Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der DNA-in-situ-Hybridisierung heterochromatische Sequenzen auf mitotischen Chromosomen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gehirne von Drosophila-Larven im dritten Larvenstadium oder eines anderen gewünschten Gewebes disseziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Gewebe auf einem Deckglas zu fixieren.

Anschließend wird das Gewebe zwischen Deckglas und Objektträger plattiert. Um die Chromosomen für die Hybridisierung vorzubereiten, erfolgt im letzten Schritt die Hybridisierung kurzer synthetisierter Oligo-Proben mit dem plattierten Gewebe. Abschließend wird mittels Fluoreszenzmikroskopie die Lokalisation von Sequenzen, die komplementär zu den Oligo-Proben sind, auf den Chromosomen sichtbar gemacht.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden liegt in ihrer Einfachheit. Die meisten anderen Chromosomen- und C-two-Hybridisierungsmethoden beinhalten Wäschen mit großen Mengen Formamid, was kostspielig und umständlich sein kann. Unsere Methode erfordert keine Formamid-Wäschen und ist daher kostengünstiger, sauberer und schneller.

Obwohl diese Methode eine einfache Möglichkeit bietet, Sequenzen sichtbar auf den somatischen Chromosomen von Drosophila-Gehirnen abzubilden, kann sie auch zur Kartierung von Sequenzen auf anderen Arten von Chromosomen aus verschiedenen Geweben unterschiedlicher Organismen verwendet werden. Für jeden herzustellenden Objektträger bereiten Sie vier oder fünf Gewebeproben vor, jedoch nicht mehr bei Gehirndissektionen. Beginnen Sie damit, wandernde Larven im dritten Larvenstadium auszuwählen und sie in einem Tropfen 1× PBS zu sammeln.

Wählen Sie Probengefäße aus, die nicht überfüllt sind. Verwenden Sie unter dem Präparationsmikroskop feinste Pinzette, um die Mundhaken zu fassen, und ein weiteres Paar, um zwei Drittel der Körperlänge entlang zu greifen. Ziehen Sie dann vorsichtig an den Mundhaken, um das Gehirn, die ventrale Ganglien, die Speicheldrüsen und Teile des Verdauungstrakts freizulegen.

Als Nächstes das Gehirn und die ventralen Ganglien mit einer Pinzette von den übrigen Geweben lösen und in einen Tropfen XPBT auf einer Kunststoffplatte überführen. Für die Dissektion der Hoden sammeln Sie männliche, drei Tage alte Puppen. Drei Tage alte Puppen weisen gelbe Körper und rote Augen auf.

Diejenigen mit kleineren Flügelscheiden sind männlich. Halten Sie die Puppe mit einem Paar Pinzetten am oberen Ende des Abdomens in der Nähe des thorakalen Bereichs fest und greifen Sie mit einem zweiten Paar Pinzetten die distalste Spitze des Abdomens, ziehen Sie dann die tränentropfenförmigen Testes heraus.

Sie sind von Fettkörpern umgeben, die vorsichtig abgeschüttelt werden können; entfernen Sie alle äußeren Körperteile von den Hoden, um eine ordnungsgemäße Zerquetschung zu ermöglichen, und überführen Sie die Hoden in einen Tropfen 1× PBST auf einer sauberen Unterlage. Sobald das gesamte Gewebe gesammelt ist, behandeln Sie es mit einer hypotonen Lösung, um die Trennung der Schwesterchromatiden zu verbessern. In den e-chromatischen Regionen überführen Sie das Gewebe für 10 Minuten in einen Tropfen 0,5 %iger Natriumcitratlösung.

Um diesen Effekt zu erzielen, wird Kolchicin nicht empfohlen, da es Artefakte in der Chromosomenmorphologie verursachen kann. Fixieren Sie das Gewebe nun mit feinsten Pinzetten. Überführen Sie es in einen 20 µL großen Tropfen frisch hergestellter 2,5 %igen PFA-Lösung in 45 %iger Essigsäure auf einem sauberen, sigma-beschichteten Deckglas, verteilen Sie das Gewebe gleichmäßig im Fixansatz und inkubieren Sie es vier Minuten bei Raumtemperatur. Fahren Sie anschließend mit dem Zerquetschen der Deckgläser fort, indem Sie eine polylysinbeschichtete Objektträgerplatte vorsichtig mit der Unterseite auf das Gewebe und das Deckglas legen.

Lassen Sie das Deckglas an der Unterseite des Objektträgers haften, ohne es niederzudrücken. Das Behandeln von Deckgläsern mit Sigma-Beschichtung hilft sicherzustellen, dass das zerdrückte Gewebe nach dem Entfernen des Deckglases auf dem Objektträger verbleibt. In seltenen Fällen kann das Gewebe jedoch am Deckglas haften bleiben.

Während dieses Schritts empfehlen wir, mehrere Wiederholungen der Gewebepräparation durchzuführen. Drehen Sie nun das Objektträgerplättchen um und legen Sie es in ein gefaltetes Stück dickes Papier. Drücken Sie dann auf einer stabilen Unterlage mit dem Daumen fest senkrecht nach unten auf das Deckglas.

Drücken Sie nicht so fest, dass die Deckglasplatte verrutscht, da dies das Gewebe verwischen würde. In der Regel führt ein sehr kräftiges Andrücken zu gut sichtbaren Chromosomen im Präparat. Gelegentlich kann es jedoch zu einer Variabilität in der Chromosomenqualität kommen, beispielsweise unvollständige, zerquetschte oder fragmentierte Chromosomen.

Wir empfehlen daher erneut, zwei oder drei Replikate von Gewebepräparaten anzufertigen. Überführen Sie die Probe für einige Minuten auf einen Eisblock und tauchen Sie sie anschließend in flüssigen Stickstoff, bis das Sieden des Stickstoffs stoppt oder länger. Unmittelbar vor dem Auftauen des Gewebes entfernen Sie die Deckglasabdeckung, indem Sie mit einer frischen Rasierklinge eine Ecke des Deckglases anheben. Auf diese Weise wird das Deckglas entfernt.

Vermeiden Sie sorgfältig, das Gewebe zu verkratzen. Legen Sie die Objektträger anschließend schnell in ein Coplin-Gefäß, das mit 100 % Ethanol gefüllt ist, und lassen Sie sie mindestens fünf Minuten lang einweichen. Nehmen Sie den Objektträger heraus, wischen Sie überschüssiges Ethanol ab, ohne das Gewebe zu berühren, und lassen Sie den Objektträger eine Stunde lang an der Luft trocknen.

Die Objektträger können anschließend wochen- bis monatelang in einer Trockenkammer aufbewahrt werden. Geben Sie zunächst 100 Nanogramm jeder Sonde zu 20 Mikroliter 1,1 x Hybridisierungspuffer, um eine 22-Mikroliter-Lösung mit 1 x Hybridisierungspuffer zu erhalten. Pipettieren Sie dann die Mischung auf das fixierte Gewebe, wobei das Gewebe unberührt bleibt, und setzen Sie vorsichtig ein Deckglas auf.

Eine kleine Luftblase, die das Gewebe nicht berührt, verursacht keine Probleme, aber bei weiteren Blasen sollte das Deckglas erneut aufgebracht werden. Stellen Sie den Objektträger auf die flache Seite eines Wärmeblocks mit 95 Grad Celsius und bedecken Sie ihn mit Folie. Warten Sie fünf Minuten, in denen Sie die Feuchtigkeitskammer vorbereiten können, indem Sie feuchte Papiertücher in eine Pipettenspitzenbox geben.

Entfernen Sie dann den Objektträger. Wickeln Sie den Objektträger vorsichtig in gespanntes Parafilm ein und überführen Sie ihn in eine befeuchtete Kammer, die aus einem feuchten Tuch in einer Spitzenbox besteht. Inkubieren Sie den Objektträger in der Kammer vier Stunden bis über Nacht bei 30 Grad Celsius. Diese Temperatur eignet sich gut für Sonden mit niedrigem GC-Gehalt; für Sonden mit höherem GC-Gehalt sind jedoch möglicherweise einige Optimierungen der Hybridisierungstemperatur erforderlich.

Nach der Inkubation vorsichtig die Parafolie entfernen und die Deckgläschen vorsichtig an einer Ecke anheben. Anschließend den Objektträger dreimal für jeweils 15 Minuten in 0,1 XSSC-Puffer waschen. Während der Waschschritte das Gefäß mit Aluminiumfolie abdecken, um die Lichteinwirkung zu minimieren.

Für lange biotinylierte Sonden fügen Sie zunächst Rod-Domäne-Avadon hinzu und waschen Sie, bevor Sie fortfahren. Trocknen Sie zunächst den Bereich um das Gewebe herum und bedecken Sie das Gewebe mit 100 Mikroliter Blockierungslösung. Bringen Sie dann vorsichtig eine neue Deckglasabdeckung auf, ohne Blasen einzuschließen.

Erneut die Objektträger mit Parafilm abdecken. Anschließend den Objektträger 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach die Deckglas entfernen und das Gewebe mit einem Tuch vorsichtig abtupfen.

Danach 100 Mikroliter einer 1:1000 verdünnten Ruminen-Avadon-Lösung in SBT auf das Gewebe auftragen. Anschließend abdecken, einwickeln und die Probe genauso wie bei der Blockierung inkubieren. Zum Schluss vorsichtig den Deckglaser entfernen und den Objektträger waschen.

Führen Sie drei Waschschritte in vierfachem SSC-T und anschließend drei Waschschritte in 0,1fachem SSC durch. Jeder Waschschritt sollte mindestens fünf Minuten dauern. Fahren Sie mit dem Protokoll fort, indem Sie die Objektträger vorsichtig durch Abtupfen des überschüssigen Puffers trocknen, ohne das Gewebe zu berühren.

Danach die Objektträger mit der Gewebeseite nach oben an einem dunklen Ort für 10 bis 15 Minuten liegen lassen oder bis die Feuchtigkeit vollständig verdunstet ist. Nun den Objektträger mit 11 µL Vector Shield mit DAPI abdecken und vorsichtig eine nicht sigma-beschichtete Deckglasplatte auflegen. Falls das Medium nicht alle Kanten erreicht, noch einige zusätzliche Mikroliter Medium am Rand auftragen und überschüssiges Medium abwischen.

Danach den Deckel mit Nagellack versiegeln und den Objektträger aufrecht an einem dunklen Ort lagern, während der Nagellack trocknet, was normalerweise mindestens eine halbe Stunde dauert. Anschließend den Objektträger bei minus 20 Grad Celsius bis zu einer Woche lang aufbewahren und das Gewebe so bald wie möglich abbilden. Eine Reihe kleiner, kommerziell synthetisierter Oligos mit fluoreszenten Konjugaten sowie eine längere biotinylierte Sonde, hergestellt mittels Nick-Translation, wurden alle an Chromosomen aus mehreren verschiedenen Gewebetypen hybridisiert.

Mithilfe der beschriebenen Methodik erkannte die Sonde für die 359 Basenpaar lange Satellitensequenz von Drosophila Melanogaster einen großen, mehrere Megabasenpaare umfassenden Block auf dem X-Chromosom sowie eine deutlich kleinere Region auf Chromosom drei. Eine längere Sonde gegen den Responder-Satelliten detektierte Wiederholungsblöcke mit relativ geringer Kopienzahl von etwa 700. Somit ermöglicht diese Methode die Visualisierung sehr kleiner Satellitenblöcke.

Wenn der Behandlungsschritt mit der hypotonen Lösung auf 10 Minuten verdoppelt wurde, nahm die Trennung der Schwesterchromatiden zu. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden wie der Antikörperfärbung kombiniert werden, um Fragen zu beantworten, ob bestimmte Chromatinproteine an spezifische Sequenzen lokalisiert sind.