طريقة معزولة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد نموذج متسق لتروية رئة الجرذ خارج الجسم (ex vivo) من شأنه أن يعطي نتائج قابلة للتكرار. تتمثل الخطوة الأولى في قنطرة الرغامي وبدء التهوية الميكانيكية. بعد ذلك، يتم قنطرة الشريان الرئوي والأذين الأيسر.

تتمثل الخطوة النهائية في إخراج كتلة القلب والرئة من التجويف الصدري ووضعها في دائرة تروية الرئة خارج الجسم. وفي النهاية، تُستخدم مستشعرات الضغط، ومحولات قياس الوزن، ومحلل غازات الدم لإظهار حالة الرئة في الوقت الفعلي عن طريق قياس ضغط الشريان الرئوي ومعايير أخرى. وتعد تروية الرئة خارج الجسم تقنية متميزة سمحت لنا بتوسيع نطاق المانحين لعمليات زراعة الرئة.

نتوقع أنه من خلال استخدام هذه التقنية كمنصة لتقييم الأعضاء، سنتمكن من تحسين جودة الأعضاء المخصصة للزرع، وبالتالي تحسين نتائج عمليات الزرع بشكل عام. لقد صغنا في مختبر Copper عبارة "تسليح العضو" (arming the organ)، والتي تعني تقييم العضو، أو إعادة تشكيله، أو إصلاحه، ثم تعديله لتحسين جودته وبالتالي تحسين نتائج الزرع. لقد طورنا نموذجاً قوياً وقابلاً للتكرار لتروية الرئة خارج الجسم (ex vivo lung perfusion) باستخدام الجرذان كحيوانات تجارب صغيرة.

من خلال هذا الفيديو، سنقوم باستعراض الخطوات الأساسية والحاسمة لتطوير نموذج تروية الرئة خارج الجسم (ex vivo)، والذي يمكن أن يعمل بعد ذلك كمنصة لأبحاث التروية والزراعة. ابدأ بتجهيز دائرة تروية الرئة خارج الجسم (EVLP) وتدوير محلول التروية الدافئ في جميع أنحاء النظام. اضبط حمام الماء الدافئ، والمبادل الحراري، والصدر الاصطناعي على 37 درجة Celsius.

مرر غازاً منزوع الأكسجين عبر جهاز PERFUSE eight في مرشح الغاز لضمان وجود أكسجين مذاب بنسبة 6% تقريباً من أجل التجربة. بعد فتح برنامج الحصول على البيانات، قم بتوصيل محول ضغط الشريان الرئوي، ومحول الضغط التفاضلي الرغامي، ومحول الضغط التفاضلي لتدفق التنفس، ومحول وزن الرئة، ومحول سرعة المضخة بصندوق المحول التناظري الرقمي. أخيراً، قم بإعداد طاولة العمليات وتجهيز جميع الأدوات والمستلزمات الجراحية اللازمة للإجراء.

بعد التحقق من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم، ضع الحيوان المخدر في وضعية الاستلقاء الظهري على طاولة العمليات. ابدأ بتسجيل البيانات باستخدام برنامج الحصول على البيانات. وعندما تكون مستعداً، ادخل إلى التجويف البطني واحقن الهيبارين في الوريد الأجوف السفلي.

وفقاً للإجراءات القياسية، قم بتركيب كانيولا في القصبة الهوائية وقم بتوصيل الكانيولا بدائرة التهوية. قم بتشغيل جهاز التنفس الاصطناعي لبدء تهوية الرئتين ميكانيكياً. بعد ذلك، قم بإبعاد أنسجة التجويف الصدري لكشف الرئتين مع الحرص على تجنب لمسهما.

أزل الغدة الزعترية وقم بإزاحة محتويات البطن إلى أحد الجانبين للكشف عن الوريد الأجوف السفلي أو الوريد المساريقي. بعد القتل الرحيم، ضع غرزة حريرية خلف الشريان الرئوي والشريان الأورطي. وتحضيراً لتثبيت كانيولا الشريان الرئوي، قم بعمل شق يتراوح طوله بين 2 إلى 3 ملم على السطح الأمامي لمسار تدفق البطين الأيمن وأدخل الكانيولا في الشريان الرئوي الرئيسي.

قم بالتثبيت باستخدام غرزة حريرية، وأزل الجلطات من الأوعية الدموية الرئوية عن طريق تروية ما يقرب من 15 milliliters من محلول إلكتروليتي موجب منخفض البوتاسيوم عبر الشريان الرئوي ومن ثم إخراجه عبر قمة القلب. بعد ذلك، ضع غرزة حريرية خلف القلب وحول البطينين. ولتوسيع الصمام المترالي وتسهيل عملية القسطرة، أدخل ملقطاً جراحياً صغيراً في القمة عبر الصمام المترالي وصولاً إلى الأذين الأيسر.

عندما تكون جاهزاً، أدخل كانيولا في القمة عبر الصمام التاجي وصولاً إلى الأذين الأيسر. ثبت كانيولا الأذين الأيسر باستخدام خيط جراحي حريري. بعد ذلك، صِل كانيولا الشريان الرئوي بدائرة التهوية المباشرة للرئة خارج الجسم (EVLP).

تأكد من تحضير خط التدفق الداخل القادم من الدائرة باستخدام perfuse eight. ولمنع دخول الهواء إلى القلب والرئتين، قم بتشغيل مضخة 연동 الرئيسية واضبطها على سرعة منخفضة؛ مما يسمح لـ perfuse eight بالتدفق عبر الشريان الرئوي والخروج من البطين الأيسر إلى تجويف الصدر.

راقب ضغط الشريان الرئوي للتأكد من عدم حدوث ارتفاع مفاجئ يشير إما إلى وجود انسداد أو سوء في وضع القنية. عند الجاهزية، أوقف تشغيل المضخة التمعجية. قم بتوصيل قنية الشريان الرئوي بدائرة تروية الرئة خارج الجسم.

لا تقم بتوصيل كانيولا الأذين الأيسر بالدائرة حتى يتم إخراج كتلة القلب والرئة من الجسم. قم بإزالة كتلة القلب والرئة عن طريق تثبيت المريء باستخدام ملقط مرقئ (hemostat) والقص أسفل الملقط بحيث يمكن استخدام المريء لرفع الهياكل القلبية الرئوية بطريقة غير حادة، ثم قم بتسليك الأنسجة المحيطة وقص الأبهر النازل والأوعية المساعدة لتحرير كتلة القلب والرئة أثناء رفعها عبر المريء. اقطع الرغامي لتحرير كتلة القلب والرئة ثم ضعها في الموقع المخصص لها في دائرة تروية الرئة خارج الجسم (EVLP).

ثم قم بتوصيل كانيولا الأذين الأيسر بخط التدفق الخارج وقم بتشغيل المضخة 연دوية (peristaltic pump). لتسجيل بيانات التهوية ومراقبة الضغط، قم بإزالة خط التهوية بسرعة من أعلى جهاز التهوية خارج الجسم (EVLP) وقم بتثبيت الغطاء الذي يحتوي على مستشعرات الضغط. بعد ذلك، أعد إدخال خط التهوية في الجزء العلوي من جهاز EVLP.

تأكد من ملء مصيدة الفقاعات بشكل كافٍ بسائل التروية. ولتجنب إدخال فقاعات هواء إلى الرئتين خلال الـ 15 دقيقة الأولى، قم بتغيير إعدادات التهوية والتروية ببطء حتى تصل إلى المستويات التجريبية المطلوبة. قم أيضاً بزيادة معدل تدفق التروية والضغط إلى المعدل والضغط المطلوبين خلال مرحلة التصعيد الأولية هذه.

يُوصى ببرمجة جهاز التنفس الاصطناعي لإنتاج أنفاس جانبية متقطعة لتسهيل حركة السوائل خارج الحيز الرئوي وتأخير ظهور الوذمة. يتم تحديد الزمن صفر بأنه الوقت الذي تكون فيه معلمات التهوية عند حجم مدي قدره 4 مل لكل كيلوغرام إيجابي. ضغط نهاية الزفير عند 2 سم.

تكون مستويات H2O ومعاملات التروية عند القيم المتوقعة وثابتة. إذا لزم الأمر، يتم سحب ثماني عينات تروية من منفذ العينات وتجميدها سريعاً في النيتروجين السائل، مع تدوين وقت سحب العينات. عند اكتمال التجربة، يتم عزل أي قطع تشريحية ضرورية للجمع، ثم يتم تجميدها سريعاً في النيتروجين السائل أو وضعها في محلول تثبيت لإجراء دراسات إضافية.

لم يتغير وزن الرئة في ذكور جرذان Sprague dolly بشكل ملحوظ طوال 60 دقيقة من تروية الرئة خارج الجسم بعد أول 10 دقائق. كما لم يحدث أي تغيير في ضغط الشريان الرئوي. وبالمثل، لم يتغير المقاومة الوعائية الرئوية طوال مدة الدراسة.

بعد ساعة واحدة من التهوية بأحجام مدية عالية وضغط نهاية زفير إيجابي (peep) مرتفع، زادت تركيزات السيتوكينات المسببة للالتهاب في مجموعة PERFUSE eight، بينما ظلت تركيزات السيتوكينات المضادة للالتهاب دون تغيير. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد للخطوات الأساسية اللازمة لإنشاء نموذج تروية الرئة خارج الجسم (ex Viva) للحيوانات الصغيرة في الجرذان في مختبرك.