Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zwischen stark und schwach translatierten mRNA-Molekülen zu unterscheiden, indem Polyribosomen immobilisiert und getrennt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Cycloheximid zu den Zellen gegeben wird, um die Ribosomen, deren Translokation und die RNA-Translation zu hemmen. Im zweiten Schritt werden Lysate der behandelten Zellen auf eine Saccharose-Dichtegradienten aufgetragen und ultrazentrifugiert, um die vorhandenen Polyribosomen entsprechend ihren Massen zu trennen.

Anschließend wird der Gradient in gleiche Fraktionen aufgeteilt, um im letzten Schritt die stark und schwach translatierten Transkripte zu trennen. R-T-Q-P-C-R wird verwendet, um das Vorhandensein der mRNA-Interessens innerhalb jeder Fraktion nachzuweisen. Letztendlich kann die Ribosomen-Profilierung eingesetzt werden, um Veränderungen in der globalen sowie der spezifischen Translation von mRNA als Reaktion auf unterschiedliche physiologische und pathophysiologische Belastungen zu detektieren.

Mittels PolyOne-Profilierung können zentrale Fragen in den Bereichen der Molekular- und Zellbiologie beantwortet werden, beispielsweise welche mRNAs ausgewählt und während des S-Stresses translatiert werden und wie dies den Zellen ermöglicht, sich an diese Bedingungen anzupassen. Zur Demonstration dieses Verfahrens ist Mom Dar ein Doktorand im Labor. Um einen automatisierten Gradientenmischer zur Herstellung eines Saccharosegradienten zu verwenden, schalten Sie zunächst den Gradientenmischer ein und richten die Platte aus, die die Gradienten aufnehmen wird. Sobald die Platte ausgerichtet ist, klicken Sie auf „Fertig“.

Danach das Gradientenprogramm auswählen, indem das Grad-Menü geöffnet und „Liste“ ausgewählt wird. Auf SW 41 klicken und dann durch die Liste scrollen, bis das Programm „10 bis 50 % Gradient, 11 Schritte“ sichtbar ist, und „Verwenden“ drücken. Danach einen kegelförmigen Ultrazentrifugenrohr SW 41 in den Markierblock stellen und mit dem beigefügten feinen Röhrchen-Marker eine Linie entlang der oberen Stufe des Blocks auf dem Rohr nachzeichnen.

Stellen Sie die Röhrchen in ein passendes Gestell auf einer stabilen Oberfläche und befestigen Sie die beiden mitgelieferten Kanülen an zwei 10-Milliliter-Spritzen. Pipettieren Sie warmes destilliertes Wasser, das RNAs in Aktivierungslösung enthält, mehrmals auf und ab, um die Spritzen auszuspülen. Danach, nachdem alle Spuren des Wassers entfernt wurden, füllen Sie eine der Spritzen mit 10 % Saccharose plus Cyclohecid und führen die Kanüle am Boden des Ultrazentrifugenröhrchens ein.

Dispensieren Sie die Lösung vorsichtig, bis sie gerade die am Rohr markierte Stelle überschreitet, wobei Sie darauf achten, Luftblasen zu vermeiden. Füllen Sie dann die andere Spritze mit 50 %igem Saccharose zuzüglich Cyclohecid und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit am Rohr mit einem Tuch.

Verwenden Sie die Kanüle, um die 50%ige Saccharoslösung vorsichtig in das Röhrchen einzubringen, und stoppen Sie, sobald die Lösung mit der Markierung bündig steht. Entfernen Sie dann die Kanüle schnell und gleichmäßig. Die 10%ige Saccharoslösung sollte aufsteigen und am oberen Ende des Röhrchens einen Meniskus bilden. Danach kippen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen leicht, um eventuelle Luftblasen zu verdrängen, und setzen Sie den Verschluss auf. Verwenden Sie eine Mikropipette, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Reservoir des Verschlusses zu entfernen.

Stellen Sie die Röhrchen auf den Gradientenmischer und drücken Sie dann die Starttaste. Beachten Sie, dass die Platte sich um den angegebenen Winkel neigt. Warten Sie fünf Sekunden, bevor die Rotationen zur Bildung des Gradienten beginnen.

Etwa zwei Minuten später ertönt ein Signalton des Geräts, der anzeigt, dass die Gradientenbildung abgeschlossen ist. Überführen Sie die Röhrchen vorsichtig in einen Halter und entfernen Sie rasch die Verschlüsse in einer einzigen Aufwärtsbewegung, um den Gradienten nicht zu stören. Laden Sie dann vorsichtig je 260 Einheiten des zuvor hergestellten Zelllysats gleichmäßig auf jedes Saccharosegradient auf und zentrifugieren Sie die Röhrchen eineinhalb Stunden lang bei 260.343 × g und 4 °C in einem Ultrazentrifugens.

Um das Instrument für die Gradientenfraktionierung einzurichten, schalten Sie zunächst das Spektrophotometer ein. Klicken Sie danach zweimal auf das Ordnersymbol und dann zweimal auf den Zurückpfeil, um zum Startbildschirm zurückzukehren und die Fraktionssammlung auf die PolyZone-Methode einzustellen, wodurch sichergestellt wird, dass das Ventil der Fraktionssammlung auf „Waste“ (Ausschuss) gestellt ist. Klicken Sie auf den Pfeil, der auf das Papierkorb-Symbol zeigt, und stellen Sie dann einen 250-Milliliter-MIA-Kolben mit destilliertem Wasser unter das Abfallabnahmerohr.

Wählen Sie nun am Schreiber folgende Einstellungen: den Empfindlichkeitsregler für Lampe und Optik, den Rauschfilter auf 1,5, den Spitrentrennungsregler auf aus, die Schreibgeschwindigkeit auf 30 Zentimeter pro Stunde und den Basislinien-Justierregler an der Oberseite der Spektralphotometer-Einheit auf maximal geöffnet. Danach setzen Sie die Spritze mit der Spritzenhülse in die Pumpe ein und befestigen sie mithilfe der beiliegenden Schrauben und des Innensechskantschlüssels.

Verwenden Sie den Rev-Befehl mit hoher Geschwindigkeit, um die Spritze mit der Nachwasch-Lösung zu füllen. Bringen Sie anschließend die Pumpe in senkrechte Position und verwenden Sie den Vorwärts-Befehl, um die Luft durch die Schläuche zu spülen. Danach wird ein Ultrazentrifugenröhrchen, das mit RNase-freiem Wasser gefüllt ist, im Halter eingesetzt und mit der Kanüle durchstochen, bis die beiden schwarzen Markierungen sichtbar sind.

Das Abgabeloch befindet sich zwischen den beiden Markierungen. Starten Sie die Spritzenpumpe manuell vorwärts mit 6,0 Milliliter pro Minute. Wenn die Jagdlösung ein Drittel des Röhrchens gefüllt hat, wechseln Sie auf die variable Geschwindigkeit mit einer Fließrate von 1,0 Milliliter pro Minute.

Drehen Sie nun den Nullpunkteinstellknopf am Spektrophotometer, bis die Spannung auf dem Diagramm bei null liegt. Wasser beginnt, aus dem Ablaufschlauch in das El-Mya-Gefäß auszutreten. Stellen Sie anschließend die gewünschte Empfindlichkeit auf 1,0 au ein.

Nachdem die Empfindlichkeit eingestellt wurde, drücken Sie die Baseline-Taste und drehen Sie den Offset-Regler des Schreibers, um die Baseline-Einstellung auf die 10 %-Marke des Diagrammschreibers einzustellen. Sobald die stabile Basislinie erreicht ist, schalten Sie den Pumpenschalter und den Diagrammgeschwindigkeitsregler aus. Sobald die Pumpe ausgeschaltet ist, schalten Sie sie in die Rücklaufposition, um die Chase-Lösung zurückzugewinnen, bis diese die erste Markierung an der Durchstechkanüle erreicht.

Entfernen Sie dann das Zentrifugenröhrchen, lösen Sie eventuelle Bläschen in der Kanüle mit etwas Nachspüllösung auf und entfernen Sie restliches Wasser, das möglicherweise aus der Durchflusszelle ausgetreten ist, um den Gradienten zu fraktionieren. Danach setzen Sie das Zentrifugenröhrchen mit dem Saccharosegradienten in den Halter ein und durchstechen es mit der Kanüle. Stellen Sie anschließend zehn zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen in die Fraktionensammelgefäße der Positionen zwei bis elf und ein Abfallröhrchen in Position eins, sodass die Verschlüsse nicht nach oben herausragen.

Stellen Sie den Pumpenregler auf manuell und die Flussrate der Spritzenpumpe auf 6,0 Milliliter pro Minute ein. Drücken Sie dann sobald wie möglich auf „Play“ am Fraktionssammler, sobald der Arm das erste Reagenzglas erreicht. Drücken Sie die Pausetaste, um den Arm zu positionieren und das Fraktionsabgabeventil zu öffnen.

Verwenden Sie dann den Befehl „Vorwärts“, um die Pumpe zu starten und den Schreiber des Chartrecorders zu überwachen. Sobald der Schreiber nach oben ausschlägt, was anzeigt, dass die Probe die Durchflusszelle passiert, ersetzen Sie schnell das Abfallrohr durch Rohr Nummer eins. Sobald der erste Tropfen gesammelt wurde, wechseln Sie schnell die Befehle auf Fernstart, Stopp und variablem 1,0 Milliliter pro Minute und drücken Sie „Play“, um die Fraktionssammlerschnittstelle zu aktivieren, damit sie jede Minute eine Milliliter-Fraktion sammelt.

Schließlich, nachdem die blaue Nachlaufflösung das letzte Gefäß erreicht hat, drücken Sie „Stop“. Die PolyZone-Profilierung ist eine entscheidende Technik, um die spezifische Beteiligung von PD-CD4 an IRAs-vermittelter Translation nachzuweisen. Beispielsweise wurden in diesem Experiment HEC 293-Zellen vorübergehend transfiziert, um die endogenen Mengen an PDC D vier zu reduzieren, und anschließend einer PolyZone-Profil-Analyse unterzogen.

Die Verringerung der PDC D vier-Spiegel beeinträchtigte nicht die globale Translation des Gens, wie durch das Fehlen von Veränderungen im PolyZone-Profil beurteilt. Beim Vergleich von SI-Kontroll- und IPD CD vier-behandelten Zellen blieb die Polysomenverteilung einer nicht-IRAs-Variante von XIAP zwischen behandelten und unbehandelten Zellen unverändert. Im Gegensatz dazu war die Polysomenverteilung der beiden IS-tragenden mRNAs XIAP und BCL XL signifikant verändert.

Bei Abwesenheit von PD-CD4 wurde die Verteilung dieser beiden mRNAs in die schweren Ribosomen verschoben. Da dies nicht mit Veränderungen der stationären Konzentrationen der XIAP- und BCL-XL-mRNA einhergeht, zeigen diese Ergebnisse eine verbesserte Translation von XIAP und BCL-XL in Zellen mit reduzierten PDCD4-Spiegeln, was durch die Western-Blossoming weiter bestätigt wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die mRNA-Translation durch die Herstellung einer Saccharose-Gradienten und die Trennung von Polysomen mittels Ultrazentrifugation gemessen wird.