Name: Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Erfahren Sie das Polysomen-Profiling zur Analyse selektiver mRNA-Translation in Säugerzellen unter Stressbedingungen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung spezifischer mRNAs und liefert Einblicke in zelluläre Anpassungsmechanismen.

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Wir danken den ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Labors, insbesondere Urszula Liwak, für die kritische Diskussion über Polysomen-Profiling-Protokolle und den Austausch von Daten. Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse der Canadian Institutes of Health Research, der Cancer Research Society und des National Science and Engineering Research Council of Canada an MH unterstützt. MDF wurde durch den Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award und das Ontario Graduate Scholarship unterstützt, und diese Arbeit ist Teil ihrer Doktorarbeit.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Polysomaler Profilierung ist eine leistungsfähige Technik, die zur Quantifizierung der Zustand der Übersetzung der spezifischen Transkripte unter verschiedenen Behandlungsbedingungen ermöglicht. Es ist eine sehr einfache Technik im Prinzip doch mehrere Schritte der Ausführung, von denen einige kritische zur Herstellung guter Polysomen-Profile erfordert. Diese wichtigen Schritte sind: 1) mit RNase-frei Chemikalien und Kunststoffgeschirr, 2) Vorbereitung gute Saccharosegradienten (nach unserer Erfahrung ein 10-50% Saccharosegradienten funktionieren am besten, für die effiziente Lösung von 40 / 60S-Untereinheiten und mRNAs mit gebundenen Ribosomen) und 3 ) unter Verwendung von Zellen, die exponentiell wachsen und nicht mehr als 80% konfluent, um zu erfassen die höchsten Raten der Übersetzung. Dieser letztere Schritt ist zu berücksichtigen, wenn dabei lange Zellbehandlungen, wie beispielsweise Knock-down oder Überexpression genommen werden, so dass die Menge der Zellen an der Platte wird eine Funktion, wie viel sich die Zellen am Endpunkt konfluent sein. In den Ergebnissen presented hier Polysomen-Profil-Analyse war ein wichtiges Werkzeug für die Bewertung Pdcd4 Rolle in der Translationsregulation der IRES-tragenden mRNAs XIAP und Bcl-xL 12. Die Tatsache, dass wir keine Änderung der allgemeinen Polysom ​​Profile auf Pdcd4 knock-down (1B) nicht beachten konnten wir feststellen, dass Pdcd4 nicht globalen zellulären Übersetzung unter den Bedingungen des Experiments beeinträchtigen. Als nächstes verwendet RT-qPCR-Analyse, um die Verteilung des XIAP und Bcl-xL-mRNAs in Zellen, die mit Pdcd4 oder Kontroll siRNAs behandelt bestimmen. qPCR ist ein Verfahren der Wahl für die Analyse von Polysomen-Profile, im Gegensatz zu Standard-RT-PCR oder Northern-Blot, weil es für eine quantitative anstatt semi-quantitative Analyse der mRNA Verteilung und zum Nachweis von feinen Verschiebungen in Translationseffizienz zwischen den Behandlungen. Mit dieser Technik konnten wir zeigen, dass die Verteilung der XIAP und Bcl-xL-mRNAs (ausgedrückt als Prozent des gesamten Ziel-mRNA durch die gradient) signifikant in schwere Polyribosome (mRNAs mit einer großen Anzahl von Ribosomen mit ihnen verbunden sind), nachdem Pdcd4 knock-down (1D, E) verschoben wird, was auf eine Erhöhung der Übersetzung dieser mRNAs. Dies wurde weiter durch eine Erhöhung der XIAP und Bcl-xL-Protein-Spiegel, aber nicht in ihrer stationären RNA-Niveaus (1F, G) bestätigt. Wichtiger ist, die Polysomen Verteilung des nicht-IRES-Variante von XIAP war unverändert zwischen behandelten und unbehandelten Zellen (1C). Alternativ kann die Translationseffizienz als das Verhältnis der mRNA-Gehalt in Polysomen (üblicherweise die Fraktionen 5 bis 10) gegenüber monosomes vorgestellt (üblicherweise die Fraktionen 2 bis 4) 14. Die Verwendung von Steuerelementen im gesamten Protokoll ist bei der Validierung keine Polysom ​​Profilierungsergebnis wichtig, da von Absorptionswerte bei 254 nm beobachtet Spitzen können nicht auf eigene Faust, um die ribosomale RNA (Reinigungsmittel zurückzuführens, beispielsweise Triton X-100 stark absorbieren in diesem Bereich des Spektrums und kann 40 / 60S Spitzen an der Spitze des Gradienten verdecken). Lassen Gradienten ohne Lysat und / oder mit Lysatpuffer müssen ausgeführt werden, um den relativen Beitrag der Puffer zu der Absorption bei 254 nm zu bestimmen. Artefakt Strukturen höherer Ordnung können auch zu Fehlinterpretationen von Polysomen, wo es in der Tat keine (zB &quot;pseudo-Polysomen&quot; 20) führen. Maskierungs Magnesium (während des gesamten Verfahrens zur Stabilisierung von 80S Ribosomen) mit der zweiwertige Kationenchelator EDTA zugegeben, um Lysate und dem Gradienten-Puffer (20 mM für 15 min) wird die Trennung des Ribosoms in seine Komponenten kleinen (40S) führen und große (60S ) Untereinheiten. Wenn somit Absorptionspeaks bei 260 nm aufgezeichnet sind zwar Polysomen, EDTA-Behandlung das Profil, so dass ein einziges Maximum wird in der Nähe der Oberseite des Gradienten, die zu mRNA und die ribosomale Einheiten frei entspricht beachten kollabieren (Daten nicht gezeigt). Übereinstimmendmit EDTA-induzierten Zerfall des Profils, sollten alle der besonderen Ziele durch qPCR analysiert jetzt an der Oberseite des Gradienten gefunden werden. Die Anzahl der Ribosomen mit einer mRNA assoziiert ist nicht immer ein Indikator dafür, wie effizient diese bestimmte mRNA übersetzt wird. Tatsächlich gibt es bestimmte Kontexte, in denen aktive Übersetzung auf Polysomen wird ins Stocken geraten 21,22, die der Leser bewusst sein sollten. Bestimmen, ob oder nicht Transkripte werden aktiv mit der Translationsmaschinerie in Eingriff kann durch eine geführt werden) Behandeln der Probe mit Puromycin, die im Gegensatz EDTA, bewirkt &#39;run-off &quot;von Ribosomen, die aktiv in einem mRNA translozieren sind, oder b) Behandeln der Probe mit Homoharringtonin die Translokation nur der ersten Ribosom am Startcodon hemmt, was wiederum zu &quot;Run-off&quot; aller nachgelagerten Translokationseinheit Ribosomen. Die Verwendung von Steuer Transkripten qPCR-Analyse ist ebenfalls kritisch. Das Selection von Transkripten, die nicht durch unterschiedliche Behandlungsbedingungen wie einige Housekeeping-Gene (GAPDH, Actin, Tubulin, Nucleolin), ribosomale mRNAs (18S, Rpl13a) oder in diesem Fall der Nicht-IRES Variante des XIAP IRES betroffen sind, ist in wichtigen Überprüfung, ob die Behandlung die Wirkung auf Übersetzung ist spezifisch oder generalisiert. Diese Steuer Transkripten verwendet werden, um die Verteilung der mRNAs analysiert, wie es hier gemacht normalisieren (XIAP und Bcl-xL-mRNAs wurden auf GAPDH-mRNA normalisiert und als Prozentsatz der Gesamt-mRNA-Gehalt durch die Summe der mRNA-Gehalt in jeder Fraktion vertreten ) oder alternativ können Ziel- und Steuerungs mRNAs als Absolutwerte angegeben und gesondert auszuweisen. qPCR-Analyse der Eingangs Lysaten (in der Regel 10% des Gesamtvolumens) ist ein weiterer Schritt, der für die Verteilung von spezifischen mRNAs steuern wird. Idealerweise sollte der mRNA-Gehalt einer spezifischen Transkripts in der Eingangs Lysat vergleichbar mit der Summe der mRNA-Gehalt in den Fraktionen 10 analysiert werden. Schließlich, Ein optionaler Schritt, um für die Phenol steuern: Chloroform Extraktionsschritt besteht darin, jeden Polysom ​​Fraktion mit einem in vitro transkribiert Reporter mRNA Spike (wie CAT, Chloramphenicolacetyltransferase), die anschließend von qPCR quantifiziert werden wird und kann sogar verwendet werden, um die Normalisierung Daten 14. Wie bei jeder Technik stellt die Polysomen Profilierung einige Einschränkungen. Die Tatsache, dass in der Regel ein Minimum von 10 Fraktionen (subtilere Veränderungen der Translationseffizienz erfordern 20 oder mehr) benötigen, um schöne Polysom ​​Distributionen gesammelt macht dieser Schritt Begrenzung, in dem Sinne, dass nur maximal 4 Proben kann zu einem Zeitpunkt analysiert, um in der Lage, bequem hand RNA-Extraktion und qPCR-Analyse von 40 Proben und 4 Input-Kontrollen auf einmal sein. Die Stichprobengröße kann leicht bis mit, wie viele Transkripte analysiert werden und wie viele qPCR repliziert zu tun, und das kann teuer werden. Eine weitere Einschränkung eines qPCR-basierte polysomaler Profilierung einnalysis ist, dass sie nur auf einen Kandidaten-basierten Ansatz (wobei die Transkripte zu analysierende im Voraus bekannt sind) und kann nicht für genomweiten Analyse von Übersetzungs angewendet werden erfolgen. Doch zu Beginn des 21. Jahrhunderts begannen die Ermittler ihre polysomaler RNA an genomischer Ebene mit Hilfe von DNA-Microarrays zu verhören 15 und in jüngerer Zeit mit der nächsten Generation Sequenzierung 16,17. In diesem leistungsfähigen Ansatz wird polysomaler Profilierung durchgeführt, wie in diesem Protokoll beschrieben ist, außer, dass anstatt der Durchführung qPCR Analyse der einzelnen Fraktionen, monosomes Fraktionen (in der Regel Bruch 2-4) und Polysomen Fraktionen (meist Fraktionen) werden vereinigt und Variationen in der globalen Übersetzung analysiert durch DNA-Microarray oder des gesamten Genoms RNA Sequenzierung. Daher bei diesem Ansatz ist es möglich zu beurteilen, alle mRNAs, deren Verteilung verschiebt sich von Polysomen zu monosomes (Abnahme der Übersetzung) oder umgekehrt (Erhöhung der Übersetzung) auf ausdrückliches treatment. Validierung und Quantifizierung spezifischer mRNA Polysomen Verteilung kann dann durch qPCR erfolgen. Eine noch leistungsfähigere Nutzung der polysomaler Profilierung Prinzip ist Ribosom Profilierung. Weitere Hochdurch Erweiterung dieser Technik wurde kürzlich berichtet, dass zur gleichzeitigen Überwachung von Hunderten von Polysomen Fraktionen 23 ermöglicht. Dies stellt einen klaren Vorteil beim Antasten Translationseffizienzen von Mutantensammlungen oder in einer groß angelegten RNAi-Screens. Ribosom Profiling ist eine Technik, die ausnutzt Next Generation Sequencing, um RNA-Fragmente von Ribosomen (Ribosomen Fußabdrücke) geschützt in der Proteinsynthese 24,25 engagiert abzubilden. Bei dieser Technik kann Ribosomentranslokation mit Cycloheximid (reversibel) oder Emetin (irreversible), gefolgt von Zell-Lyse und RNase-Verdau, um eine Population von Ribosomen Fußabdrücke ergeben gehemmt werden. Ribosomen sind angereichert, die Gesamt-RNA isoliert und verunreinigen ribosomale und mitochondriale ribosomale RNA wird entfernt.RNA Fußabdrücke von ca. 26-28 Nukleotiden werden isoliert, revers transkribiert, in eine cDNA-Bibliothek umgewandelt und sequenziert 26. Im Gegensatz zu Standard Polysom ​​Profiling, dieser Ansatz nicht nur identifiziert spezifische mRNAs, die translational reguliert werden, sondern auch liefert mRNA-spezifische Informationen bei Codon Auflösung wie die genaue Besetzung und Dichte der Ribosomen entlang einer spezifischen Transkript. Dies ist besonders interessant für mRNAs mit bestimmten Arten der Übersetzung wie IRES-beherbergen mRNAs, wie es mehr Informationen darüber, wo auf dem Transkript Ribosom-Rekrutierung auftritt geben könnte.

Regulation der Proteinsynthese (Translation) ist ein Schlüssel zellulären Prozess, der eng mit zellulären Überleben verknüpft ist. Da Übersetzung verbraucht mehr als 50% der Energie Zelle, ist es nicht verwunderlich, dass Übersetzung ist streng reguliert, und dass Störungen in der Übersetzung nicht gut vertragen. Umgekehrt sind viele aberrante zelluläre Prozesse erfordern, dass Translationsmaschinerie und Übersetzungs Ausgang (dh Proteom) müssen geändert werden. Dies ist häufig in verschiedenen Stressantwort und Krankheitszuständen der Fall, und ist wahrscheinlich am besten in der Krebsbeispielhaft dargestellt. Ein wesentlicher Vorteil der Translationskontrolle ist die Fähigkeit von Zellen, sich schnell neu zu programmieren, die das Protein Ausgabe in Reaktion auf verschiedene externe und interne Trigger, wodurch eine Feinabstimmung Mechanismus, neigt das Gleichgewicht zwischen Zellüberleben und Tod 1. Zwei Aspekte der Translationskontrolle sind besonders interessant; Verständnis der Natur des Regelungs mechanism (s) und Kontrollelemente, die für bestimmte Übersetzung zu ermöglichen, und die Identifizierung von spezifischen mRNAs und deren Proteinprodukte, die in der zellulären Reaktion auf den Trigger, insbesondere selektive Translation in erster Linie ausgelöst teilzunehmen. Polysomen-Profilierung ist eine Technik, die effektive Untersuchung beider Prozesse ermöglicht. Das übergeordnete Ziel des Polysom ​​Profiling-Technik ist, um zu studieren und zu quantifizieren Übersetzung Zustand spezifischer mRNAs unter verschiedenen zellulären Bedingungen. Das Prinzip der Technik ist es, die mRNA-Translation durch &#39;&#39; Einfrieren &#39;&#39; aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte (von mehreren Ribosomen gebunden) erfassen und schlecht übersetzt Einsen (mit einem oder zwei Ribosomen gebunden). In diesem speziellen Protokoll, das Antibiotikum Cycloheximid, die das bindet60S ribosomalen Untereinheit und blockiert die Freisetzung von deacetyliertes tRNA aus dem Ribosom E Park 2, wird verwendet, um Ribosomentranslokation hemmen und Stall Ribosomen an der Übersetzung mRNAs. Aber auch andere Blockierungsmittel, wie Emetin, die auch Blöcke Translationselongation 3, können verwendet werden. Im Gegensatz zu dem Western Blotting und 35 S-Methionin-Markierungstechniken, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses zu messen, Polysomen-Profilierung hat den Vorteil der Messung Ribosomen Verbindung mit aktiv-translatierte mRNAs, wodurch für eine genauere Untersuchung der Übersetzungsmechanismen unter verschiedenen Bedingungen. Daher kann die Technik leicht an spezifisch untersuchen verschiedene Modi der Übersetzung 4-6 werden die Übersetzungsregelung 7-9, Stressbedingungen beeinflussen die Proteinsynthese 1,10,11 oder die Auswirkungen von mRNA-Strukturen wie IRES oder stromaufwärts beteiligten Proteine ​​Faktoren offene Leserahmen auf die Protein synthESIS 12-14. Heutzutage sind Polysom ​​Profilierung Anwendungen noch breiteres mit dem Einsatz von DNA-Microarrays 15 oder Next-Generation-Sequencing 16,17 zu analysieren Polysomen-assoziierte mRNAs.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 automatisierter Gradientenmacher</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow Zweikammer-Gradientenmacher</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultrazentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modell # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Dichtegradientenfraktionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Bestehend aus: Schlauchdurchstechsystem, Schlauchpumpe, UA-6 Detektor mit 254 und 280 nm Filtern und Foxy R1 Fraktionssammler</td></tr><tr><td>WinDaq Datenerfassungssoftware</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmPollyallomer-Ultrazentrifugenröhrchen (für SW41, 14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreie 2-ml-Zentrifugenröhrchen (Delfinnase)</td><td>DiaMed</td><td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreie 2-ml-Zentrifugenröhrchen (flacher Boden)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose (nukleasenfrei)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342,3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281,4 g/mol. In DMSO resuspendieren und für eine langfristige Löslichkeit bei -80 °C halten. Achtung: GIFTIG! Kann Atemwege und Hautreizungen verursachen. Tragen Sie beim Wiegen eine Maske.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (nukleasenfrei)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58,44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2,6H2O (nukleasenfrei)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203,3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (nukleasenfrei)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Achtung: GIFTIG! Kann die Atemwege und Hautreizungen verursachen</td></tr><tr><td>Rekombinanter RNasin-Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Rnase Inaktivierungslösung</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Säure-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (mit IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Achtung: GIFTIG ! Kann Reizungen der Atemwege sowie Hautreizungen und Korrosion verursachen</td></tr></tbody></table>

bewertung der selective mrna translation in säugerzellen durch polysomen profilieren

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation der Proteinsynthese stellt einen wichtigen Kontrollpunkt in der zellulären Antwort auf Stress. Insbesondere wurden diskreten RNA Regulationselemente gezeigt, die selektive Translation bestimmter mRNAs, die für Proteine ​​codieren typischerweise für eine bestimmte Stressantwort erforderlich zu ermöglichen. Identifizierung dieser mRNAs als auch die Charakterisierung von regulatorischen Mechanismen für die selektive Translation verantwortlich ist, an der Spitze der molekularen Biologie seit einiger Zeit. Polysom ​​Profilierung ist ein Eckpfeiler Verfahren in diesen Studien. Das Ziel Polysom ​​Profilierung ist es, mRNA-Translation durch Immobilisierung aktiv übersetzen Ribosomen auf verschiedenen Transkripte erfassen und trennen Sie die resultierende Polyribosomen durch Ultrazentrifugation auf einem Saccharose-Gradienten, so dass eine Unterscheidung zwischen hoch übersetzte Transkripte und schlecht übersetzt Einsen. Diese können dann durch traditionelle biochemische und molekularbiologische Methoden charakterisiert werden. Wichtig ist, dass die Kombination von polysome Profilierung mit hohem Durchsatz genomische Ansätze erlaubt eine groß angelegte Analyse der Translationsregulation.

Wir haben kürzlich eine neue Rolle für das Tumorsuppressor Pdcd4 als selektiver Inhibitor der Übersetzung IRES-tragenden mRNAs Apoptoseinhibitoren XIAP und Bcl-xL 12. Polysom ​​Profilierung war eine Schlüsseltechnik, um die spezifische Beteiligung von Pdcd4 in IRES-vermittelte Übersetzung zu demonstrieren. HEK293-Zellen wurden transient transfiziert endogenen Pdcd4 (1A) führen und dann einer Profilanalyse Polysomen. Wir haben beobachtet, dass die Reduzierung des Niveaus Pdcd4 nicht globalen zellularen Übersetzung beeinträchtigt, wie durch das Fehlen von Änderungen der Polysomen-Profil im Vergleich siCTRL und siPDCD4 behandelten Zellen (1B) beurteilt. Ebenso Polysomen Verteilung nicht-IRES Variante XIAP 19 unverändert zwischen behandelten und unbehandelten Zellen (1C). Dagegen Polysomen Verteilung der beiden IRES-tragenden mRNAs, XIAP und Bcl-xL, signifikant verändert. In der Abwesenheit von PDCD4 die Verteilung dieser beiden mRNAs in schweren ribopolysomes (1D, E) verschoben. Da dies nicht durch Veränderungen in der Steady-State-Niveaus von XIAP und Bcl-xL mRNA (1F) diesen Ergebnissen begleitet weisen eine verbesserte Übersetzung von XIAP und Bcl-xL in Zellen mit vermindertem Pdcd4 Ebenen, die durch Western Blot (Abbildung bestätigt wurde 1G). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Fig. 1: Polysomen Profilierung identifiziert Pdcd4 als selektiver Inhibitor von XIAP und Bcl-xL-Übersetzung (A) HEK293-Zellen wurden mit Pdcd4 siRNA oder Kontrolle (CTRL) behandelt, nicht-Targeting siRNA, lysiert und mit Anti-Pdcd4 Western-Blot-Analyse unterzogen, und Anti-Nucleolin Antikörper, um das Ausmaß des Pdcd4 knock-down zu überprüfen. (B) Pdcd4 wurde verkleinert, wie in (A) klopfte undZelllysate wurden einer Profilierung Polysom. Repräsentative Polysom ​​Profil wird im oberen Bereich angezeigt; Verteilung des XIAP IRES nicht (C) wird Bcl-xL (D) und XIAP IRES (E) mRNAs relativ zu der GAPDH als Prozentsatz der Gesamt-mRNA (% mRNA) in jeder Fraktion gezeigt. (F) stetig -state mRNA-Spiegel wurden mittels RT-qPCR in Pdcd4 siRNA oder Kontrolle (CTRL) siRNA behandelten Zellen gemessen. (G) Die Lysate aus (A) wurden auch Western-Blot-Analyse mit anti-XIAP, anti-Bcl-xL und ausgesetzt Anti-Nucleolin Antikörper. (NB. Die dargelegten Daten in Abbildung 1 wurden ursprünglich in 12 veröffentlicht) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Fähigkeit der Zellen, sich an Stress anzupassen, ist entscheidend für ihr Überleben. Die Regulation der mRNA-Translation ist eine solche Anpassungsstrategie, die eine schnelle Regulation des Proteoms ermöglicht. Hier stellen wir ein standardisiertes Polysomen-Profiling-Protokoll zur Verfügung, um spezifische mRNAs zu identifizieren, die unter Stressbedingungen selektiv translatiert werden.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zwischen stark und schwach translatierten mRNA-Molekülen zu unterscheiden, indem Polyribosomen immobilisiert und getrennt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Cycloheximid zu den Zellen gegeben wird, um die Ribosomen, deren Translokation und die RNA-Translation zu hemmen. Im zweiten Schritt werden Lysate der behandelten Zellen auf eine Saccharose-Dichtegradienten aufgetragen und ultrazentrifugiert, um die vorhandenen Polyribosomen entsprechend ihren Massen zu trennen.Anschließend wird der Gradient in gleiche Fraktionen aufgeteilt, um im letzten Schritt die stark und schwach translatierten Transkripte zu trennen. R-T-Q-P-C-R wird verwendet, um das Vorhandensein der mRNA-Interessens innerhalb jeder Fraktion nachzuweisen. Letztendlich kann die Ribosomen-Profilierung eingesetzt werden, um Veränderungen in der globalen sowie der spezifischen Translation von mRNA als Reaktion auf unterschiedliche physiologische und pathophysiologische Belastungen zu detektieren.Mittels PolyOne-Profilierung können zentrale Fragen in den Bereichen der Molekular- und Zellbiologie beantwortet werden, beispielsweise welche mRNAs ausgewählt und während des S-Stresses translatiert werden und wie dies den Zellen ermöglicht, sich an diese Bedingungen anzupassen. Zur Demonstration dieses Verfahrens ist Mom Dar ein Doktorand im Labor. Um einen automatisierten Gradientenmischer zur Herstellung eines Saccharosegradienten zu verwenden, schalten Sie zunächst den Gradientenmischer ein und richten die Platte aus, die die Gradienten aufnehmen wird. Sobald die Platte ausgerichtet ist, klicken Sie auf „Fertig“.Danach das Gradientenprogramm auswählen, indem das Grad-Menü geöffnet und „Liste“ ausgewählt wird. Auf SW 41 klicken und dann durch die Liste scrollen, bis das Programm „10 bis 50 % Gradient, 11 Schritte“ sichtbar ist, und „Verwenden“ drücken. Danach einen kegelförmigen Ultrazentrifugenrohr SW 41 in den Markierblock stellen und mit dem beigefügten feinen Röhrchen-Marker eine Linie entlang der oberen Stufe des Blocks auf dem Rohr nachzeichnen.Stellen Sie die Röhrchen in ein passendes Gestell auf einer stabilen Oberfläche und befestigen Sie die beiden mitgelieferten Kanülen an zwei 10-Milliliter-Spritzen. Pipettieren Sie warmes destilliertes Wasser, das RNAs in Aktivierungslösung enthält, mehrmals auf und ab, um die Spritzen auszuspülen. Danach, nachdem alle Spuren des Wassers entfernt wurden, füllen Sie eine der Spritzen mit 10 % Saccharose plus Cyclohecid und führen die Kanüle am Boden des Ultrazentrifugenröhrchens ein.Dispensieren Sie die Lösung vorsichtig, bis sie gerade die am Rohr markierte Stelle überschreitet, wobei Sie darauf achten, Luftblasen zu vermeiden. Füllen Sie dann die andere Spritze mit 50 %igem Saccharose zuzüglich Cyclohecid und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit am Rohr mit einem Tuch.Verwenden Sie die Kanüle, um die 50%ige Saccharoslösung vorsichtig in das Röhrchen einzubringen, und stoppen Sie, sobald die Lösung mit der Markierung bündig steht. Entfernen Sie dann die Kanüle schnell und gleichmäßig. Die 10%ige Saccharoslösung sollte aufsteigen und am oberen Ende des Röhrchens einen Meniskus bilden. Danach kippen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen leicht, um eventuelle Luftblasen zu verdrängen, und setzen Sie den Verschluss auf. Verwenden Sie eine Mikropipette, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Reservoir des Verschlusses zu entfernen.Stellen Sie die Röhrchen auf den Gradientenmischer und drücken Sie dann die Starttaste. Beachten Sie, dass die Platte sich um den angegebenen Winkel neigt. Warten Sie fünf Sekunden, bevor die Rotationen zur Bildung des Gradienten beginnen.Etwa zwei Minuten später ertönt ein Signalton des Geräts, der anzeigt, dass die Gradientenbildung abgeschlossen ist. Überführen Sie die Röhrchen vorsichtig in einen Halter und entfernen Sie rasch die Verschlüsse in einer einzigen Aufwärtsbewegung, um den Gradienten nicht zu stören. Laden Sie dann vorsichtig je 260 Einheiten des zuvor hergestellten Zelllysats gleichmäßig auf jedes Saccharosegradient auf und zentrifugieren Sie die Röhrchen eineinhalb Stunden lang bei 260.343 × g und 4 °C in einem Ultrazentrifugens. Um das Instrument für die Gradientenfraktionierung einzurichten, schalten Sie zunächst das Spektrophotometer ein. Klicken Sie danach zweimal auf das Ordnersymbol und dann zweimal auf den Zurückpfeil, um zum Startbildschirm zurückzukehren und die Fraktionssammlung auf die PolyZone-Methode einzustellen, wodurch sichergestellt wird, dass das Ventil der Fraktionssammlung auf „Waste“ (Ausschuss) gestellt ist. Klicken Sie auf den Pfeil, der auf das Papierkorb-Symbol zeigt, und stellen Sie dann einen 250-Milliliter-MIA-Kolben mit destilliertem Wasser unter das Abfallabnahmerohr.Wählen Sie nun am Schreiber folgende Einstellungen: den Empfindlichkeitsregler für Lampe und Optik, den Rauschfilter auf 1,5, den Spitrentrennungsregler auf aus, die Schreibgeschwindigkeit auf 30 Zentimeter pro Stunde und den Basislinien-Justierregler an der Oberseite der Spektralphotometer-Einheit auf maximal geöffnet. Danach setzen Sie die Spritze mit der Spritzenhülse in die Pumpe ein und befestigen sie mithilfe der beiliegenden Schrauben und des Innensechskantschlüssels.Verwenden Sie den Rev-Befehl mit hoher Geschwindigkeit, um die Spritze mit der Nachwasch-Lösung zu füllen. Bringen Sie anschließend die Pumpe in senkrechte Position und verwenden Sie den Vorwärts-Befehl, um die Luft durch die Schläuche zu spülen. Danach wird ein Ultrazentrifugenröhrchen, das mit RNase-freiem Wasser gefüllt ist, im Halter eingesetzt und mit der Kanüle durchstochen, bis die beiden schwarzen Markierungen sichtbar sind.Das Abgabeloch befindet sich zwischen den beiden Markierungen. Starten Sie die Spritzenpumpe manuell vorwärts mit 6,0 Milliliter pro Minute. Wenn die Jagdlösung ein Drittel des Röhrchens gefüllt hat, wechseln Sie auf die variable Geschwindigkeit mit einer Fließrate von 1,0 Milliliter pro Minute.Drehen Sie nun den Nullpunkteinstellknopf am Spektrophotometer, bis die Spannung auf dem Diagramm bei null liegt. Wasser beginnt, aus dem Ablaufschlauch in das El-Mya-Gefäß auszutreten. Stellen Sie anschließend die gewünschte Empfindlichkeit auf 1,0 au ein.Nachdem die Empfindlichkeit eingestellt wurde, drücken Sie die Baseline-Taste und drehen Sie den Offset-Regler des Schreibers, um die Baseline-Einstellung auf die 10 %-Marke des Diagrammschreibers einzustellen. Sobald die stabile Basislinie erreicht ist, schalten Sie den Pumpenschalter und den Diagrammgeschwindigkeitsregler aus. Sobald die Pumpe ausgeschaltet ist, schalten Sie sie in die Rücklaufposition, um die Chase-Lösung zurückzugewinnen, bis diese die erste Markierung an der Durchstechkanüle erreicht.Entfernen Sie dann das Zentrifugenröhrchen, lösen Sie eventuelle Bläschen in der Kanüle mit etwas Nachspüllösung auf und entfernen Sie restliches Wasser, das möglicherweise aus der Durchflusszelle ausgetreten ist, um den Gradienten zu fraktionieren. Danach setzen Sie das Zentrifugenröhrchen mit dem Saccharosegradienten in den Halter ein und durchstechen es mit der Kanüle. Stellen Sie anschließend zehn zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in die Fraktionensammelgefäße der Positionen zwei bis elf und ein Abfallröhrchen in Position eins, sodass die Verschlüsse nicht nach oben herausragen.Stellen Sie den Pumpenregler auf manuell und die Flussrate der Spritzenpumpe auf 6,0 Milliliter pro Minute ein. Drücken Sie dann sobald wie möglich auf „Play“ am Fraktionssammler, sobald der Arm das erste Reagenzglas erreicht. Drücken Sie die Pausetaste, um den Arm zu positionieren und das Fraktionsabgabeventil zu öffnen.Verwenden Sie dann den Befehl „Vorwärts“, um die Pumpe zu starten und den Schreiber des Chartrecorders zu überwachen. Sobald der Schreiber nach oben ausschlägt, was anzeigt, dass die Probe die Durchflusszelle passiert, ersetzen Sie schnell das Abfallrohr durch Rohr Nummer eins. Sobald der erste Tropfen gesammelt wurde, wechseln Sie schnell die Befehle auf Fernstart, Stopp und variablem 1,0 Milliliter pro Minute und drücken Sie „Play“, um die Fraktionssammlerschnittstelle zu aktivieren, damit sie jede Minute eine Milliliter-Fraktion sammelt.Schließlich, nachdem die blaue Nachlaufflösung das letzte Gefäß erreicht hat, drücken Sie „Stop“. Die PolyZone-Profilierung ist eine entscheidende Technik, um die spezifische Beteiligung von PD-CD4 an IRAs-vermittelter Translation nachzuweisen. Beispielsweise wurden in diesem Experiment HEC 293-Zellen vorübergehend transfiziert, um die endogenen Mengen an PDC D vier zu reduzieren, und anschließend einer PolyZone-Profil-Analyse unterzogen.Die Verringerung der PDC D vier-Spiegel beeinträchtigte nicht die globale Translation des Gens, wie durch das Fehlen von Veränderungen im PolyZone-Profil beurteilt. Beim Vergleich von SI-Kontroll- und IPD CD vier-behandelten Zellen blieb die Polysomenverteilung einer nicht-IRAs-Variante von XIAP zwischen behandelten und unbehandelten Zellen unverändert. Im Gegensatz dazu war die Polysomenverteilung der beiden IS-tragenden mRNAs XIAP und BCL XL signifikant verändert.Bei Abwesenheit von PD-CD4 wurde die Verteilung dieser beiden mRNAs in die schweren Ribosomen verschoben. Da dies nicht mit Veränderungen der stationären Konzentrationen der XIAP- und BCL-XL-mRNA einhergeht, zeigen diese Ergebnisse eine verbesserte Translation von XIAP und BCL-XL in Zellen mit reduzierten PDCD4-Spiegeln, was durch die Western-Blossoming weiter bestätigt wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die mRNA-Translation durch die Herstellung einer Saccharose-Gradienten und die Trennung von Polysomen mittels Ultrazentrifugation gemessen wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) ist in der Lage, die zelltypspezifische Translation von mRNA zu erfassen. Hier berichten wir über das erste TRAP-Protokoll, das sich der Isolierung von mRNA in seltenen Zellpopulationen von Drosophila-Embryonen widmet.

TRAP-rc, Translating Ribosom Affinitätsreinigung von Rare Zellpopulationen<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Extraktion und Fraktionierung von Transkripten aus pflanzlichem Gewebe auf der Grundlage der Anzahl der gebundenen Ribosomen. Es ermöglicht eine globale Abschätzung der Translationsaktivität und die Bestimmung des Translationsstatus spezifischer mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum visualisieren und lokalisierte Übersetzung Veranstaltungen in subzelluläre Kompartimente zu quantifizieren. In diesem Manuskript vorgeschlagene Vorgehensweise erfordert eine grundlegende confocal imaging-System und Reagenzien und ist schnell und kostengünstig.

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

Das übergeordnete Ziel der Polysome Profilerstellung Technik ist Analyse der übersetzerischen Tätigkeit der einzelnen mRNAs oder Transkriptom mRNAs während der Proteinsynthese. Die Methode ist für Studien von Protein-Synthese-Verordnung, Übersetzung Aktivierung und Repression in Gesundheit und mehrere menschliche Krankheiten wichtig.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Polysome Profilierung auf das Herz isoliert PERFUNDIERTEN Maus durchführen. Wir beschreiben Methoden für Herz Perfusion, Polysome Profilierung und Analyse der Polysome Fraktionen in Bezug auf mRNAs, MiRNAs und Polysome Proteom.

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Hier beschreiben wir die Immunpräzipitation von Ribosomen und zugehöriger RNA aus ausgewählten Populationen erwachsener männlicher Mauskeimzellen mit dem RiboTag-System. Strategische Züchtung und sorgfältige Immunpräzipitation führen zu sauberen, reproduzierbaren Ergebnissen, die über das Keimzelltranslatom informieren und Einblicke in die Mechanismen mutierter Phänotypen geben.

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Erfahren Sie das Polysomen-Profiling zur Analyse selektiver mRNA-Translation in Säugerzellen unter Stressbedingungen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung spezifischer mRNAs und liefert Einblicke in zelluläre Anpassungsmechanismen.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

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