Name: Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Immortalisierung von myogenen Zellen aus menschlichen Muskelbiopsien mittels FACS und viraler Transduktion mit CDK4 und hTERT. Diese Methode liefert unbegrenzte Zellen für die Erforschung von Muskelerkrankungen und Hochdurchsatz-Pharmakologie.

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Diese Veröffentlichung wird finanziert durch Cure CMD, ein Stipendium der Association Contre Les Myopathies (AFM) (Projekt 16297), und durch die National Institutes of Health (Fördernummern K08 AR059750, L40 AR057721 und 2R01NS047727).

HINWEIS: Protokolle für die Sammlung von menschlichem Gewebe muss überprüft und von der Institutional IRB Ausschuss genehmigt werden. Sammlung von verworfen, de-identifizierte menschliche Gewebe wurde von der Boston-Kinderklinik und Brigham and Womens Hospital IRB Ausschüsse zugelassen. Die nachfolgend beschriebenen Methoden zur Isolierung von myogenen Zellen aus deidentifiziert angewendet wurde, verworfen Gewebe. Die beschriebenen Verfahren sind für Gewebe von Patienten zugestimmt Material gesammelt. 1. Zellisolation <ol><li> Die Dissoziation von Muskelbiopsie und Reinigung von myogenen Zellen <ol><li> Pre-wiegen 10 cm Gewebekulturplatte in einer Gewebekultur Biosicherheit Haube und dann erneut wiegen die Platte, die die Muskelbiopsie, die Menge an Gewebe zu berechnen, getrennt werden. </li><li> Mit einer sterilen Skalpellen, Hackfleisch Muskelgewebe fein und fügen Sie ein paar Tropfen sterile 1x HBSS, um Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Jeweils Di 3,5 mlspase II und Collagenase D pro Gramm Muskelgewebe verdaut werden. Pipettieren des zerkleinerten Gewebes und Enzymlösung durch ein steriles 25 ml-Pipette ein paar mal. Inkubieren der Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 15 min und zu verdauen Gewebe, bis die Aufschlämmung leicht wenn eine sterile 5 ml-Pipette durchläuft. HINWEIS: Gewebedissoziation wird üblicherweise durch enzymatische Verdauung innerhalb 45-90 min erreicht wird. Bitte lesen Sie den Abschnitt &#39;Repräsentative Ergebnisse &quot;für weitere Informationen. </li><li> Hinzufügen von 2 Volumina sterilem Wachstumsmedium dissoziierten Gewebe, filtriert über ein 100 &amp; mgr; m Zellsieb über eine 50 ml konischen Röhrchen und Pellets Zellen für 10 min bei 329 × g (~ 1100 rpm) bei Raumtemperatur. Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für Medienzusammensetzung beziehen. </li><li> Das Pellet in 1 Volumen sterilen Wachstumsmedium und fügen 7 Volumen der roten Blutkörperchen Lyselösung. Filtern der Lösung durch ein 40 &amp; mgr; m Zellsieb dann pelle ter Zellen für 10 min bei 329 × g, Raumtemperatur. </li><li> Zählen der Zellen in einem Hämozytometer und Resuspendieren der Zellen in HBSS 1x 0,5% BSA in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / 100 &amp; mgr; l. Beiseite ~ 250.000 Zellen in einem einzigen Rohr, das als negative (ungefärbten) Steuerung verwendet wird. Beiseite zusätzliche einfarbigen gefärbt Kontrollröhrchen für Propidiumiodid und CD56, die für die ordnungsgemäße Anspritzung von CD56-positiven Zellen durch FACS-Sortierung erforderlich. Bitte beachten Sie die Sortierung Handbücher Zelle oder wenden Sie sich mit FACS-Sortierung Core Facility Experten zu entsprechenden Kontrollen zu gewährleisten enthalten sind. </li><li> Färben sich die Zellen mit 5 &amp; mgr; / 10 6 Zellen von anti CD56 Antikörper sortiert werden. Alle Proben (einschließlich Kontrollen) auf Eis inkubieren für 30 Minuten. </li><li> Waschproben in 10 ml 1x HBSS und Pellet-Zellen für 10 min bei 329 × g (~ 1100 rpm) in einer Kühlzentrifuge bei 4 ° C Temperatur. </li><li> Hinzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 1 ug / ml zu der Probe zu sein sorten für den Ausschluss von toten Zellen. Reinige myogenen CD56-positiven Zellen aus nicht-myogenen Zellen mit Hilfe der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer. </li></ol></li><li> Die Dissoziation von Hautbiopsie HINWEIS: Die dermale Fibroblasten aus einer Hautstanze von Patienten isoliert werden, wenn Muskelbiopsien sind nicht verfügbar. Hautfibroblasten als Biomaterial für viele Studien, einschließlich der Transduktion mit MyoD zu myogenen Zellen zu erzeugen genutzt werden. Zusätzlich können dermale Fibroblasten verwendet, um iPS-Zellen, die in verschiedenen Zelltypen, für die weitere Untersuchung unterschieden werden können erzeugen. <ol><li> Transportieren Sie die Hautbiopsie an das Labor in Transportmedium. Sobald die Probe empfangen wird, führen die primäre Kultur so schnell wie möglich. Wenn die primäre Kultur nicht am selben Tag ermittelt werden, speichern die Probe bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Übertragen der Hautprobe auf eine sterile 35 mm Petrischale in der Sterilbank. </li><li> Spülen Sie die Hautbiopsie in einer Petrischale mit steriler 1x PBS, Blut und Trümmer zu entfernen. Entfernen Sie das Fettgewebe mit einem sterilen Skalpell. </li><li> 2 ml Kollagenase-Lösung und zerkleinern das Gewebe mit Skalpell, Inkubation bei 37 ° C für 45 min bis 1 h, je nach der Größe des Gewebes. </li><li> Übertragen Sie die verdaute Gewebe zu einem 15 ml konischen Röhrchen, spülen Sie die Petrischale mit 2 ml Fibroblasten-Kulturmedium zweimal, und sammeln Sie das Medium in der gleichen Röhre. </li><li> Pelle Zellen bei 200 g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit 3 ml Fibroblastenmedium, um die Kollagenase wieder zu entfernen, dann Pellet-Zellen. Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für Medienzusammensetzung beziehen. </li><li> Wiederholen Sie den Schritt 1.2.7 noch einmal. </li><li> Re-suspend das Pellet in 5 ml Medium Fibroblasten und Plattenzellen auf einen T25 sterile Gewebekulturflasche. Der Kolben wird bei 37 ° C mit 5% CO 2 inkubiert. </li><li> Bewerten Sie die Kultur für Fibroblasten-Anhaftung und das Wachstum in den nächsten 1-3 Tagen. &lt;br /&gt; Hinweis: Einige kleine Gewebestücke können auch auf den Teller legen und Fibroblasten Migration von diesen Gewebestücken. </li><li> Aufrechterhaltung der Kultur unter den gleichen Bedingungen bis Fibroblasten auf etwa 80% Konfluenz gezüchtet. </li><li> Sammeln Fibroblasten durch Trypsinisierung und Transfer auf frische Kulturflaschen für weitere Expansion. Führen Trypsinierung entfernt, indem die Kulturen 3-mal in 1x PBS frei von Ca ++ und Mg ++. Hinzufügen Trypsin-EDTA (siehe Materialien Table) zu den Zellen (2 ml / T25-Kolben) für 2 min bei 37 ° C. </li><li> Split abgelösten Zellen in zusätzliche Kolben. Wenn einige Gewebestücke bleiben an der ursprünglichen T25-Kolben angebracht ist, mit 5 ml frischem Kulturmedium, um diesen Kolben und Fibroblasten erfolgt kontinuierlich zu migrieren. HINWEIS: Der expandierte Fibroblastenkultur setzt sich wie P1 eingefroren und in flüssigem Stickstoff für zukünftige Experimente gelagert werden. </li></ol></li></ol> 2. Immortalisierung von myogenen Zellen <ol><li&gt; Platte 5 Millionen Phoenix ecotropen Verpackungszellen (PE) über Nacht in einer 10 cm sterile Gewebekulturplatte in DMEM und Medium 199 in einem Verhältnis von 4: 1, mit 10% Kälberserum ergänzt. </li><li> Futterzellen 30 min vor der Transfektion mit 5 ml frischem Medium mit 10 mM Koffein ergänzt. </li><li> Homogenisieren einer Mischung von 2 ug Plasmid-DNA aus einem Midi prep (CDK4 oder hTERT-Plasmid) und Polyjet und Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min, wie vom Hersteller empfohlen. </li><li> Fügen Sie das Plasmid / PolyJet Mischung auf die PE-Zellen über Nacht. </li><li> Feed-Zellen mit frischem Medium (DMEM und Medium 199 in einem Verhältnis von 4: 1, das mit 10% Kälberserum). Zwölf Stunden später sammeln das virushaltige Überstand und filtern sie durch ein 0,45 um Porengrße-Filter. </li><li> Verwenden von 1 ml Überstand gesammelt, über Nacht amphotropen Verpackungszelllinie PA317 5 infizieren und zu einem stabilen Virus-produzierenden Zelllinie nach der Selektion mit entweder 0,5 mg / ml Neomycin (G418) für CDK4 oder 0,5 mg / ml Hygromycin hTERT. </li><li> Bereiten Sie Arbeits viralen Überständen durch Wachstum der stabilen Verpackungszellen in der Nähe der Konfluenz, dann die Ernte der Überstand jeden Morgen, Abend und Morgen für drei Ernten. </li><li> Filtern Sie die Virusüberständen und entweder direkt verwenden oder teilen sie in 1 ml Aliquots und bei -80 ° C für die spätere Verwendung. Beachten Sie, dass Virusüberstand verliert 50% Infektionseffizienz bei jedem Frost-Tau. Denken Sie daran, die Bleichmittel waschen vor dem Wegwerfen alles, was der Viruspartikel berührt hat. HINWEIS: Die stabile PA317 Virus-produzierende Zelllinie kann eingefroren und bei -150 ° C für die dauerhafte Speicherung beibehalten werden (Einfriermedium 10% DMSO, 90% Serum). </li><li> Platte FACS-gereinigte myogenen Zellen in einer Dichte von 5 x 10 4 Zellen / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen mit 0,1% Gelatine beschichtet (in Schritten 1.1-1.9 beschrieben). Sicherzustellen, dass die Zellen an der Platte vor der Virusinfektion hend angebracht. </li><li> Fügen Sie 400 ul gefiltert, freshly produzierte Virusüberstand oder gefrorenen Aliquots zu jedem Sechs-Well-Platte über Nacht (halten 2 Brunnen als Kontrollen). </li><li> Ändern Medium durch Zuführen Zellen mit 2,5 ml / Vertiefung frisches Muskelmedien (4: 1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Medium 199 mit 15% fötalem Rinderserum, 0,02 M HEPES-Puffer, 1,4 mg / l Vitamin B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / l Dexamethason, 2,5 ug / l Hepatozytenwachstumsfaktor und 10 ug / l basic fibroblast growth factor). Entsorgen Sie die Medien und Pipetten, die die Viruspartikel in einem Bleichbehälter. Lassen Zellen im gleichen Medium für 3 Tage, um vor Infektionen zu erholen, dann behandeln Sie zur Auswahl entweder mit 400 ug / ml Neomycin (CDK4 Infektion) oder 300 ug / ml Hygromycin (hTERT-Infektion). </li><li> Pflegen Zellen unter Medikamentenauswahl, bis die Zellen in der Kontrollschale Matrize (1-2 Wochen). </li><li> Passage-Zellen bevor sie konfluent werden (60-80% Konfluenz, unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA), selbst während der selectinach Zeitraum. Ausstrich Zellen in mehreren 10cm Gerichte mit frischen Myoblasten-Medium (wie in 2.11 beschrieben) mit der Auswahl Medikament ergänzt. Pflegen immortalisierten ausgewählte Zellen als heterogene Population oder klonieren, um eine vollständig homogene genetischen Hintergrund (das gleiche Insertion des Transgens in jeder Zelle) zu erhalten. </li><li> Führen klonalen Selektion mit den folgenden Schritten: <ol><li> Samen der Zellen bei niedriger Dichte (zB 300 bis 500 Zellen in 10 cm-Schalen) und halten sie für etwa zwei Wochen, bis kleine Kolonien werden (10-20 Zellen) gebildet. </li><li> Verringert sich die Medium an dieser Stelle, so dass nur eine dünne Folie, die Zellen nicht austrocknen. </li><li> Legen Sie ein Klonen Ring (mit einem Ende eingetaucht in Silikonvakuumfett) über jeden gewünschten Klon und ein paar Tropfen von Trypsin / EDTA. </li><li> Ernten Sie die Zellen, wenn sie geworden durch vorsichtiges Absaugen der Zellen unter Verwendung einer 1 ml Spitze oder eine Pasteur-Pipette und ihre Übertragung auf dem kleinsten verfügbaren Multiwell-pla abgerundette (96 oder 48, 24 oder 12-Well-Platten). </li><li> Erweitern Klone wie notwendig, um lokale Konfluenz zu verhindern. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Cells als Nützliche Ressource Die Isolierung und Kultivierung von myogene Zellpopulationen ist äußerst nützlich bei der Festlegung Krankheitsphänotypen oder in vitro-Modelle von Erkrankungen. Die hier beschriebene myogenen Zellisolierungsverfahren erlaubt die Isolierung von Myoblasten und Fibroblasten aus der Skelettmuskulatur Proben, die dann weitergegeben werden können, unterschieden, oder sofort analysiert. Myoblasten Struktur und Funktion kann durch mikroskopische Untersuchung A...

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Stacy C. Cossette
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Stacy A. Cossette

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Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Die molekulare Diagnostik hat sich in den letzten 20 Jahren dramatisch weiterentwickelt. Genomische DNA wird heute routinemäßig aus Sputum oder Wangenabstrich isoliert, während in der Vergangenheit eine Blutabnahme erforderlich war. Mit der derzeit schnellen Durchlaufzeit und der einfachen Gensequenzierung werden viele Krankheitsmutationen routinemäßig identifiziert, ohne dass zusätzliche Tests erforderlich sind. Bei der Diagnostik von Muskelerkrankungen hat die Identifizierung von Dutzenden neuer Gene in den letzten zehn Jahren, die entweder für Muskeldystrophie oder Myopathie verantwortlich sind, die Art und Weise, wie diese Krankheiten diagnostiziert werden, dramatisch verändert 1,2. Derzeit gibt es Dutzende von Genen, die als Ursachen für Muskeldystrophie und angeborene Myopathie identifiziert wurden, obwohl die Mechanismen, durch die viele dieser Gene Krankheiten hervorrufen, unklar bleiben. Insbesondere seltene Erkrankungen stellen aufgrund der geringen Größe der Patientenpopulationen eine Herausforderung dar. Für diese Fälle sowie für häufigere Krankheiten ist die Entwicklung stabiler Instrumente, die Studien über den Mechanismus der Pathogenese und das Screening von therapeutischen Arzneimitteln erleichtern, sehr wünschenswert. 
Trotz dramatischer Fortschritte in der DNA-Diagnostik werden bei vielen Patienten, bei denen der Verdacht auf eine primäre Stoffwechsel- oder Muskelerkrankung besteht, immer noch Muskelbiopsien durchgeführt, um die Primärdiagnose zu stellen. Wenn eine Muskelbiopsie notwendig ist, bietet sie die Möglichkeit einer zusätzlichen diagnostischen und Forschungsgewebeentnahme mit minimalem zusätzlichem Morbiditätsrisiko für den Patienten. Da es für jede Gewebeprobe eine Reihe von Anwendungen gibt, ist es äußerst wünschenswert, Techniken für die primäre Zellkultur unter Verwendung von chirurgischem Gewebe zu etablieren, die unkompliziert und effizient sind und minimale Mengen an Gewebe erfordern. Eine ordnungsgemäße Triage von Muskel- oder Hautbiopsien ist erforderlich, um die Isolierung der Primärzellen aus dem Gewebe und die langfristige Lagerung von lebendem Material zu maximieren. Darüber hinaus sind die Stammzellforschung und das Wirkstoffscreening vielversprechend für die Entwicklung von Therapien für viele Krankheiten mit zellbasierten Assays 3,4.
Wir beschreiben hier Methoden zur primären Zellisolierung aus menschlichen Muskel- oder Hautbiopsien. Darüber hinaus fügen wir ein Protokoll zur Immortalisierung myogener Zellen hinzu, das nützlich ist, um eine große Anzahl von Zellen aus einem Individuum zu erzeugen. Diese Zellen können für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, wie z. B. kundenspezifische Wirkstoffscreenings, die sonst mit der insgesamt geringen Anzahl von Zellen, die aus Primärgewebe gewonnen werden, nicht erreichbar wären.

<table><tbody><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gewebe&nbsp; Biosicherheitshaube für Kultur</td><td>Baker Company, Inc.</td><td>Modell SterilGuard Hood</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge, wie z. B. Beckman Model&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modell Allegra 6R</td><td>Wenn eine Zellsortierung durchgeführt wird, wird eine Zentrifuge mit Kühlung bevorzugt</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Modell Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur-Inkubator, angeschlossen an eine CO2 Quelle</td><td>Forma Scientific&nbsp;</td><td>Serie II</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer (FACS)</td><td>Becton Dickinson</td><td>Modell Aria</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien für die Isolierung von primären Myoblasten aus Gewebe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Science</td><td>#04942078001</td><td>Bereiten Sie eine Sockenlösung von 2,4 U/ml in DMEM</td></tr><tr><td>Collagenase D&nbsp;</td><td>Roche Applied Science</td><td>#088882001</td><td>Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mg/ml</td></tr><tr><td>1x steriler Strang vor s Ausgewogene Kochsalzlösung (HBSS), kalzium- und magnesiumfrei</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>#14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin, Fraktion V</td><td>Sigma</td><td>#05470</td><td>Bereiten Sie eine sterile&nbsp; Lösung von 1X HBSS 0,5% BSA für die FACS-Sortierung vor</td></tr><tr><td>Steriles Wachstumsmedium für Myoblasten: Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt (4,5 g), ergänzt mit 30 % fötalem Rinderserum</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Enthält L-Glutamin</td></tr><tr><td>RBC-Lyselösung</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid Stamm 10 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td>Bereiten Sie die Stammlösung vor, indem Sie das Pulver in sterilem destilliertem Wasser verdünnen</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD56-Antikörper für die Durchflusszytometrie</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td>APC-konjugierter Antikörper, andere Markierungen sind verfügbar</td></tr><tr><td>Reagenzien für die Immortalisierung von primären Myoblasten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ökotrope Verpackungszelllinie PE</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td></td></tr><tr><td>Amphotrope Verpackungszelllinie PA3174</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Schweinehautgelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890-500g</td><td>Bereiten Sie eine Stammlösung aus 0,1 % Gelatine in Wasser vor. Bestreichen Sie die Schale mit der Lösung bei 37°; C für eine Stunde. Entfernen Sie die Lösung und fügen Sie Medium hinzu.</td></tr><tr><td>PolyJet&nbsp;</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Fisher</td><td>345812</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>EMD Biosciences</td><td>400051 pBabe-Plasmide,</td><td></td></tr><tr><td>die mCDK4 und hTERT enthalten,</td><td>nicht kommerziell erhältlich</td><td></td><td>Stadler et al., 2013</td></tr><tr><td>Qiagen Plasmid Midiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>Mittel 199 (31150022)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiziertes Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>DMEM (11965-092)</td><td>Mix 4:1 DMEM:199</td></tr><tr><td>Myoblast Wachstumsmedium: 4:1 Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und Medium 199, ergänzt mit 15 % fötalem Rinderserum; 0,02 M HEPES-Puffer; 1,4 mg/l Vitamin B12; 0,03 mg/l ZnSO4, 0,055 mg/l Dexamethason, 2,5 μm; g/L Hepatozyten-Wachstumsfaktor und 10 &mu; g/L Beta-Fibroblasten-Wachstumsfaktor.</td><td>Lebenstechnologie (DMEM, F199); Atlanta Biologisch (FBS); Invitrogen (Hepes); Fischer (Zinksulfat); Sigma (Vitamin B12, Dexamethason); Chemicon international (HGF); Biopionier (betaFGF)&nbsp;</td><td>#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).&nbsp;</td><td>Bereiten Sie das Medium und die Stammlösung Vit. B12 (20 mg/ml) vor; ZinkSulfat (60&Mikro; g/ml); Dex (55&Mikro; g/&micro; L) Separat für eine einfachere Handhabung. HGF-Stammlösung (5&micro; g/ml) und FGF (20&micro; g/ml) sollte jede Woche frisch in der endgültigen Arbeitskonzentration zugegeben werden.</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Myosin-Schwerketten-Antikörper für die Immunfärbung</td><td>Entwicklungshybridoma Bank</td><td>MF20</td><td>Klon MF20</td></tr><tr><td>Desmin Antikörper für die Immunfärbung</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-376-S0</td><td>Klon D33</td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien für die Isolierung von primären Fibroblasten</td> in der Haut<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transportmedium: RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 0,2 % Penicillin/Streptomycin</td><td>RPMI-Medium 1640: GIBCO Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Primäres Fibroblasten-Kulturmedium für den Menschen: RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin/Streptomycin</td><td>Fötales Rinderserum: Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaselösung: Kollagenase Typ 2 (100 mg), resuspendiert in 12,5 ml Fibroblasten-Kulturmedium und filtersterilisiert</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1X Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) Calcium- und Magnesiumfrei</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Materialien für die Isolierung von primären Myoblasten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml und 15 ml sterile konische Röhrchen</td><td>GeneMate/Bioexpress</td><td>C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Skalpelle</td><td>Aspen Surgical</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 5-, 10- und 25-ml-Pipetten</td><td>Bellco-Glas</td><td>1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ; 1228-25050 (25 ml)</td><td>Wiederverwendbare Pipetten werden vor Gebrauch gewaschen, mit Watte verschlossen und autoklaviert</td></tr><tr><td>Sterile, mit Gewebekulturen behandelte Kunststoffschalen (10 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Zellsiebe aus Nylon (100 & Mikro; M und 40 &Micro; m Größe)</td><td>BD Falcon</td><td>352340 (40&Mikro; m); 352360 (100&Mikro; m)</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Materialien für die Immortalisierung</td><td></td><td></td><td></td>von Myoblasten</tr><tr><td>Steril 0,45 &Mikro; m Filter</td><td>Millipore</td><td>SLHV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Klonringe</td><td>Corning</td><td>#3166-8</td><td>Vor und nach dem Gebrauch zu reinigen und zu autoklavieren</td></tr><tr><td>Materialien für Fibroblasten-Zelllinien&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 35 mm Gewebekultur-behandelte Kunststoffschalen</td><td>Greiner bio-one</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Skalpelle</td><td>DeRoyal</td><td>D4510A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile T25 Gewebekulturflaschen</td><td>Techno Plastic Product, TPP</td><td>90026</td><td>in den USA von MIDSCI</td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>GIBCO Life Technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und immortalisierung von patienten stammende zelllinien von muskelbiopsie for disease modeling

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

Die Erzeugung patientenspezifischer Zelllinien stellt ein unschätzbares Werkzeug für die diagnostische oder translationale Forschung dar, und diese Zellen können aus Haut- oder Muskelbiopsiegewebe entnommen werden, das während der diagnostischen Abklärung des Patienten verfügbar ist. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zur Isolierung lebender Zellen aus kleinen Mengen von Muskel- oder Hautgewebe für die primäre Zellkultur. Darüber hinaus bieten wir eine Technik zur Immortalisierung von myogenen Zelllinien und Fibroblastenzelllinien aus Primärzellen an. Sobald die Zelllinien immortalisiert sind, kann eine erhebliche Expansion der vom Patienten stammenden Zellen erreicht werden. Immortalisierte Zellen sind für viele nachgelagerte Anwendungen geeignet, einschließlich Wirkstoffscreening und In-vitro-Korrektur der genetischen Mutation. Insgesamt bieten diese Protokolle ein zuverlässiges Werkzeug zur Erzeugung und Konservierung von patienteneigenen Zellen für nachgelagerte Anwendungen.

1 zeigt einige der Hauptschritte in der Primär Gewebedissoziation beteiligt: ​​die genaue Menge an Gewebe in einem sterilen Gewebekulturpetrischale eingewogen (1A, B). Das Gewebe wird dann fein zerkleinert unter Verwendung von sterilen Skalpellen, bis eine Gewebe Aufschlämmung erhalten (1C, D). Nach der Zugabe der Verdauungsenzyme, primäre Muskelgewebe Dissoziation wird üblicherweise durch enzymatische Verdauung innerhalb 45-90 min erreicht wird. Das Fortschreiten der G...

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Isolierung lebender Zellen und zur Primärkultur von myogenen und Fibroblasten-Zelllinien aus Muskel- oder Hautgewebe. Auch eine Technik zur Immortalisierung dieser Zelllinien wird beschrieben. Insgesamt bieten diese Protokolle ein zuverlässiges Werkzeug zur Erzeugung und Konservierung von patienteneigenen Zellen für nachgelagerte Anwendungen.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, gereinigte Muskelzellen aus menschlichen Muskelbiopsien von Patienten zu isolieren und sie für nachgeschaltete Untersuchungen zu immortalisieren. Dies wird erreicht, indem das gesammelte Gewebe zunächst gewogen, zerkleinert und verdaut wird, um die mononukleären Zellen zu dissoziieren. Als zweiter Schritt werden die myogenen Zellen durch FACS von nicht-myogenen Zellen abgetrennt.Anschließend werden myogene Zellen mit CDK vier und H turt infiziert, um immortale Zellen zu erzeugen. Die Ergebnisse zeigen, dass aus Patienten gewonnene lebende Muskelzellen über mehrere Passagen hinweg expandiert und anhand von Zellfusionsassays, dem Vorhandensein von zuckenden Myoröhren sowie der Expression myogener Marker differenziert werden können. Die Bedeutung dieser Technik reicht über die Diagnose von Muskelerkrankungen hinaus, da sie potenziell eine unbegrenzte Anzahl myogener Zellen für die Wirkstoffscreening oder andere nachgeschaltete Anwendungen bereitstellen kann, bei denen eine hohe Zellzahl erforderlich ist.Ich werde das Verfahren gemeinsam mit Jerome Robbin, einem Postdoktoranden aus dem Labor von Dr. Woody Wright in Dallas, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Dissoziation der Muskelbiopsie, um die myogenen Zellen zu reinigen. Zunächst im Gewebekultur-Biosicherheitswerkbank die Masse der Muskelbiopsie bestimmen.Als Nächstes das Gewebe in einer 10 cm-Dish mit sterilen Skalpellen in fein gehackte Stücke zerkleinern. Pro Gramm Gewebe einige Tropfen eines X-H-B-S-S hinzufügen, damit das Gewebe nicht austrocknet. 3,5 Milliliter Disc-Paste 2 und 3,5 Milliliter Kollagenase D-Lösung zugeben.Anschießend die Zellen mit einer 25-Milliliter-Pipette mischen und die Platte alle 15 Minuten in einen Inkubator überführen. Die Zellen innerhalb von 90 Minuten mit einer Fünf-Milliliter-Pipette mischen. Es sollte eine vollständige Gewebedissoziation erfolgen.Nach der Gewebe-Dissociation zwei Volumina Wachstumsmedium hinzufügen und durch einen 100-Mikron-Filter sieben. Das Filtrat in einem 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. Die Zellen aus dem Filtrat bei 329 ×g für 10 Minuten bei Raumtemperatur pelletieren.Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in HBSS mit 0,5 % BSA und zählen Sie sie. Stellen Sie das Volumen so ein, dass 1 Million Zellen pro 100 Mikroliter vorliegen. Legen Sie eine Aliquotprobe mit 250.000 Zellen als unbehandelte Kontrolle beiseite und bereiten Sie zwei ähnliche Aliquotproben für Einzelfärbekontrollen vor.Diese sind alle für die Fax-Analyse erforderlich. Färben Sie die Zellen mit fünf Mikrolitern Anti-CD56-Antikörper pro Million Zellen und inkubieren Sie alle Proben eine halbe Stunde lang auf Eis. Waschen Sie anschließend die Proben schnell mit 10 Milliliter HBSS.Sedimentieren Sie dann die Zellen wie zuvor, jedoch bei vier Grad Celsius; nachdem die Zellen sedimentiert wurden, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in 1x H-B-S-S auf 5 Millionen Zellen pro Milliliter. Fügen Sie dann Propidiumiodid auf eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Reinigen Sie nun die myogenen CD56-positiven Zellen von den nicht-myogenen Zellen mittels FACS gemäß der Reinigungsplatte.Die myogenen Zellen bei 50.000 pro Vertiefung in mit 0,1 % Gelatinkultur beschichteten Sechswell-Platten, bis die Zellen angeheftet sind, anschließend infizieren sie mit Virus zur Immortalisierung der Zelllinie. Im Textprotokoll befindet sich eine zusätzliche Übersicht zur Reinigung und Kultivierung dermaler Fibroblasten, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie Phoenix-tropische Zellen vor, nachdem Sie die Phoenix-tropischen Zellen über Nacht mit der Plasmid-PolyJet-Mischung inkubiert haben.Versorgen Sie die Zellen mit frischem Medium, das aus vier Teilen DME M1, einem Teil Medium 199 und 10 % Kalbsserum besteht. Bereiten Sie außerdem die inotrope Verpackung vor. Säen Sie PA-17-Zellen in einer sechs-well-Platte mit jeweils etwa 400.000 PA-17-Zellen pro Vertiefung aus.12 Stunden später sammeln Sie das Virus enthaltende Überstand über den Phoenix-tropischen Zellen und filtrieren ihn durch einen 0,45-Mikron-Filter. Anschließend verwenden Sie ein Milliliter des Überstandes, um die PA-three-17-Zellen zu infizieren, und kultivieren diese über Nacht. Am nächsten Tag selektieren Sie eine virusproduzierende Zelllinie aus den PA-three-17-Zellen, indem Sie Antibiotika in einer Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter dem Medium zusetzen, sobald die Zellen nahezu konfluent sind, und sammeln den Überstand von den Zellen dreimal in Abständen von jeweils 12 Stunden.Filtern Sie die Sammlungen nach jeder Ernte. Der Filtrat ist das verwendete virale Überstand. Teilen Sie ihn in Aliquote zu je einem Milliliter auf.Stellen Sie einige Aliquote für den sofortigen Gebrauch beiseite. Die zusätzlichen Aliquote können bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, verlieren jedoch bei jedem Gefrier-Tau-Zyklus 50 % ihrer Wirksamkeit. Beachten Sie, dass während des gesamten Prozesses Geräte, die mit den Viruspartikeln in Kontakt gekommen sind, vor dem Entsorgen im Abfallbehälter mit Bleichmittel gereinigt werden müssen.Um die stabile PA drei 17 Virus-produzierende Zelllinie dauerhaft zu lagern, einfrieren Sie die Zellen in 10 % DMSO, 90 % Serum und lagern Sie sie bei minus 150 Grad Celsius pro wohl gereinigte Zelle. In einer sechs-Loch-Platte geben Sie 400 Mikroliter frisch hergestelltes virales Überstand hinzü. Lassen Sie zwei Löcher ohne Virus als Kontrollen.Die Platte über Nacht inkubieren und am nächsten Tag das Medium in jedem Wells durch 2,5 Milliliter frisches Muskelmedium ersetzen. Dabei sicherstellen, dass das Medium und die Pipetten, die virale Partikel enthalten, in den Bleichmittelbehälter entsorgt werden. Die Zellen drei Tage lang in frischem Muskelmedium inkubieren lassen.Anschießend die Zellen mittels 400 Mikrogramm Neomycin pro Milliliter für die CDK-vier-Infektion oder 300 Mikrogramm Hygromycin pro Milliliter für humane Telomerase auf Antibiotikaresistenz auswählen. Eine bis zwei Wochen lang Infektion mit Reverse Transkriptase durchführen. Die Zellen unter selektiven Bedingungen kultivieren, bis die Zellen in den Behandlungs- und Kontrollansätzen vollständig abgestorben sind.Passagieren Sie die Zellen immer, bevor sie konfluent werden, auch während der Selektion, wenn sie 60 bis 80 % Konfluenz erreichen. Verwenden Sie eine 0,05 %ige Trypsin-EDTA-Lösung, um die Zellen zu lösen und zu passagieren. Überführen Sie die Zellen in 10 cm-Dishs mit frischem Myoblastenmedium mit Antibiotika. Säen Sie die Zellen zunächst mit einer sehr geringen Dichte von drei bis 500 pro 10 cm-Dish aus.Züchten Sie die Zellen in diesen Schalen etwa zwei Wochen lang, bis sich kleine Kolonien mit 10 bis 20 Zellen bilden. Sobald die kleinen Kolonien sichtbar sind, entfernen Sie den größten Teil des Mediums, wobei lediglich ein dünner Film verbleiben sollte, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen. Bestreichen Sie nun eine Seite eines Klonierungsringes mit Silikon-Vakuumschmiermittel und setzen Sie den Ring über einen gewünschten Klon.Platzieren Sie einen separaten Ring um jeden gewünschten Klon in jedem Ring. Geben Sie einige Tropfen Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Wenn sich die Zellen abgerundet haben, saugen Sie mit einem Mikroskop vorsichtig jeden Zellhaufen in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf.Überführen Sie die Zellknäuel in die Vertiefungen der kleinsten verfügbaren Mehrfachplatte. Danach expandieren Sie jeden Klon nach Bedarf, um Konfluenz zu vermeiden. Mit dem beschriebenen Protokoll wurden myogene Zellen zusammen mit Fibroblasten, adipogenen Zellen und möglicherweise Immunzellen isoliert und anschließend mittels FACS gereinigt.Anschließend wurden die Zellen wie beschrieben durch Viren, die die zyklusabhängige Kinasen vier, CDK vier, und das humane Telomerase-Rücktranskriptase h turt exprimieren, immortalisiert. Es war entscheidend, die Platten in jedem Schritt unter Konfluenz zu halten, da sie sonst das Differenzierungsprogramm starten und Myotuben bilden könnten. Beim Vergleich der Myotubenbildung und -kontraktion in nicht-immortalisierten Kontrollzellen und den immortalisierten Zellen zeigten sich keine Unterschiede.Die Immortalisierung der Zelllinie wurde durch die Messung der Telomerlänge und der Telomeraseaktivität bestätigt. Die Immortalisierung zeigte sich zudem in den Zellwachstumskurven. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre Muskelzellen aus einer Patientenbiopsie isoliert werden können.Immortalisieren Sie die primären Myoblasten und isolieren und selektieren Sie immortalisierte myogene Klone. Beachten Sie, dass die Arbeit mit Viren die Nutzung eines spezifischen Zellkulturschirms und einer sicheren Belüftungsanlage erfordert. Außerdem müssen alle Materialien, die bei der Virenmanipulation verwendet werden, wie Pipetten, Spitzen, Schalen, Spritzen und Filter, mit Bleichmittel behandelt werden, um eine unerwünschte Kontamination zu vermeiden.Viruspartikel können gefährlich sein, und es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der...

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Die wichtigsten adhärenten Zelltypen, die aus dem menschlichen Muskel stammen, sind myogene Zellen und Fibroblasten. Hierbei werden Zellpopulationen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung auf Basis des CD56-Antigens angereichert. Die anschließende Immunmarkierung mit spezifischen Antikörpern und der Einsatz von Bildanalysetechniken ermöglicht die Quantifizierung der zytoplasmatischen und nukleären Eigenschaften in einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

Dieses Protokoll verwendet Elektroporation, um fluoreszenzmarkierte Proteine in Muskelfasern von Mäusen einzuführen und zu exprimieren. Nach der Wiederherstellung nach der Elektroporation werden die Fasern isoliert. Einzelne Fasern werden dann mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie abgebildet, um die Muskelstruktur sichtbar zu machen.

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine ​​zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.

Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung

Wir präsentieren Techniken zur Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Primärmuskelvorläuferzellen (hMPCs), die aus Skelettmuskelbiopsiegewebe gewonnen werden.  hMPCs, die durch diese Methoden gewonnen und charakterisiert werden, können anschließend verwendet werden, um Forschungsfragen im Zusammenhang mit menschlicher Myogenese und Skelettmuskelregeneration zu behandeln.

Isolation, Kultur, Charakterisierung und Differenzierung menschlicher Muskelprogenitorzellen aus dem Skelettmuskelbiopsieverfahren

Myoblaste sind proliferierende Vorläuferzellen, die sich unterscheiden, um polynukleierte Myotuben und schließlich Skelettmuskelmyofien zu bilden. Hier stellen wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultur von primären Myoblasten von jungen erwachsenen Mausskelettmuskeln vor. Die Methode ermöglicht molekulare, genetische und metabolische Studien von Muskelzellen in der Kultur.

Isolierung und Differenzierung von primären Myoblasten von Mausskelettmuskelexplants

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Muskelstammzellen und fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus einzelnen Skelettmuskeln bei Mäusen. Das Protokoll umfasst die Dissektion einzelner Muskeln, die Isolierung von Stammzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, die Reinheitsbewertung durch Immunfluoreszenzfärbung und die quantitative Messung des S-Phaseneintritts mittels 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin-Inkorporationsassay.

Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Erfahren Sie die Isolierung und Immortalisierung von myogenen Zellen aus menschlichen Muskelbiopsien mittels FACS und viraler Transduktion mit CDK4 und hTERT. Diese Methode liefert unbegrenzte Zellen für die Erforschung von Muskelerkrankungen und Hochdurchsatz-Pharmakologie.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

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