Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA In-situ- Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mittels DNA-in-situ-Hybridisierung heterochromatische Sequenzen auf mitotische Chromosomen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zuerst die Gehirne von Larven der dritten in Sterndrosophila oder eines anderen Gewebes von Interesse präpariert werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Taschentuch auf einem Deckglas zu fixieren.

Als nächstes wird das Gewebe zwischen dem Deckglas und einem Objektträger gequetscht. Um die Chromosomen für die Hybridisierung vorzubereiten, besteht der letzte Schritt darin, kurze synthetisierte Oligosonden mit dem gequetschten Gewebe zu hybridisieren. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Lokalisierung von Sequenzen zu zeigen, die zu den Oligosonden auf den Chromosomen komplementär sind.

Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden ist ihre Einfachheit. Die meisten anderen Chromosomen- und C-Zwei-Hybridisierungsmethoden beinhalten Waschungen mit großen Mengen an Formamid, was teuer und chaotisch sein kann. Unsere Methode erfordert keine Formular-IDE-Waschungen, was sie zu einer billigeren, saubereren und schnelleren Technik macht.

Obwohl diese Methode eine einfache Möglichkeit bietet, Sequenzen auf den somatischen Chromosomen von Drosophila-Gehirnen sichtbar zu kartieren, kann sie auch verwendet werden, um Sequenzen auf anderen Chromosomentypen aus verschiedenen Geweben in den verschiedenen Organismen zu kartieren. Bereiten Sie für jeden Objektträger, der hergestellt werden soll, vier oder fünf Gewebe vor, aber nicht mehr für Hirndissektionen. Beginne damit, wandernde Larven des dritten Stadiums auszuwählen und sie in einem Tropfen von einem XPBS zu sammeln.

Wählen Sie Fläschchen zum Sammeln, die nicht überfüllt sind. Verwenden Sie unter dem Sezierbereich eine ultrafeine Pinzette, um die Mundhaken zu greifen, und ein weiteres Paar, um zwei Drittel der Länge des Körpers zu greifen. Ziehen Sie dann vorsichtig an den Mundhaken, um das Gehirn, die ventralen Ganglien, die Speicheldrüsen und Teile des Verdauungstrakts freizulegen.

Als nächstes zupfen Sie das Gehirn und die ventralen Ganglien von den anderen Geweben weg und übertragen sie in ein Tröpfchen mit einem XPBT auf einer Plastikplatte. Für nasia hodendissektionen sammeln männliche drei Tage alte puy. Drei Tage alte Puy haben gelbe Körper und rote Augen.

Diejenigen mit kleineren Flügelpolstern sind männlich. Fassen Sie die Puppe am oberen Ende des Bauches in der Nähe der Brustregion mit einer Pinzette und mit einer zweiten Pinzette. Fassen Sie die ganz distale Spitze des Bauches und ziehen Sie dann die tropfenförmigen Hoden heraus.

Sie sind von Fettkörpern umgeben, die sanft abgeschüttelt werden können, alle äußeren Körperteile von den Hoden lösen, was ein richtiges Quetschen verhindert, und die Hoden auf einen Tropfen von einem XPBT auf einer sauberen Platte übertragen. Sobald alle Gewebe gesammelt sind, behandeln Sie sie mit einer hypotonen Lösung, um die Trennung der Schwesterchromatiden zu verbessern. Übertragen Sie das Gewebe in den e-chromatischen Bereichen für 10 Minuten auf einen Tropfen 0,5%Natriumcitrat.

Um diesen Effekt zu erzielen, wird Colchicin nicht empfohlen, da es Artefakte in der Chromosomenmorphologie verursachen kann. Fixieren Sie nun die Taschentücher mit einer ultrafeinen Pinzette. Übertragen Sie sie in einen 20-Mikroliter-Tropfen frisch hergestellten 2,5 % PFA in 45 % Essigsäure auf einen sauberen, mit Sigma Coat behandelten Deckblatt, verteilen Sie die Gewebe gleichmäßig im Fixiermittel und inkubieren Sie sie vier Minuten lang bei Raumtemperatur. Fahren Sie dann mit dem Zerdrücken der Deckgläser fort. Legen Sie zunächst einen mit Polylysin beschichteten Objektträger leicht mit der bedruckten Fläche nach unten auf das Gewebe und den Deckblatt.

Lassen Sie den Deckglas an der Unterseite des Objektträgers haften, ohne zu drücken. Behandelnd. Deckgläser mit Sigma-Beschichtung tragen dazu bei, dass das Kürbisgewebe nach dem Entfernen des Deckglases auf dem Objektträger verbleibt. In seltenen Fällen konnte das Gewebe jedoch am Deckglas haften bleiben.

Während dieses Schritts empfehlen wir, replizierte Gewebequetschungen durchzuführen. Drehen Sie nun die Folie um und legen Sie sie in ein gefaltetes Stück dickes Papier. Drücken Sie dann auf einem stabilen Untergrund mit dem Daumen sehr fest gerade nach unten über den Deckglas.

Drücken Sie nicht so, dass die Abdeckung verrutscht, da sonst das Taschentuch verschmiert wird. Eine sehr feste Pressung führt in der Regel zu gut aufgelösten Chromosomen im Kürbisgewebe. Gelegentlich kann es jedoch zu Schwankungen in der Chromosomenqualität kommen, z. B. zu unvollständigen, gequetschten oder fragmentierten Chromosomen.

Auch hier empfehlen wir also, zwei oder drei replizierte Gewebequetschungen durchzuführen. Übertragen Sie die Baugruppe für einige Minuten auf einen Eisblock und tauchen Sie sie dann in flüssigen Stickstoff, bis der Stickstoff aufhört zu sieden oder länger. Nachdem Sie den Objektträger unmittelbar vor dem Auftauen des Gewebes entfernt haben, verwenden Sie eine frische Rasierklinge, um eine Ecke des Deckglases nach oben zu schnippen. Damit wird es entfernt.

Achten Sie darauf, dass Sie das Taschentuch nicht zerkratzen. Geben Sie dann den Objektträger schnell in ein mit 100%igem Ethanol gefülltes Coplin-Glas und lassen Sie es mindestens fünf Minuten einweichen. Entfernen Sie den Objektträger, leiten Sie überschüssiges Ethanol ab, ohne das Taschentuch zu berühren, und lassen Sie den Objektträger eine Stunde lang an der Luft trocknen.

Die Objektträger können dann über Wochen bis Monate in einer Trocknungskammer gelagert werden. Beginnen Sie mit der Zugabe von 100 Nanogramm jeder Sonde zu 20 Mikrolitern 1,1 x Hybridisierungspuffer für eine 22 Mikroliter Lösung von einem x Hybridisierungspuffer. Pipettieren Sie dann die Mischung auf das fixierte Gewebe, lassen Sie das Gewebe unberührt und tragen Sie vorsichtig einen Deckschirm auf.

Eine kleine Luftblase, die nicht mit dem Gewebe in Berührung kommt, stellt keine Probleme dar, aber weitere Blasen rechtfertigen das erneute Anbringen des Deckglases. Legen Sie die Folie auf die flache Seite eines 95 Grad Celsius heißen Blocks, und decken Sie sie mit Folie ab. Warten Sie fünf Minuten, in denen Sie die Feuchtigkeitskammer vorbereiten können, indem Sie nasse Papiertücher in eine Trinkgelddose geben.

Entfernen Sie dann die Folie. Wickeln Sie den Objektträger vorsichtig in gedehntes Paraform ein und geben Sie ihn in eine befeuchtete Kammer, die aus einem feuchten Handtuch besteht. Inkubieren Sie den Objektträger in einer Tippbox vier Stunden lang in der Kammer bis über Nacht bei 30 Grad Celsius. Diese Temperatur eignet sich gut für Sonden mit niedrigem GC-Gehalt, aber für Sonden mit höherem GC-Gehalt kann eine Fehlerbehebung bei Hybridisierungstemperaturen erforderlich sein.

Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig die Para-Folie und heben Sie den Deckglas langsam um eine Ecke an. Waschen Sie dann die Folie dreimal in 0,1 XSSC Puffer für 15 Minuten pro Waschgang. Decken Sie das Glas während des Waschgangs mit Folie ab, um die Lichteinwirkung zu minimieren.

Für lange biotinylierte Sonden fügen Sie Rod Dome Avadon hinzu und waschen Sie, bevor Sie fortfahren. Trocknen Sie zunächst den Bereich um das Gewebe herum und bedecken Sie das Gewebe mit 100 Mikrolitern Blockierungslösung. Tragen Sie dann vorsichtig einen neuen Deckslip auf, ohne Blasen einzuschließen.

Umschließen Sie die Folie erneut mit param. Dann inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Zweitens entfernen Sie nach der Inkubation den Deckglas und tupfen Sie das Gewebe mit einem Tuch ab.

Tragen Sie dann 100 Mikroliter eines bis 1000 Pansen Avadon in SBT verdünnt auf das Taschentuch auf. Anschließend wird die Folie abgedeckt, eingewickelt und inkubiert, wie es mit dem Block geschehen ist. Entfernen Sie zum Schluss vorsichtig den Eindeckbezug und waschen Sie den Objektträger.

Verwenden Sie drei Waschgänge in vier x SSCs T, gefolgt von drei Waschgängen in 0,1 XSSC. Jeder Waschschritt sollte mindestens fünf Minuten lang sein. Fahren Sie mit dem Protokoll fort und trocknen Sie die Objektträger, indem Sie den überschüssigen Puffer abtupfen, ohne das Gewebe zu berühren.

Legen Sie dann das Objektträgergewebe mit der Seite nach oben für 10 bis 15 Minuten an einen dunklen Ort oder bis die Feuchtigkeit vollständig verschwunden ist. Montieren Sie nun den Objektträger mit 11 Mikrolitern Vektorschild mit DPI und senken Sie ihn vorsichtig auf einen nicht Sigma-beschichteten Deckschirm ab. Wenn das Medium nicht alle Ränder erreicht, tragen Sie noch einige Mikroliter Medium vom Rand auf und wischen Sie überschüssiges Medium ab.

Versiegeln Sie dann den Deckglas mit Nagellack und lagern Sie den Objektträger aufrecht an einem dunklen Ort, während der Nagellack trocknet, was in der Regel mindestens eine halbe Stunde dauert. Lagern Sie den Objektträger dann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius und bilden Sie das Gewebe so schnell wie möglich ab. Ein Satz kleiner, kommerziell synthetisierter Oligos mit fluoreszierenden Konjugaten und eine längere biotinylierte Sonde von Nick Translation wurden alle mit Chromosomen aus verschiedenen Gewebetypen hybridisiert.

Mit der beschriebenen Methodik erkannte die Sonde zur Basenpaar-Satellitenwiederholung von Drosophila Melanogaster 359 einen großen Block aus mehreren Megabasenpaaren auf dem x und eine viel kleinere Region auf Chromosom drei. Eine längere Sonde gegen den Responder-Satelliten entdeckte Wiederholungsblöcke, die aus relativ geringen Wiederholungskopien von etwa 700 bestanden. Somit ermöglicht diese Methode die Visualisierung von sehr kleinen Satellitenblöcken.

Wenn der Behandlungsschritt der hypotonen Lösung auf 10 Minuten verdoppelt wurde, nahm die Trennung der Schwesterchromatiden nach Osten zu. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden, wie z.B. der Antikörperfärbung, gekoppelt werden, um Fragen zu beantworten, wie z.B. ob bestimmte Chromatinproteine in bestimmten Sequenzen lokalisiert sind.