Name: Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA In-situ- Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Lernen Sie eine einfache Methode zur Fluoreszenz-DNA-in-situ-Hybridisierung an gepressten Chromosomen von Drosophila-Larven. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung heterochromatischer Sequenzen mit minimalen Reagenzien.

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Wir danken Zhaohua Irene Tang vom W. M. Keck Science Department für die Nutzung ihres Epifluoreszenzmikroskops und dem Werren-Labor für die Spende von Nasonia für Sezierungen. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein NIH-NRSA-Stipendium (5F32GM105317-02) für AML unterstützt.

1. Die Gewebe Dissection und Fixation (60 min) <ol><li> Für Drosophila Gehirn legen 3. Larvenstadium in einem Tropfen 1x PBS (phosphatgepufferte Salzlösung). Wählen Sie große 3. Larvenstadium, die aktiv kriechen aus Ampullen oder Flaschen, die nicht überfüllt sind. <ol><li> Verwenden Sie einen ultrafeinen Pinzettenpaar zu halten den Mund Haken und andere Pinzettenpaar zu greifen zwei Drittel über die gesamte Länge des Körpers (1A, B) zu greifen. Ziehen Sie vorsichtig an den Mund Haken, um das Gehirn, ventralen Ganglien, Speicheldrüsen und ein Teil der Larvenverdauungstrakt aus. Mit der Pinzette, um das Gehirn und ventralen ganglia trennen (1A, B) von den anderen Geweben und in einem Tröpfchen 1x PBT (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Tween) auf einer Kunststoff-Petriplatte. </li></ol></li><li> Für Nasonia Hoden Dissektionen, wählen Männchen 3 Tage alten Puppen (gelber Körper mit roten Augen). Männlich Nasonia haben kleine Flügelblocklängen in Bezug auf females im Puppenstadium (1C). <ol><li> Halten Sie die Puppe an der Spitze des Bauches in der Nähe des Brustbereich mit einer Pinzette Paar, und mit dem anderen Paar Pinzette, greifen die sehr distalen Spitze des Bauches, und ziehen Sie die tropfenförmigen Hoden (sie werden von Fett umgeben sein Körper, die leicht geschüttelt werden kann weg; 1D). Trennen Sie alle Karosserieaußenteile aus den Hoden, die richtige Quetschen, und in einem Tropfen 1x PBT auf einer Kunststoffpetrischale verhindert. </li></ol></li><li> Für jede Folie, sezieren insgesamt vier oder fünf Gewebeproben (dh., Drosophila Larven Gehirn oder Nasonia Hoden). HINWEIS: Mehr als fünf Proben werden überfüllt Kerne und Chromosomen führen. </li><li> Optional, einige Trennung von Schwesterchromatiden in euchromatischen Regionen der mitotischen Chromosomen erreichen, behandeln das Gewebe mit einer hypotonischen Lösung: Transfer Gehirne von 1x PBT einem Rückgang von 0,5% Natriumcitrat 5-10 (nicht mehr als 10) min. HINWEIS: Colchicin (a Mitoseinhibitor) kann hilfreich für die Erhöhung der Anzahl von Mitosen auf Metaphase 11 sein. Jedoch ist seine Verwendung nicht erforderlich, wenn sehr große gesunde Larven werden verwendet, und sogar unerwünscht, da sie sich negativ auf das Chromosom Auflösung, Ausbreiten und Morphologie. </li><li> Platzieren eines Tröpfchens (~ 20 &amp; mgr; l) der Fixierungslösung (2,5% Paraformaldehyd in 45% Essigsäure) auf die Oberfläche einer sauberen Sigmacote behandelten Deckgläschen. HINWEIS: Stellen Sie Fixierlösung frisch für jeden Tag der Nutzung. Fixative Lösungen, die 1,8 bis 3,7% Paraformaldehyd in 45% Essigsäure die besten Ergebnisse für die Fische. Die Verwendung anderer als Verstand oder Hoden Gewebe oder Anpassung dieses Protokoll für Immuno-FISH kann verlangen, das Experimentieren mit verschiedenen Fixiermitteln (für eine Liste von verschiedenen Fixiermittel, siehe 12). </li><li> Jede Gewebeprobe aus dem Seziersaal Puffers (1x PBT) vorsichtig in die Fixierungstropfens über mit ultrafeinen Pinzette, minimizing die Übertragung von Sezieren Puffer in die Fixierlösung. Positionieren der Gewebeproben, so dass sie gleichmäßig voneinander im Fixiermittel Tröpfchen beabstandet. Das Gewebe in Fixativ Inkubieren für 4 min bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig ein Poly-Lysin-beschichteten Objektträger nach unten, auf das Gewebe und Deckglas. Nicht nach unten drücken zu diesem Zeitpunkt nicht, sondern ermöglichen die beiden auf die leichte Schulter zu kontaktieren, damit das Deckglas klebt an der Unterseite des Schlittens. Kehren Sie die Rutsche so dass das Deckglas nach oben zeigt. </li><li> Sandwich die Folie / Gewebe / Deckglas in einem gefalteten Stück Filterpapier. Auf eine stabile Oberfläche, mit dem Daumen drücken ganz fest gerade nach unten auf die Position direkt über dem Deckglas. Achten Sie darauf, seitliche Verrutschen des Deckglases (dies führt dazu, dass ein Verschmieren des Gewebes). </li><li> Tauchen Sie den Schiebe / Gewebe / Deckglas in flüssigen Stickstoff (siehe Gerät in 1E, F), und stehen lassen, bis die Stickstoff stoppt Kochen (mehr ist fin). Entfernen Sie die Folie und sofort abknicken das Deckglas mit einer frischen Rasierklinge über einen Schiebe Ecke des Deckglas nach oben (nicht zerkratzt fixiertem Gewebe mit der Rasierklinge). <ol><li> Vorkühlung des Schiebe- / Gewebe / Deckglas auf einem Block von Trockeneis, Abdeckung nach oben rutschen, für 1-2 Minuten vor dem Eintauchen in flüssigen Stickstoff wird verhindert, dass die Folien vor dem Knacken. </li></ol></li><li> Sofort den Objektträger mit Gewebe in eine Coplin-Gefäß mit 100% Ethanol bei Raumtemperatur gefüllt und lassen Sie stehen für mindestens 5 min (diese Zeit kann länger sein, wenn erforderlich). HINWEIS: kaltem 100% Ethanol ebenfalls verwendet werden könnten. </li><li> Entfernen Sie die Folie mit dem Gewebe, Docht überschüssige Ethanol mit einem Kimwipe (ohne Berührung der festen Gewebe), und lassen Sie die Folie an der Luft trocknen für 1 Stunde. <ol><li> Gehen Sie direkt zu Schritt 2 oder Folien halten trocken in geringer Luftfeuchtigkeit Luft oder in einer Trocknungskammer für Wochen, sogar Monate vor der Durchführung der Hybridisierung. </li></ol></li></ol> Abbildung 1: (A) A 3. Larvenstadium Drosophila Larve (rechts), mit Positionen, wo die Mundhaken greifen angezeigt (gekennzeichnet mit *) und 2/3 der Weg nach unten die Larven Gehirn sezieren; (Links) eine schematische Darstellung einer Larve eine der gleichen Entwicklungsstufe, der Darstellung der relativen Position des Gehirns im Larvenkopf. (B) Das Gehirn und ventralen Ganglien von einem 3. Larvenstadium Drosophila Larve (rechts) und eine schematische Darstellung dieses seziert Gewebe (links). (C) 3 Tage alten Nasonia Puppe an der Gelbkörper-Rote-Augen-Bühne. (D) Ein Paar Hoden von einem 3 Tage alten Nasonia männlichen Puppe (rechts) seziert mit Positionen anzeigt, wo die Puppe greifen am hinteren Teil des Abdomens (bezeichnet mit einem *) und in der Mitte auf dem Körper; (Links) Schema, männlich und weiblich warp Puppen; männliche Puppen durch Flügel, die nicht an der sagittalen Profil (schwarzer Pfeil) erstrecken, im Gegensatz zu den Weibchen, die Flügel, die hinter dem Profil erstrecken unterschieden werden; die relative Position des Hodens Paar wird im männlichen Puppe (E) Das Gerät-ein String von Büroklammern-und (F) Verfahren verwendet werden, um Folien in einem Behälter mit flüssigem Stickstoff getaucht gezeigt.. Mehrere Büroklammer-Strings können zur gleichzeitigen Eintauchen der mehrere Folien verwendet werden. 2. In situ-Hybridisierung (30 min am Tag 1; 1 h &amp; ndash; 2,5 h bei langen Sonden-am Tag 2) <ol><li> 1 ul (100 ng) jeder Sonde zu 20 ul 1,1x Hybridisierungspuffer. Pipettensonde / Hybridisierungspuffer auf die Oberfläche der festen Gewebe (berühren Sie nicht die Gewebe). </li><li> Vorsichtig ein Deckglas direkt auf die Sonde / Hybridisierungspuffer, um sicherzustellen, dass das Deckglas wird direkt über das Gewebe zentriert. Der Puffer sollte die Migration zu thE äußeren Rand des Deckglases, so dass keine Luftblasen. HINWEIS: Kleine Blasen, die nicht in Verbindung treten Gewebe keine Probleme mit dem Verfahren stellen. Entfernen Sie große Blasen durch vorsichtiges Anheben einer Ecke des Deckglases und sorgfältig fallen sie zurück auf die Folie. </li><li> Legen Sie das Dia / Gewebe / Deckglas auf die Oberfläche eines Blocks zu 95 ° C vorgewärmt (Deckglas nach oben). Deckel mit einem großen Stück Alufolie auf Belichtung zu verhindern. Lassen der Schieber Inkubieren bei 95 ° C für 5 min. HINWEIS: Eine typische Wärmeblock mit Bohrungen für Rohre können umgedreht werden, um eine ebene Fläche, auf der die Folie / Gewebe / Deckglas legen werden. </li><li> Entfernen Sie die Folie und lassen ihn etwas abkühlen lassen, bis es warm anfühlen wird. Ein Stück Parafilm gestreckt sorgfältig einzuwickeln um das Deckglas, um die Flüssigkeit unter ihm zu versiegeln. </li><li> Das verschlossene Rutsche in einer feuchten Kammer und legen Sie die Kammer in einem Inkubator auf 30 ° C vorgewärmt. Inkubiere bei 30 ° C für 4 h bis über Nacht.<ol><li> Erstellen Sie eine Feuchtigkeitskammer von einer leeren Spitze Box oder Deckeltupperdose mit angefeuchteten Kimwipes oder Papiertücher an der Unterseite angebracht. HINWEIS: Einzelstrang-DNA-Oligo-Sonden wurden für 28-33 Basen, um eine theoretische Schmelztemperatur (T m) von 45-47 ° C zu erreichen. Diese Länge und T m Bereiche spiegeln die Tatsache wider, dass viele repetitive Sequenzen, die wir studiert haben, sind AT-reichen und damit sehr niedrige GC-Gehalt. Längere Sonden werden wahrscheinlich höhere T m -Werte; Diese können erhöhte Hintergrund-Hybridisierung auf dem Standard-Hybridisierungstemperatur von 30 ° C führen. So können einige Fehlersuche mit Hybridisierungstemperaturen erforderlich, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Um die beste Hybridisierungstemperatur, Zunahme (oder Abnahme) die Temperatur um 5 ° C zu finden, inkrementell. </li></ol></li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Parafilm von der Folie und dann vorsichtig die Deckglas durch langsames Anheben einer Ecke. Wash der Schlitten drei Mal für je 15 min in 0,1 × SSC Waschpuffer. Decken Sie die Coplin-Gefäß mit Aluminiumfolie in den Waschanlagen, um Belichtung zu minimieren. </li><li> Wenn nicht mit einem langen biotinylierte Sonde, fahren Sie mit Schritt 2.8. <ol><li> Wenn Sie eine lange biotinylierte Sonde, trocknen Sie den Bereich um das Gewebe mit einer Kimwipe, man aufpassen, das Gewebe selbst nicht zu berühren. Zeigen 100 l Blocking-Lösung über das Gewebe und die Abdeckung vorsichtig mit einem Deckglas, wobei darauf zu Fangblasen zu vermeiden. Wickeln Sie die Folie über das Deckglas mit Parafilm und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und tupfen um das Gewebe mit einer Kimwipe. Je 100 &amp; mgr; l von Rhodamin-Avidin, 1: 1000 in SBT über das Gewebe und die Abdeckung vorsichtig mit einem Deckglas, wobei darauf zu achten Fangblasen. Wickeln Sie die Folie über das Deckglas mit Parafilm und bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und waschen Sie die Folie 3 Mal für jeweils 5 min in 4x SSCT- und dann3-mal für jeweils 5 min in 0,1 x SSC. HINWEIS: Folien können für längere Zeiträume gewaschen werden. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Folie und tupfen um das Gewebe mit einem trockenen Kimwipe um überschüssige Puffer zu entfernen (berühren Sie nicht die Gewebe). Stellen Sie den Schiebegewebeseite nach oben an einem dunklen Ort für 10-15 Minuten oder bis die Feuchtigkeit vollständig verflüchtigt. </li><li> Pipette 11 ul Vectashield Befestigungsmediums (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol-DAPI) auf das Gewebe. Vorsichtig ein sauberes Deckglas (nicht mit Sigmacote behandelt) direkt über der Mitte des Montagemedium und Gewebe. Die Einschlussmittel sollte langsam nach außen zu den Kanten des Deckglases zu migrieren. HINWEIS: Wenn die Montagemedium ausfällt, um die Kante des Deckglases an allen Seiten zu erreichen, wird eine zusätzliche 1-2 ul Befestigungsmedium kann mit einer Position am Rand des Deckglases aufgebracht, um in der benötigten Volumen füllen. In diesem Fall müssen Sie wischen Sie überschüssiges Medium aus der Gleitfläche vorAbdichtung. </li><li> Seal die Ränder des Deckglases mit Nagellack. Vermeiden Sie die Malerei der Nagellack über die Gewebeprobe. </li><li> Den Objektträger aufrecht an einem dunklen Ort und lassen Sie den trockenen Nagellack bis zur vollständigen Fest (in der Regel 30 Minuten oder mehr). An dieser Stelle Bild das Gewebe oder bei -20 ° C für bis zu 1 Woche für die spätere Bildgebung. </li></ol> Buffer / Lösung Rezepte 10x PBS <ul><li> 80 g NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH auf 7,4, H 2 O auf 1 l </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml 10x PBS </li><li> 45 ml H 2 O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g NaCl </li><li> 88,2 g Na-Citrat </li><li> in 800 ml H 2 O </li><li> pH-Wert auf 7, H 2 O auf 1 l </li></ul> 4x SSCT- <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H 2 O </li></ul> Hybridisierungsmischung (20 &amp; mgr; l; ab 11 modifiziert) <ul><li> 10 ul Formamid </li><li> 4 ul 50% Dextransulfat </li><li> 2 ul 20x SSC </li><li> 4 &amp; mgr; l H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g Rinderserumalbumin (BSA) </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 7,9 ml H 2 O </li></ul> Blockierungslösung 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 ul Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml H 2 O </li></ul> Fixierlösung mit Paraformaldehyd (1 ml) <ul><li> 393,75 ul H 2 O (Wasser hinzufügen zuerst) </li><li> 450 ul Eisessig </li><li> 156,25 &amp; mgr; l 16% igem Paraformaldehyd </li></ul>

<ol><li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
<li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li>
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<li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234(2009).</li>
<li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+l%281%29zw10+gene+product%2C+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation%2C+is+redistributed+at+anaphase+onset%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li>
<li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li>
<li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSR+%28paternal+sex+ratio%29+chromosomes%3A+the+ultimate+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen konkurrierenden finanziellen oder sonstigen Interessenkonflikt haben.

DNA ISH wird häufig verwendet, um spezifische Sequenzen auf Chromosomen kartieren. Wir haben ein einfaches Verfahren zur DNA ISH für hohe Kopienzahl, hetero Sequenzen optimiert beschrieben. Anstatt mit Waschungen in einem Formamid-Lösung, die eine Anforderung in anderen vorhandenen DNA ISH Protokolle ist, legen wir gewebe Dias direkt auf einen vorgeheizten Block an DNA zu denaturieren. Dieses Verfahren umgeht die Verwendung von großen Mengen an Formamid. Ein wichtiger Schritt für die Herstellung von klaren Hybridisierun...

DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Sonden an einzelne Kopie Regionen innerhalb Euchromatin kann durch eine Handvoll von Ansätzen, darunter Nick-Translation oder Endmarkierung langer DNA-Produkte 1,2 und den Einbau von deoxygenin (DIG) -attached Nukleotide und ihre Anerkennung durch eine Vielzahl von erzeugt werden Gruppe-konjugierte Antikörper 1-3. Visualisierung der euchromatischen Sequenzen in wenigen oder einzelnen Kopienzahl erfordert die Verwendung von entweder einzelne große Sonden mit hoher spezifischer Aktivität oder einen Cocktail aus mehreren, kleineren Sonden, die gemeinsam zu verbessern Signal. Im Gegensatz dazu hoch repetitive Sequenzen in heterochromatin gefunden, wie Satelliten-DNAs, sind leichter Ziele für DNA ISH weil sie existieren normalerweise als zehn bis Tausende von Wiederholungen im einzelnen Chromosomenregionen als Blöcke bekannt geclustert. Transposons können auchbei hohen Kopienzahlen an bestimmten chromosomalen Loci 2 gefunden. In diesen Fällen können einzelne Sonden mit geringer spezifischer Aktivität effektiv beschriften hetero Sequenzen aufgrund ihrer Hybridisierung an mehreren Standorten. Sonden an repetitive Sequenzen können im Handel als kurze Oligonukleotide (30-50 bp) synthetisiert und mit einer der mehreren verschiedenen fluoreszierenden Gruppen chemisch konjugiert. Mapping repetitiven Sequenzen im Heterochromatin durch Verwendung genom Sequenziertechnologien ist schwierig aufgrund der Herausforderungen im Gebäude Gerüste in stark repetitiven Satelliten Blöcke 4-6,7 gestoßen. Derzeit steht ISH als die effektivste Möglichkeit, die Zuordnung dieser Sequenzen am Unterchromosomenebene. Diese Strategie ist wichtig für die Zuordnung einer großen Anzahl von repetitiven Sequenzen, die von laufenden Genom und Transkriptom-Sequenzierung Studien aufgedeckt werden. Die Effizienz und einfache Zuordnung repetitiven Sequenzen auf Objektträger angebrachten Chromosomen würde gre werdenatly durch ein vereinfachtes Protokoll für DNA ISH verbessert. So können bereits vorhandene Protokolle für DNA ISH beinhalten mehrere Wäschen hybridisiert Gewebe in Formamid-Lösung 2,8, somit im wesentlichen auf die erforderliche Zeit für die Zuordnung von Sequenzen hinzufügen und auch große Mengen chemischen Abfalls für diese teuren Reagenz. Hier beschreiben wir eine geänderte DNA ISH Verfahren, das die Notwendigkeit für Formamid Wäschen umgeht und setzt grundlegende Laborgeräten und Reagenzien. Dieses Verfahren wurde ursprünglich für die rasche Kartierung hoch repetitive DNA-Sequenzen in heterochromatischen Regionen Drosophila Larvenneuroblasten mit handels synthetisierte Oligonukleotide, die mit Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert sind entworfen. Allerdings funktioniert diese Methode auch für die Abbildung repetitiven Sequenzen durch den Einsatz größerer Sonden durch andere Mittel 9,10 und über mehrere verschiedene Gewebe und Chromosomentypen synthetisiert. Zusätzlich kann dieses Verfahren verwendet werden, um euchromatic Sequenzen mithilfe länger oder multip abzubildenle, kurze Sonden innerhalb der euchromatischen Sequenz von Interesse.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger (es können auch normale Objektträger verwendet werden)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafeine Pinzette (5 Gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Deckgläser</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-behandelt durch Eintauchen für 15 Sekunden, trocken tupfen und alle Spuren von Sigmacote abwischen, so dass das Deckglas klar ist</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Filterpapier</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffinwachspapier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Heizblock mit Thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Trockenbrutkasten</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Rasierklingen</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Feuchtigkeitskammer</td><td></td><td></td>, <td>leere Pipettenspitzenbox oder Tupperware, ausgekleidet mit angefeuchteten Papiertüchern oder Kimwipes,</td></tr><tr><td>Coplin-Gläsern</td><td></td><td></td><td>mit Gleitrillen,</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Pasteurpipetten</td><td></td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>1,5 ml, Mikrofugeröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Nagellack</td><td></td><td></td>, <td>klare oder farbige</td></tr><tr><td>P20-Mikropipette und Kunststoffspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Büroklammern</td><td></td><td></td>, <td>20 - 25 Standard-Büroklammern aus Metall, die zu einer Form verbunden sind. chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagenzien</td></tr><tr><td>16% EM-Qualität Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie-Reagenzien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemische Qualität</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kommerziell synthetisierte, fluoreszenzmarkierte Oligos</td></tr><tr><td>Lange biotinylierte Sonde</td><td>Invitrogen; Alternative Schritte 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>z. B. Nick translatiert und biotinyliert mit BioNick von Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternative Schritte 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>für den Nachweis von langer biotinylierter Sonde</td></tr><tr><td>Hybridisierungspuffer</td><td>Rezeptur über</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Rezeptur über</td><td></td><td>Kochsalz-Natriumcitrat + Tween</td></tr><tr><td>0,1x SSC</td><td>Rezeptur über</td><td></td><td>Kochsalz-Natriumcitrat</td></tr><tr><td>Blockierungslösung</td><td>Rezept über</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Rezept über Rezept über</td><td></td><td>SSC, Rinderserumalbumin, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Rezeptur über</td><td></td><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Hypotonische Lösung</td><td></td><td></td><td>0,5% Natriumcitrat in H2O</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vektor Laboratorien</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einfache methode zur fluoreszenz dna<em&gt; in-situ-</em&gt; die hybridisierung an squashed chromosomen

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ Hybridisierung (ISH DNA) ist ein häufig verwendetes Verfahren zum Abbilden von Sequenzen an spezifischen Chromosomenregionen. Dieser Ansatz ist besonders effektiv bei der Kartierung hoch repetitive Sequenzen an heterochromatischen Regionen, in denen Rechenansätze gegen prohibitiv Herausforderungen. Hier beschreiben wir eine optimierte Protokoll für DNA ISH, die Formamid wäscht die Standardschritte in anderen DNA ISH Protokolle umgeht. Unser Protokoll zur Hybridisierung mit kurzen Einzelstrang-DNA-Sonden, die Fluoreszenzfarbstoffe, die effektiv zu markieren repetitive DNA-Sequenzen in hetero chromosomalen Regionen in einer Anzahl verschiedener Insektengewebetypen durch optimiert. Jedoch können Anwendungen erweitert werden, um mit größeren Sonden und Visualisierung von Einzelkopie (nicht-wiederkehrende) DNA-Sequenzen zu verwenden. Wir zeigen, diese Methode durch die Abbildung verschiedene repetitive Sequenzen zu gequetscht Chromosomen von Drosophila melanogaster Nervenzellen und Nasoniavitripennis Spermatozyten. Wir zeigen Hybridisierungsmuster für beide klein, kommerziell synthetisiert Sonden und für eine größere Sonde zum Vergleich. Bei diesem Verfahren wird einfach Laborbedarf und Reagenzien, und ist ideal für Ermittler, die wenig Erfahrung mit der Durchführung DNA ISH haben.

Um dieses Verfahren zu demonstrieren, hybridisierten wir eine Reihe von kleinen kommerziell synthetisiert Oligos, die chemisch mit Fluoreszenz-Konjugate (Abbildung 2) und einem längeren biotinylierte Sonde verändert wurden (durch Nick-Translation eines PCR-Produktes hergestellt; 2B), um die Chromosomen aus verschiedenen Gewebe Typen (siehe Tabelle 1). Die Zielsequenzen enthalten Satelliten-Wiederholungen in pericentromeric (Heterochromatin) Regionen der mitotischen Chro...

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Durchführung einer Fluoreszenz-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH) vor, um sich wiederholende heterochromatische Sequenzen auf Objektträger-montierten Chromosomen zu visualisieren. Die Methode benötigt nur minimale Reagenzien und ist vielseitig einsetzbar für kurze oder lange Sonden, verschiedene Gewebe und den Nachweis mit Fluoreszenz- oder nicht-fluoreszenzbasierten Signalen.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der DNA-in-situ-Hybridisierung heterochromatische Sequenzen auf mitotischen Chromosomen abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Gehirne von Drosophila-Larven im dritten Larvenstadium oder eines anderen gewünschten Gewebes disseziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Gewebe auf einem Deckglas zu fixieren.Anschließend wird das Gewebe zwischen Deckglas und Objektträger plattiert. Um die Chromosomen für die Hybridisierung vorzubereiten, erfolgt im letzten Schritt die Hybridisierung kurzer synthetisierter Oligo-Proben mit dem plattierten Gewebe. Abschließend wird mittels Fluoreszenzmikroskopie die Lokalisation von Sequenzen, die komplementär zu den Oligo-Proben sind, auf den Chromosomen sichtbar gemacht.Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden liegt in ihrer Einfachheit. Die meisten anderen Chromosomen- und C-two-Hybridisierungsmethoden beinhalten Wäschen mit großen Mengen Formamid, was kostspielig und umständlich sein kann. Unsere Methode erfordert keine Formamid-Wäschen und ist daher kostengünstiger, sauberer und schneller.Obwohl diese Methode eine einfache Möglichkeit bietet, Sequenzen sichtbar auf den somatischen Chromosomen von Drosophila-Gehirnen abzubilden, kann sie auch zur Kartierung von Sequenzen auf anderen Arten von Chromosomen aus verschiedenen Geweben unterschiedlicher Organismen verwendet werden. Für jeden herzustellenden Objektträger bereiten Sie vier oder fünf Gewebeproben vor, jedoch nicht mehr bei Gehirndissektionen. Beginnen Sie damit, wandernde Larven im dritten Larvenstadium auszuwählen und sie in einem Tropfen 1× PBS zu sammeln.Wählen Sie Probengefäße aus, die nicht überfüllt sind. Verwenden Sie unter dem Präparationsmikroskop feinste Pinzette, um die Mundhaken zu fassen, und ein weiteres Paar, um zwei Drittel der Körperlänge entlang zu greifen. Ziehen Sie dann vorsichtig an den Mundhaken, um das Gehirn, die ventrale Ganglien, die Speicheldrüsen und Teile des Verdauungstrakts freizulegen.Als Nächstes das Gehirn und die ventralen Ganglien mit einer Pinzette von den übrigen Geweben lösen und in einen Tropfen XPBT auf einer Kunststoffplatte überführen. Für die Dissektion der Hoden sammeln Sie männliche, drei Tage alte Puppen. Drei Tage alte Puppen weisen gelbe Körper und rote Augen auf.Diejenigen mit kleineren Flügelscheiden sind männlich. Halten Sie die Puppe mit einem Paar Pinzetten am oberen Ende des Abdomens in der Nähe des thorakalen Bereichs fest und greifen Sie mit einem zweiten Paar Pinzetten die distalste Spitze des Abdomens, ziehen Sie dann die tränentropfenförmigen Testes heraus.Sie sind von Fettkörpern umgeben, die vorsichtig abgeschüttelt werden können; entfernen Sie alle äußeren Körperteile von den Hoden, um eine ordnungsgemäße Zerquetschung zu ermöglichen, und überführen Sie die Hoden in einen Tropfen 1× PBST auf einer sauberen Unterlage. Sobald das gesamte Gewebe gesammelt ist, behandeln Sie es mit einer hypotonen Lösung, um die Trennung der Schwesterchromatiden zu verbessern. In den e-chromatischen Regionen überführen Sie das Gewebe für 10 Minuten in einen Tropfen 0,5 %iger Natriumcitratlösung.Um diesen Effekt zu erzielen, wird Kolchicin nicht empfohlen, da es Artefakte in der Chromosomenmorphologie verursachen kann. Fixieren Sie das Gewebe nun mit feinsten Pinzetten. Überführen Sie es in einen 20 µL großen Tropfen frisch hergestellter 2,5 %igen PFA-Lösung in 45 %iger Essigsäure auf einem sauberen, sigma-beschichteten Deckglas, verteilen Sie das Gewebe gleichmäßig im Fixansatz und inkubieren Sie es vier Minuten bei Raumtemperatur. Fahren Sie anschließend mit dem Zerquetschen der Deckgläser fort, indem Sie eine polylysinbeschichtete Objektträgerplatte vorsichtig mit der Unterseite auf das Gewebe und das Deckglas legen. Lassen Sie das Deckglas an der Unterseite des Objektträgers haften, ohne es niederzudrücken. Das Behandeln von Deckgläsern mit Sigma-Beschichtung hilft sicherzustellen, dass das zerdrückte Gewebe nach dem Entfernen des Deckglases auf dem Objektträger verbleibt. In seltenen Fällen kann das Gewebe jedoch am Deckglas haften bleiben.Während dieses Schritts empfehlen wir, mehrere Wiederholungen der Gewebepräparation durchzuführen. Drehen Sie nun das Objektträgerplättchen um und legen Sie es in ein gefaltetes Stück dickes Papier. Drücken Sie dann auf einer stabilen Unterlage mit dem Daumen fest senkrecht nach unten auf das Deckglas.Drücken Sie nicht so fest, dass die Deckglasplatte verrutscht, da dies das Gewebe verwischen würde. In der Regel führt ein sehr kräftiges Andrücken zu gut sichtbaren Chromosomen im Präparat. Gelegentlich kann es jedoch zu einer Variabilität in der Chromosomenqualität kommen, beispielsweise unvollständige, zerquetschte oder fragmentierte Chromosomen.Wir empfehlen daher erneut, zwei oder drei Replikate von Gewebepräparaten anzufertigen. Überführen Sie die Probe für einige Minuten auf einen Eisblock und tauchen Sie sie anschließend in flüssigen Stickstoff, bis das Sieden des Stickstoffs stoppt oder länger. Unmittelbar vor dem Auftauen des Gewebes entfernen Sie die Deckglasabdeckung, indem Sie mit einer frischen Rasierklinge eine Ecke des Deckglases anheben. Auf diese Weise wird das Deckglas entfernt.Vermeiden Sie sorgfältig, das Gewebe zu verkratzen. Legen Sie die Objektträger anschließend schnell in ein Coplin-Gefäß, das mit 100 % Ethanol gefüllt ist, und lassen Sie sie mindestens fünf Minuten lang einweichen. Nehmen Sie den Objektträger heraus, wischen Sie überschüssiges Ethanol ab, ohne das Gewebe zu berühren, und lassen Sie den Objektträger eine Stunde lang an der Luft trocknen.Die Objektträger können anschließend wochen- bis monatelang in einer Trockenkammer aufbewahrt werden. Geben Sie zunächst 100 Nanogramm jeder Sonde zu 20 Mikroliter 1,1 x Hybridisierungspuffer, um eine 22-Mikroliter-Lösung mit 1 x Hybridisierungspuffer zu erhalten. Pipettieren Sie dann die Mischung auf das fixierte Gewebe, wobei das Gewebe unberührt bleibt, und setzen Sie vorsichtig ein Deckglas auf.Eine kleine Luftblase, die das Gewebe nicht berührt, verursacht keine Probleme, aber bei weiteren Blasen sollte das Deckglas erneut aufgebracht werden. Stellen Sie den Objektträger auf die flache Seite eines Wärmeblocks mit 95 Grad Celsius und bedecken Sie ihn mit Folie. Warten Sie fünf Minuten, in denen Sie die Feuchtigkeitskammer vorbereiten können, indem Sie feuchte Papiertücher in eine Pipettenspitzenbox geben.Entfernen Sie dann den Objektträger. Wickeln Sie den Objektträger vorsichtig in gespanntes Parafilm ein und überführen Sie ihn in eine befeuchtete Kammer, die aus einem feuchten Tuch in einer Spitzenbox besteht. Inkubieren Sie den Objektträger in der Kammer vier Stunden bis über Nacht bei 30 Grad Celsius. Diese Temperatur eignet sich gut für Sonden mit niedrigem GC-Gehalt; für Sonden mit höherem GC-Gehalt sind jedoch möglicherweise einige Optimierungen der Hybridisierungstemperatur erforderlich.Nach der Inkubation vorsichtig die Parafolie entfernen und die Deckgläschen vorsichtig an einer Ecke anheben. Anschließend den Objektträger dreimal für jeweils 15 Minuten in 0,1 XSSC-Puffer waschen. Während der Waschschritte das Gefäß mit Aluminiumfolie abdecken, um die Lichteinwirkung zu minimieren.Für lange biotinylierte Sonden fügen Sie zunächst Rod-Domäne-Avadon hinzu und waschen Sie, bevor Sie fortfahren. Trocknen Sie zunächst den Bereich um das Gewebe herum und bedecken Sie das Gewebe mit 100 Mikroliter Blockierungslösung. Bringen Sie dann vorsichtig eine neue Deckglasabdeckung auf, ohne Blasen einzuschließen.Erneut die Objektträger mit Parafilm abdecken. Anschließend den Objektträger 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach die Deckglas entfernen und das Gewebe mit einem Tuch vorsichtig abtupfen.Danach 100 Mikroliter einer 1:1000 verdünnten Ruminen-Avadon-Lösung in SBT auf das Gewebe auftragen. Anschließend abdecken, einwickeln und die Probe genauso wie bei der Blockierung inkubieren. Zum Schluss vorsichtig den Deckglaser entfernen und den Objektträger waschen.Führen Sie drei Waschschritte in vierfachem SSC-T und anschließend drei Waschschritte in 0,1fachem SSC durch. Jeder Waschschritt sollte mindestens fünf Minuten dauern. Fahren Sie mit dem Protokoll fort, indem Sie die Objektträger vorsichtig durch Abtupfen des überschüssigen Puffers trocknen, ohne das Gewebe zu berühren.Danach die Objektträger mit der Gewebeseite nach oben an einem dunklen Ort für 10 bis 15 Minuten liegen lassen oder bis die Feuchtigkeit vollständig verdunstet ist. Nun den Objektträger mit 11 µL Vector Shield mit DAPI abdecken und vorsichtig eine nicht sigma-beschichtete Deckglasplatte auflegen. Falls das Medium nicht alle Kanten erreicht, noch einige zusätzliche Mikroliter Medium am Rand auftragen und überschüssiges Medium abwischen.Danach den Deckel mit Nagellack versiegeln und den Objektträger aufrecht an einem dunklen Ort lagern, während der Nagellack trocknet, was normalerweise mindestens eine halbe Stunde dauert. Anschließend den Objektträger bei minus 20 Grad Celsius bis zu einer Woche lang aufbewahren und das Gewebe so bald wie möglich abbilden. Eine Reihe kleiner, kommerziell synthetisierter Oligos mit fluoreszenten Konjugaten sowie eine längere biotinylierte Sonde, hergestellt mittels Nick-Translation, wurden alle an Chromosomen aus mehreren verschiedenen Gewebetypen hybridisiert.Mithilfe der beschriebenen Methodik erkannte die Sonde für die 359 Basenpaar lange Satellitensequenz von Drosophila Melanogaster einen großen, mehrere Megabasenpaare umfassenden Block auf dem X-Chromosom sowie eine deutlich kleinere Region auf Chromosom drei. Eine längere Sonde gegen den Responder-Satelliten detektierte Wiederholungsblöcke mit relativ geringer Kopienzahl von etwa 700. Somit ermöglicht diese Methode die Visualisierung sehr kleiner Satellitenblöcke.Wenn der Behandlungsschritt mit der hypotonen Lösung auf 10 Minuten verdoppelt wurde, nahm die Trennung der Schwesterchromatiden zu. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden wie der Antikörperfärbung kombiniert werden, um Fragen zu beantworten, ob bestimmte Chromatinproteine an spezifische Sequenzen lokalisiert sind.

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