Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, gereinigte Muskelzellen aus Muskelbiopsien von menschlichen Patienten zu isolieren und sie für nachgelagerte Studien zu verewigen. Dies wird erreicht, indem das gesammelte Gewebe zunächst gewogen, zerkleinert und verdaut wird, um die mononukleären Zellen zu dissoziieren. In einem zweiten Schritt werden die myogenen Zellen durch Fakten von nicht-myogenen Zellen gereinigt.

Als nächstes werden myogene Zellen sowohl mit CDK four als auch mit H turt infiziert, um immortalisierte Zellen zu erzeugen. Die Ergebnisse zeigen, dass von Patienten stammende lebende Muskelzellen über mehrere Passagen hinweg expandiert und auf der Grundlage von Zellfusionsassays, dem Vorhandensein von zuckenden Myotuben und der Expression myogener Marker differenziert werden können. Die Auswirkungen dieser Technik gehen über die Diagnose von Muskelerkrankungen hinaus, da sie potenziell eine unbegrenzte Anzahl myogener Zellen für das Wirkstoffscreening oder andere nachgelagerte Anwendungen bereitstellen kann, bei denen eine hohe Anzahl von Zellen erforderlich ist.

Ich werde das Verfahren zusammen mit Jerome Robbin, einem Postdoktoranden aus dem Labor von Dr. Woody Wright in Dallas, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Dissoziation der Muskelbiopsie, um die myogenen Zellen zu reinigen. Erfassen Sie zunächst in einer Biosicherheitshaube der Gewebekultur die Masse der Muskelbiopsie.

Anschließend in einer 10 Zentimeter großen Schüssel das Taschentuch mit sterilen Skalpellen in fein gehackte Stücke zerkleinern. Fügen Sie ein paar Tropfen eines X-H-B-S-S hinzu, damit das Gewebe pro Gramm Gewebe nicht austrocknet. Fügen Sie 3,5 Milliliter Disc-Paste, zwei und 3,5 Milliliter Kollagenase D-Lösungen hinzu.

Mischen Sie dann die Zellen mit einer 25-Milliliter-Pipette und geben Sie die Platte alle 15 Minuten in einen Inkubator. Mischen Sie die Zellen mit einer Fünf-Milliliter-Pipette innerhalb von 90 Minuten. Es sollte eine vollständige Gewebsdissoziation stattfinden.

Sobald das Gewebe dissoziiert ist, fügen Sie zwei Volumina Wachstumsmedium hinzu und filtrieren Sie es durch ein 100-Mikron-Sieb. Sammeln Sie das Filtrat in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Die Zellen aus dem Filtrat bei 329 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur pelletieren.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in HBSS mit 0,5 % BS, A und zählen Sie sie. Passen Sie das Volumen an, um 1 Million Zellen pro 100 Mikroliter zu erhalten. Ein Aliquot mit 250.000 Zellen wird als ungefärbte Kontrolle beiseite gelegt, und zwei ähnliche Aliquote sind für die Kontrollen mit nur einer Färbung vorgesehen.

All dies wird für die Faxanalyse benötigt. Färben Sie nun die Zellen mit fünf Mikrolitern Anti-CD-56-Antikörper pro Million Zellen und inkubieren Sie alle Proben eine halbe Stunde lang auf Eis. Waschen Sie die Proben anschließend schnell mit 10 Millilitern HBSS.

Pelletieren Sie dann die Zellen wie zuvor, aber bei vier Grad Celsius nach dem Pelletieren der Zellen, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem X-H-B-S-S bei 5 Millionen Zellen pro Milliliter. Geben Sie dann Propidiumiodid bis zu einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Reinigen Sie nun die myogenen CD 56-positiven Zellen von den nicht-myogenen Zellen anhand von Fakten, die auf die Reinigungsplatte folgen.

Die myogenen Zellen bei 50.000 pro Well in sechs Well-Platten, die mit 0,1% Gelatinekultur beschichtet sind, infizieren die Zellen bis zu ihrer Anhaftung, dann infizieren sie mit Viren für die Zelllinie unsterblich. Im Textprotokoll gibt es eine zusätzliche Überprüfung, wie dermale Fibroblasten gereinigt und kultiviert werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie die Phönix-Tropenzellen vor, nachdem Sie die Phönix-Tropenzellen über Nacht mit der Plasmid-PolyJet-Mischung inkubiert haben.

Füttern Sie die Zellen frisch, medium, bestehend aus vier Teilen DME M1, einem Teil medium, 1 99 und 10% Kälberserum. Bereiten Sie auch inotrope Verpackungen vor. PA drei 17 Zellen in einer Sechs-Well-Platte mit etwa 400.000 PA drei 17 Zellen pro Well.

12 Stunden später sammeln Sie das virushaltige Überstand über den Phoenix-Tropenzellen und leiten Sie es durch einen 0,45-Mikron-Filter. Anschließend wird mit einem Milliliter des Überstands die PA drei 17-Zellen infiziert und über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wählt man für eine Virus-produzierende Zelllinie aus der PA drei 17-Zellen aus, indem man Antibiotika in einer Menge von 0,5 Milligramm pro Milliliter auf das Medium aufträgt, wenn die Zellen nahezu kofluenzfähig sind, und erntet den Überstand dreimal in 12-Stunden-Intervallen von den Zellen.

Filtern Sie die Kollektionen nach jeder Ernte. Das Filtrat ist der funktionierende Virusüberstand. Teilen Sie es in einen Milliliter. Aliquots.

Legen Sie ein paar Aliquots für den sofortigen Gebrauch beiseite. Die zusätzlichen Aliquots können bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, verlieren aber mit jedem Gefrierauftauzyklus um 50 % an Effizienz. Beachten Sie, dass in der gesamten Prozessausrüstung, die mit den Viruspartikeln in Berührung gekommen ist, Bleiche gewaschen werden muss, bevor sie in den Mülleimer geworfen werden.

Um die stabile PA drei 17 Viren produzierende Zelllinie dauerhaft zu lagern, frieren Sie die Zellen in 10 % DMSO 90 % Serum ein und lagern Sie sie bei minus 150 Grad Celsius in jeder Vertiefung der faxgereinigten Zellen. In eine Sechs-Well-Platte werden 400 Mikroliter frisch hergestellter Virusüberstand gegeben. Lassen Sie zwei Vertiefungen ohne Viren als Kontrollen.

Inkubieren Sie die Platte über Nacht und wechseln Sie am nächsten Tag das Medium in jeder Vertiefung auf 2,5 Milliliter frisches Muskelmedium. Achten Sie darauf, die Medien und Pipetten, die Viruspartikel enthalten, in den Bleichmittelbehälter zu werfen. Lassen Sie die Zellen drei Tage lang in den frischen Muskelmedien inkubieren.

Wählen Sie dann die Zellen für die Antibiotikaresistenz aus, indem Sie 400 Mikrogramm Neomycin pro Milliliter für eine CDK-4-Infektion oder 300 Mikrogramm Hygromycin pro Milliliter für die menschliche Telomerase verwenden. Reverse-Transkriptase-Infektion für ein oder zwei Wochen. Halten Sie die Zellen unter den selektiven Bedingungen, bis die Zellen und die Kontrollvertiefungen alle tot sind.

Passieren Sie die Zellen immer, bevor sie konfluent werden, auch während der Selektion, wenn sie eine Co-Flüssigkeit von 60 bis 80 % erreichen, verwenden Sie eine 0,05%ige Tripsin-EDTA-Lösung, um die Zellen zu sammeln und zu passieren. Geben Sie die Zellen in 10 Zentimeter große Schalen mit frischen Myoblasten, Medium mit Antibiotika. Zuerst säen Sie die Zellen in einer sehr geringen Dichte von drei bis 500 pro 10 Zentimeter Schale.

Halten Sie die Zellen etwa zwei Wochen lang in diesen Schalen, bis sich kleine Kolonien von 10 bis 20 Zellen bilden, wenn die kleinen Kolonien sichtbar sind. Entfernen Sie die meisten Medien, so dass nur ein dünner Medienfilm übrig bleibt, um die Zellen vor dem Austrocknen zu schützen. Tauchen Sie nun eine Seite eines Klonrings in Silikon-Vakuumfett und den Ring über einen gewünschten Klon.

Legen Sie einen anderen Ring um jeden gewünschten Klon in jedem Ring. Fügen Sie ein paar Tropfen Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Wenn die Zellen abgerundet sind, verwenden Sie ein Mikroskop, um jede Zellkugel vorsichtig in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze zu aspirieren.

Übertragen Sie die Zellkugeln in Wells der kleinsten verfügbaren Multi-Well-Platte. Erweitern Sie dann jeden Klon nach Bedarf, um Co-Fluenz zu verhindern. Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurden myogene Zellen zusammen mit Fibroblasten, adipogenen Zellen und möglicherweise Immunzellen isoliert und dann durch Fakten gereinigt.

Die Zellen wurden dann wie beschrieben mit Viren immortalisiert, die die Cyclin-abhängige Kinase vier, CDK vier und die humane Telomerase-Reverse-Transkriptase h turt exprimieren. Es war entscheidend, die Schalen bei jedem Schritt unter der Kofluenz zu halten, da sie in das Differenzierungsprogramm eintreten und Myotuben bilden konnten, indem sie die Bildung und Kontraktion von Myotuben in nicht immortalisierten Kontrollzellen und den immortalisierten Zellen verglichen. Es wurden keine Unterschiede festgestellt.

Die Unsterblichkeit der Zelllinie wurde durch Messung der Telomerlänge und der Telomereaktivität bestätigt. Immortal war auch an den Zellwachstumskurven ersichtlich. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre Muskelzellen von der Patientenbiopsie trennt.

Immortalisierung des primären Myoblasten und Isolierung und Selektion immortalisieren myogene Klone. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Viren die Verwendung einer speziellen Gewebekulturhaube und eines sicheren Belüftungssystems erfordert. Darüber hinaus müssen alles, was mit der Virusmanipulation zu tun hat, wie Pipetten, Spitzen, Schalen, Spritzen und Filter, gebleicht werden, um eine unerwünschte Kontamination zu vermeiden.

Viruspartikel können gefährlich sein und es sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, während dieses Verfahrens durchgeführt wird.