Bedingungen wurde eine Abnahme der Wellenamplitude um 87,0 % festgestellt.

Nach einer Einwirkzeit von 45 Minuten am Ende der Auswaschung wurde eine Abnahme von 36,5 % festgestellt. Das war statistisch signifikant. Darüber hinaus wurde in diesem Setting eine statistisch signifikante anfängliche Abnahme der B-Wellen-Amplituden um 87,23 % festgestellt.

Es wurde eine statistisch signifikante Reduktion um 25,5 % festgestellt. Nach Exposition mit 250 mikromolaren Glutamat wurde nach dem definierten Zeitintervall eine nicht signifikante Reduktion der Wellenamplituden um 7,8% festgestellt. Darauf folgte eine nicht signifikante Reduktion von 1,9 %. Schließlich wurden verminderte Amplituden des ERG um 83,7 % aufgezeichnet, und am Ende des Washouts wurde eine BWA-Wiederfindung beobachtet, die nach 75 Minuten Perfusion mit Standardlösung zu einer nicht signifikanten Reduktion von 2,3 % führte.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Ihre ERG-Baseline im Auge zu behalten. Im Anschluss an dieses Verfahren können neuroprotektive oder anstößige Wirkstoffe getestet werden, um zusätzliche Fragen wie Toxizität nach seiner Entwicklung zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der XV mit Elektrophysiologie, um ERG-Veränderungen in einem standardisierten Modell zu untersuchen.