Name: Calibrated Zange Modell Spinal Cord Injury Compression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Lernen Sie die kalibrierte Zangenmethode zur Rückenmarkskompression bei Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare Verletzungsmodelle für die Neurowissenschaftsforschung mit histochemischer Schadensanalyse.

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Die Finanzierung dieser Arbeit wurde von den Shriners Hospitals und CIRM-Stipendien für AMC und AM bereitgestellt. Wir möchten uns auch bei Plemel et al. bedanken.7 für den ersten Entwurf und die Veröffentlichung des kalibrierten Pinzettenmodells.

Alle tierischen Verfahren und Tierpflege Methoden sollten durch Institutional Animal Care und Usage Ausschuss der Institution (IACUC) genehmigt werden. 1. Chirurgische Vorbereitung <ol><li> Montieren Sie alle notwendigen chirurgischen Instrumente und Reagenzien: Zangen, vana Schere, roungeurs, Aufroller, Skalpelle, Scheren, Nähte, Hautklammern, Q-Tips, steriler Kochsalzlösung, chirurgischen Schwämmen und Isofluran. Vorbereitung und Autoklaven eine komplette Packung von chirurgischen Instrumenten vor der Operation. Bei Durchführung Operationen auf mehr als einer Maus, vorzubereiten und im Autoklaven ein Paket von Werkzeugen pro Tier oder Autoklaven ein Paket von chirurgischen Instrumenten und Sterilisieren mit einem Werkzeug Sterilisator zwischen Operationen. Im Allgemeinen kann eine Packung sterilisiert Werkzeuge auf bis zu 5 Mäuse verwendet werden, wenn ein Glasperlenwerkzeug terilizer dient zur Reinigung von Werkzeugen in-zwischen Operationen (nach 5 Tieren die Werkzeuge müssen erneut gereinigt werden und vor der Verwendung sterilisiert). Bitte fragen Sie Ihren lokalen IACUC Administrator Institutiauf spezifische Richtlinien. </li><li> Sterilisieren Sie das Operationsfeld mit 70% igem Isopropylalkohol Tücher. Einrichtung OP-Abdeckungen, um sicherzustellen, ein steriles Feld ist während der Operation erhalten. </li><li> Wiegen jeder Maus vor der Operation. Verabreichung einer Dosis von 0,05 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin, subkutan. </li><li> Betäuben des Tieres durch Verabreichung von Isofluran in einer Dosierung von 4% in der Ansaugkammer von Isofluran Maschine. </li><li> Sobald das Tier betäubt, gelten Salbe für die Augen, um eine Austrocknung zu verhindern, stellen Sie das Tier auf einem Heizkissen bei 37 ° C, und sicherzustellen, dass der Kopf des Maus richtig in der Anästhesie Kegel entfernt. (Hinweis: Verwenden Sie eine Wärmequelle, die keine Verbrennungen verursachen wird, das heißt, ein Kreislaufwasser Decke, Wärmflasche, oder gleichwertig..) An dieser Stelle zu verwalten eine Dosis von 2% Isofluran für das Tier. </li><li> Rasur die dorsale Oberfläche der Maus, etwa 1 cm auf der beabsichtigten Inzision Lage. </li><li> Desinfizieren Sie die Inzision site durch Waschen mit 70% igem Isopropylalkohol Tücher, dann mit einer Iod-Lösung (10% Povidon-Jod, 1% verfügbares Iod). 3-mal wiederholen. </li></ol> 2. Rücken Laminektomie <ol><li> Bevor ein Einschnitt, sicherzustellen, dass das Tier richtig durch Prüfen Reflexe mit der Zehe oder Schwanzklemm Verfahren anästhesiert. </li><li> Einen Einschnitt entlang der Brustwirbelsäule mit Skalpell und Messer, und dann für die Reflexe prüfen erneut. Arch den Rücken, um richtig zu visualisieren Sehenswürdigkeiten, wie die Grenzen zwischen den Wirbeln. </li><li> Durch die Haut geschnitten. Legen Aufroller die Haut und Faszie aus dem Rückenmark zurückzuhalten. Deaktivieren Sie das Gewebe auf beiden Seiten des Rückenmarks, die Muskeln für den Rücken aus. HINWEIS: Der Operateur sollte mit den anatomischen Merkmalen vertraut sein. Beispielsweise kann der untere Winkel des Schulterblattes entspricht T7. Der obere Teil der natürlichen Krümmung der Maus die Rücken ist T12 und kann als Bezugspunkt verwendet werden. </li><li> Mit proper Beleuchtung, bestimmen den Abstand zwischen den Wirbeln. Findet die hintere Ende T10 und schneiden Muskeln und Faszien senkrecht zum Bandscheibenraum. Schneiden Sie gerade genug, um den Dornfortsatz und posterioren Lamina von T10 aus. </li><li> Mit einem Paar feiner Spitze Dumont # 5 Zange, entfernen Sie einige der das Gewebe aus der Lamina und Dornfortsatz, um einen kleinen Splitter des Rückenmarks aus. Wenn nötig, verwenden Sie Gewebe Pinzette, um die Wirbelsäule zu stabilisieren. </li><li> Führen die Laminektomie durch Einfügen einer Seite eines Paares von kleinen vana Scheren entlang der dorsolateralen Seite des Wirbels und der unmittelbar unter der Lamina. <ol><li> Machen Sie kleine, vorsichtige Schere durch die Seitenfläche des Wirbel Lamelle geschnitten. Sicherzustellen, dass kein Druck auf das Rückenmark angewendet. </li><li> Wiederholen auf der anderen Seite. </li><li> Drücken Sie vorsichtig zu stoppen Blutungen bei Bedarf mit einem Q-Tip oder chirurgische Schwamm, kümmert sich um Druck auf das Rückenmark nicht. HINWEIS: Bereiten Gelschaumin steriler Kochsalzlösung in dem Fall, dass Blutungen kontrolliert werden muß eingeweicht. </li><li> Nachdem die Einschnitte vorgenommen wurden, heben Sie die Dorsalseite des Wirbels und alle Gewebe Anhänge sanft klar. Geeignete Mittel zur Kontrolle Blutungen, wenn nötig. </li></ol></li></ol> 3. Kompression des Rückenmarks <ol><li> Verwendung roungeurs oder Laminektomie Pinzetten, sicherzustellen, dass die lateralen Seiten des Rückenmarks sind frei von Wirbelknochen, so daß die kalibrierte Pinzette für die Kompressionsverletzung kann auf beiden Seiten der Wirbelsäule anzuordnen. Die Arme der Zange muss im Epiduralraum an benachbarten Seiten des Rückenmarks und die Spitzen der Pinzette angeordnet sind in der Lage, den Boden des Wirbelkanals zu erreichen sein. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Sicht des Rückenmarks ist gut. </li></ol></li><li> Situate die kalibrierte Dumont # 5 Zange etwa in der Mitte des freiliegenden Abschnitt des Rückenmarks. Erinnern, dass die Arme des Kraftps muß im Epiduralraum an benachbarten Seiten angeordnet werden und die Spitzen muss der Boden des Wirbelkanals berühren, um reproduzierbare Verletzungen erzeugen. </li><li> Vorsichtig zusammen, die das Rückenmark, bis die Abstandshalter zu verbinden. Halten Sie ihn für 15 Sekunden. </li><li> Vorsichtig lassen Sie die Druckkraft, und entfernen Sie die kalibrierten Pinzette aus dem Rückenmark. Sterile Saline verwendet, um die Homöostase wiederzuerlangen, bevor die Wunde verschlossen wird. </li></ol> 4. Wundschluss <ol><li> Sorgfältig Naht der Muskelschicht über dem Rückenmark, wobei darauf zu achten nicht zu stören oder Druck auf das Rückenmark. </li><li> Verwenden Sie entweder Nähten oder Klammern, um die Haut über der Wunde zu schließen. </li><li> Bei der Verwendung von Gasnarkose, beginnen zu verjüngen / Ausschalten der Betäubung. </li><li> Verwalten 0,1 ml Ringer-Laktat pro 10 g Körpergewicht zu berücksichtigen, für die Dehydratisierung während der Operation und nach der Operation, wenn das Tier lethargisch und Erholung von der Verletzung zu helfen. Die Lösung sollte warme seind, die Körpertemperatur vor der Injektion. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einer Bettwäsche freien Käfig. Der Käfig sollte auf einem Heizkissen (wie in 1.1.5 beschrieben) in einer Weise, die die Hälfte der Käfigfläche, auf der Unterlage sein können ruhen, während die andere Hälfte auf einer RT-Zähler ruhen, um das zu geben Maus Klima Optionen, sobald sie ambulante ist. Achten Sie darauf, dass die &quot;Erholungskäfig&quot; befindet sich in einer ruhigen Umgebung. Das Tier genau zu überwachen, bis es das Bewußtsein, zu welcher Zeit die Maus zu einem regulären Käfig mit Betten übertragen werden wiedergewonnen. </li></ol> 5. Postoperative Pflege <ol><li> Nach der Operation, Administration eine Dosis von 0,05 mg / kg Körpergewicht Buprenorphin subkutan alle 12 Stunden für die ersten 3 Tage nach der Operation, und dann je nach Bedarf, um die Symptome von Schmerzen zu verwalten. </li><li> Verabreichung einer Dosis von Ringer-Laktat (0,1 ml pro 10 g Körpergewicht subkutan) für die ersten 3 - 5 Tage nach der Operation. Geben Sie diese Dosis aus, wenn / wenn der eineimal beginnt, Anzeichen von Austrocknung außerhalb dieses Anfangszeitperiode aufweisen. </li><li> Manuell drücken die Blase der Tiere mit der Crede Manöver zweimal täglich. Tasten vorsichtig Bauch des Tieres, um die Blase zu suchen, und dann gilt sanften Druck nach unten, bis die Blase leer. <ol><li> Wenn die Blase nicht leer oder der Urin blutig oder bewölkt, verwalten 50 mg / kg Körpergewicht von Baytril dem Tier über interperitoneale Injektion für 10 Tage. </li></ol></li><li> Überwachen Tiere auf Anzeichen von autophagy, Dehydrierung und mäßiger Gewichtsverlust (mehr als 20% des Körpergewichts). Wenn ein Tier erlebt eines dieser Symptome bitte Rücksprache mit einem Tierarzt sofort in Bezug auf Behandlungsoptionen, oder das Tier einschläfern auf humane Weise folgende IACUC Richtlinien. <ol><li> Da die Mobilität kann direkt nach der Operation beschränkt werden, die notwendigen Schritte unternehmen, um sicherzustellen, Tiere haben Zugang zu Nahrung und Wasser. Abgepackte Nassfutter sowie eins Hydrogel kann den Tieren zur Verfügung in diesen Beispielen hergestellt werden. </li></ol></li></ol> 6. Beurteilen Sie Tissue Schäden durch Compression Injury <ol><li> Anesthetize Tier wie bei den Schritten 1.4 und 1.5 beschrieben. Überprüfen Narkosetiefe von toe Prise und Überwachungshornhaut blink Reflexe. Wenn das Tier ist unempfindlich gegenüber Reizen, fahren Sie mit Schritt 6.2. </li><li> Führen Sie eine intrakardiale Perfusion 10. <ol><li> Setzen Sie den Brustkorb und legen Sie eine Nadel in die linke Herzkammer. Spülen Sie vorhandene Flüssigkeiten mit 20 - 30 ml eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), gefolgt von 15 - 25 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA). </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Rückenmark. <ol><li> Schneiden Sie die Haut Rücken zum Rückenmark und beseitigen jede die Länge der Wirbelsäule umgebenden überschüssiges Gewebe. </li><li> Verbrauch Wirbelsäule und alle verbleibenden Gewebe weggeschnitten. Die tatsächliche Höhe der Laminektomie und injury durch Zählen Rippen bestätigt werden. </li><li> Verwenden vanna Schere und Pinzette, um kleine Abschnitte der Wirbelsäule in einem caudal zu rostral Richtung zu verschieben. Weiter zu schneiden, bis das Kabel genug ist, um ein sicheres Entfernen ermöglichen ausgesetzt. Visualisierung der Schneidstelle und Verfahren kann durch den Gebrauch eines Stereoskops erleichtert werden. </li></ol></li><li> Zeigen Rückenmarksgewebe in 4% PFA. Lassen Gewebe post-fix in dieser Lösung für 24 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Cryoprotect Gewebe durch Inkubation in 30% Sucrose für 24 h bei 4 ° C. </li><li> Embed Gewebe in Oktober Kurz gesagt, nehmen Gewebe aus dem 30% Saccharose Inkubation und entfernen Sie überschüssige Lösung. Legen Sie das Gewebe in eine cryomold mit Oktober gefüllt und Inkubation für 1 Stunde bei 4 ° C. <ol><li> Entfernen Form von 4 ° C, bestätigen Richtungsorientierung des Gewebes, legen Sie die Form in eine flache Schale von 2-Methyl (vorgekühlte 1 Stunde auf Trockeneis) und erlauben Oktober vollständig erstarren. Halten Sie auf Trockeneis bei Verwendung sofort oder stoerneut bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Schneiden Sie das Gewebe in 20 &amp; mgr; m Sagittalschnitten mit Hilfe eines Kryostaten. Berg Gewebe direkt auf Folien. Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Führen Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Fleck. <ol><li> Kurz gesagt, rehydrieren das Gewebe (5 min, 2-mal), Fleck mit Hämatoxylin (2,5 min) und mit Wasser (1 min, 2 mal). </li><li> Inkubieren Gewebe in 50% und dann 70% Ethanol (3 min) gemessen, mit Eosin-Färbung (45 sec), und Dehydratisierung durch Inkubation in 90% (5 sec), 95% (5 sec), 100% iges Ethanol (2 min) und Isopropanol (2 min). </li><li> Klar mit Xylol (5 min, 3-mal). HINWEIS: H &amp; E Färbung mit spezifischen Gewebedicke und Bedingungen variieren. Deshalb wird vor der Standardisierung mit experimentellen Gewebeproben fortfahren erforderlich. </li></ol></li><li> Bedecken Sie Gewebe mit einem dünnen Streifen Permount (~ 100 &amp; mgr; m) und Deckglas. Drücken Sie auf allen Seiten des Deckglases, um die ordnungsgemäße Verteilung der Flüssigkeit zu gewährleisten. Lassen Sie Folien trocknen O / N. </li><li> Visualize Gewebeschnitten unter Verwendung eines Digital-Mikroskop und die Aufnahmen mit Hilfe der mitgelieferten Software. </li></ol>

<ol><li>McDonough, A., Martinez-Cerdeno, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+proliferation+after+SCI+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Endogenous proliferation after SCI in animal models.</a> Stem Cells Int. 2012, 387513(2012).</li>
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<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Wahl einer SCI-Modell ist in der Gestaltung Experimente zur Bestimmung der Wirksamkeit von Therapien für menschliche Fälle von SCI bestimmen wichtig. Solche Experimente erfordern ein Tiermodell, die hohe Reproduzierbarkeit der Variabilität, die in nicht schlüssigen Daten ergeben kann ist. Sie sollten auch von klinischer Relevanz sein, den menschlichen Zustand sie modelliert genau zu bewerten. Zu diesem Zweck ist die Wahl eines Druck- oder kontusiven Verletzungen über einen Durchtrennung ist klinisch relevantere 3. Impaktoren und Gewichtsabfall Vorrichtungen zur Quetschung Verletzungen erfordern jedoch die Verwendung von teuren und komplizierten Maschinen. Im Gegensatz dazu ist die kalibrierte Pinzette Modell SCI nutzt modifizierten Zange, die leicht von üblichen Labormaterialien montieren sind, und die Operation erfordert nur einen zusätzlichen Schritt nach einer Standard dorsalen Laminektomie des Rückenmarks freizulegen. Allerdings ist ein Nachteil bei der Verwendung dieser Methode, dass die Druckkraft immer seitlich anstatt dorsal, angewendet alswird häufig in klinischen Fällen von SCI 9 und Druckverletzungen, die unter Verwendung der Verfahren betreffen eine größere rostral-caudale Ausmaß der Gewebe als Quetschung Modelle 1,2 gesehen. Dieses Modell wurde von den Urhebern der Technik gezeigt, und uns, um reproduzierbare SCI 7,11 zu erzeugen und ist gut geeignet, um die Größe von Mäusen. Darüber hinaus ermöglicht diese Verletzungsmodell für die Tiere nach der Operation und therapeutischen Behandlungen mit einer Vielzahl von Verhaltenstests, wie dem Basso Maus Skala für Fortbewegung und der von-Frey-Haar-Test, um sicherzustellen, dass eine Gruppe von Tieren teilen sich die gleiche Verletzungsschwere bewertet werden und neurologische Defizite 7,11-13. Die gleichen Techniken können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von Behandlungen von Tieren während den Untersuchungen verabreicht auszuwerten, die die allgemeinen Kriterien für Tiermodelle verwendet werden, um Therapien für SCI 2,7 bewerten. Das Verfahren zur Herstellung des geeichten forceps für die Schadensmodell ist einfach und kann mit einer Vielzahl von verschiedenen Verfahren erreicht werden. Wir haben die Abstands Verfahren 11 verwendet, wie durch Plemel 7 veröffentlicht und sind auch modifizierte Zange mit einer kleinen Schraube, die nicht nur eine einfachere Methode zum Erstellen der Druckvorrichtung, sondern ermöglicht auch die Vielseitigkeit beim Einstellen der abschließenden Verdichtungsbreite, der Nutzen für Vergleichsstudien. Die Optionen, die in die Erstellung der Zange ist nahezu unbegrenzt, solange der Abstandshalter (s) ein stabiles mittels stets Schließen der Zange, um die gleiche Distanz und Autoklavieren und Sterilisieren zu widerstehen. Die in diesem Video beschrieben chirurgischen Methoden sind sehr gut reproduzierbar über Nutzer, ist es jedoch erforderlich, dass Sie beim Durchführen der Laminektomie und Vernähen des Tieres, nachdem das Verfahren durchgeführt wurde, so dass das Rückenmark keine zusätzlichen Druckkräfte, die erhöhen kann leiden genommen werden die Schwere der Verletzungen und verwechseln zukünftige Experimente. </p&gt; Mit der richtigen Ausbildung und Praxis ist die kalibrierte Zange Modell Kompressionsverletzung zum Durchführen von SCI bei Mäusen, die klinische Fälle beim Menschen beobachteten 2,3,7 imitieren gut geeignet. Aufgrund der Einfachheit, mit der Pinzette Herstellung Mäusen unterschiedliche Grade der Verletzungsschwere ist leicht durchführbar. Dies wird von großem Nutzen für die Beobachtung genetische Effekte auf SCI von verschieden streng in transgenen Mäusen sowie die Beurteilung der Wirksamkeit von Stammzelltransplantationen bei Mäusen ist. Die meisten Studien in der Literatur wurden an Ratten aufgrund ihrer Größe, die in der Regel macht Operationen leichter auszuführen geführt. Jedoch ist die durch Plemel et al. Veröffentlicht 7 und in diesem Video von uns beschriebenen Verfahren sollte SCI ermöglichen, an Mäusen mit großer Leichtigkeit und Reproduzierbarkeit durchgeführt werden.

Tiermodelle der SCI sind wertvolle Werkzeuge für die Beurteilung der Wirksamkeit von therapeutischen Paradigmen zur Beschädigung als Folge von Trauma des Rückenmarks zu mildern. Aus experimentellen Notwendigkeit, müssen diese Modelle reproduzierbare Defizite in Bewegungs- und Sinnes Verhaltensweisen bieten, einstellbar sein, um Verletzungen unterschiedlicher Schweregrad zu produzieren, und zeigen, dass die Verletzungsschwere korreliert mit dem Grad der neurologischen Ausfällen beobachtet. Es gibt drei Haupttypen von SCI mit unterschiedlichen Merkmalen der Verletzung: Durchtrennung, Quetschungen und Druck 1. Kurz gesagt, ist ein Durchtrennung Verletzung einer Platzwunde an das Rückenmark, entsteht eine Quetschung Verletzung aus einer an der dorsalen Rückenmarks angelegten kurzen, Brennkraft und eine Kompressionsverletzung auftritt, wenn eine schädliche Kraft auf das Rückenmark angewendet und kann auch als Quetschverletzung 2 bezeichnet. Vollständige Durchtrennung Verletzungen sind beim Menschen 3 klinisch selten, während eine Prellungd Kompression Verletzungen sind häufiger. Die Kompressionsverletzung erzeugt ein Ergebnis ähnlich zu dem, was in der menschlichen SCI gefunden verursacht beispielsweise Tumorkompression oder anderen schädigenden Druckkräfte und kann unter Verwendung einer einfachen Anordnung von Werkzeugen durchgeführt werden. Quetschungen und Druckverletzungen sind insofern ähnlich, als beide eine Druckkraft und beide ähnliche pathologische Merkmale wie zytoarchitektonischen Desorganisation und evozieren ähnliche endogenen Reaktionen auf Verletzungen 1,4. Die Quetschung Verletzungsmodell Regel gilt dieser Kraft auf den dorsalen Rückenmark mit Hilfe einer speziellen Vorrichtung in einer Weise ähnlich der menschlichen Fälle von SCI aus einer Einklemmung der Wirbelsäule 2,5,6 resultieren. Im Gegensatz dazu kann die Komprimierung Verletzungen durch eine Vielzahl von Verfahren Aufbringen einer Kraft von dorsal oder lateral erzeugt werden. Methoden einer Druck Verletzungen gehören kalibriert Zange 7, Aneurysmen-Clips 2, oder indem ein Gewicht direkt auf das Rückenmark 8. Ein Vorteil derAneurysmen-Clips ist, dass sie in der Lage, unterschiedliche Mengen an Kraft 9 erbringen. Das Verfahren der Zugabe von Gewichten an der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks unmittelbar 8 verlangt das Gewicht an Ort und Stelle für 10 min betragen, wobei die Länge der Operation erheblich verbessern sowie die resultierende Inkonsistenzen wegen Anordnung des Gewicht und die Bewegung aufgrund der Atmung des Tier. Aufgrund der geringen Größe von Mäusen, Situierung Tiere in spezialisierten Vorrichtungen zur Verwendung bei der Ratte, wie Impaktoren zum Quetschung Verletzungen ausgelegt ist, kann schwierig sein oder sich in inkonsistenten Verletzungen 7. Jedoch sind Mäuse in einer breiten Palette von transgenen Linien, im Gegensatz zu größeren Tieren wie Ratten oder Kaninchen, die sehr nützlich für SCI Forschung sind. Die Plemel Verfahren der Verwendung kalibriert Pinzette komprimiert das Rückenmark erzeugt eine reproduzierbare SCI mit einem hohen Grad der Korrelation zwischen Verletzungsschwere und neurologisches Defizit 7. Dieses chirurgische SCI Modellerzeugt, indem ein Paar von No. 5 Dumont Zange modifiziert, um in einem definierten Abstand von beiden Metall Epoxid oder einem anderen Hindernis, um eine vollständige Schließung verhindern auseinander gehalten werden. Diese entwickelt Abstand stellt sicher, dass die Zange wird immer in der Nähe einer bestimmten Breite in mehrere Operationen und von verschiedenen Benutzern. Der Vorteil der Plemel Verfahren ist, dass die Materialien, um die kalibrierte Pinzette erzeugen kann leicht erhältlich und im Labor ohne Notwendigkeit von Spezialgeräten zusammengebaut werden. Diese Zange kann mehrere Runden von Autoklaven und Sterilisation standhalten, und der Mangel an einer separaten, sperrige Gerät optimiert Operationen. In diesem Video zeigen wir die chirurgische Verwendung eines Paares von kalibrierten Zange auf dem Rückenmark der Maus, um eine Kompressionsverletzung zu erzeugen. Wir wenden uns auch einzigartige Bedenken auf die Betreuung von querschnittgelähmten Versuchstieren im Zusammenhang mit der Lebensqualität nach der Operation zu verbessern und die Mortalität.

<table><tbody><tr><td>Isofluran-Maschine</td><td>Smiths Medical PM, Inc</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Phoenix Pharmaceutical</td><td>NDC: 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Präparierskop</td><td>Seiler Präzisionsmikroskope</td><td>SSI 202/402</td><td></td></tr><tr><td>Germinator-500 (Werkzeugsterilisator)</td><td>Thomas Scientific</td><td>3885A20</td><td></td></tr><tr><td>Puralube (Augensalbe)</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff (#3)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge (#11)</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 08-914B</td><td></td></tr><tr><td>Retraktor (Colibri)</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Roungeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Vanna (Castroviejo) Schere</td><td>Roboz</td><td>RS-5658</td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11029-14</td><td></td></tr><tr><td>Laminektomie-Pinzette (Dumont #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Hefter</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>Klammern (Wundclips)</td><td>Reflex7</td><td>203-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nähte</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Nadeln (30 G x &frac12;)</td><td>BD Biomedical</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (1 ml)</td><td>BD Biomedical</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (Enrofloxacin)</td><td>Bayer</td><td>NADA 140-913</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex (Buprenorphin)</td><td>Cardinal Health</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr></tbody></table>

calibrated zange modell spinal cord injury compression

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Kompressionsverletzungen des murinen Rückenmark sind wertvolle Tiermodelle für die Untersuchung von Verletzungen des Rückenmarks (SCI) und Rückenregenerationstherapie. Der kalibrierte Zange Modell Kompressionsverletzung ist eine bequeme, kostengünstige und sehr reproduzierbare Tiermodell für SCI. Wir verwendeten ein Paar von modifizierten Zange in Übereinstimmung mit der durch Plemel et al veröffentlichten Methode. (2008), um seitlich zu komprimieren das Rückenmark zu einem Abstand von 0,35 mm. In diesem Film werden wir eine dorsale Laminektomie zeigen, den das Rückenmark, gefolgt von Kompression des Rückenmarks mit den modifizierten Zange freizulegen. In dem Video werden wir auch Fragen im Zusammenhang mit der Betreuung von querschnittsgelähmten Versuchstieren zu bewältigen. Diese Verletzung Modell produziert Mäusen, die Wertminderung in der Empfindung, aber auch beeinträchtigt Hinterlauf Bewegungsfunktion aufweisen. Ferner kann dieses Verfahren Verletzungs konsistente Aberrationen in der Pathologie der SCI, wie durch immunhistochemische Methoden bestimmt. Nachdem ich dieses video, sollten die Zuschauer in der Lage, die nötigen Materialien und Verfahren zur Herstellung SCI verschiedener Schwere in der Maus für Studien über SCI und / oder Behandlungen zur Beeinträchtigung nach einer Verletzung zu verringern bestimmen.

Wir führten eine Laminektomie von 12 Mäusen (25-30 g), wie oben beschrieben, gefolgt von Rückenmarkkompression bei 0,25 mm (n = 4), 0,35 mm (n = 4) und 0,55 mm (n = 4). Wir geopferten Tiere an drei (n = 6) und sieben (n = 6) Tage nach der Verletzung durch intrakardiale Perfusion. Das Rückenmark wurde aus der Wirbelsäule entfernt, und das Gewebe wurde hergestellt und wie oben beschrieben verarbeitet. Bilder gesamte Rückenmark wurden mit einem Leica EZ4 Digitalmikroskop und dazugehörige Software übernommen. Bilder von Rückenmarksschnitte wurden auf 2-fache Vergrößerung mit einer Olympus Digitalmikroskop und der dazugehörigen Software übernommen. Wir fanden, dass eine Rückenmarkkompression erzeugt eine Verletzung mit dem Epizentrum der Stelle der Kompression (Abbildung 1). Die Auswirkungen der Verletzung erstrecken mehrere Millimeter in den rostralen und kaudalen Richtungen. Die Schwere der Verletzung erhöht, wenn der Abstand zwischen den Abstandshaltern verringert (0,25 mm&gt; 0,35 mm&gt;0,55 mm, 2). Drei Tage nach der Kompression war Blut im Epizentrum der Verletzung und die umliegenden Regionen, die nicht nach der Verletzung zu präsentieren wurde 7 Tagen. Die 0,25 mm und 0,35 mm Kompressionen erzeugt einen Hohlraum, aber das Modell nicht 0,55 mm. Nach 7 Tagen der dorsalen und ventralen weißen Substanz weitgehend verkleinert im Epizentrum, die graue Substanz Organisation wurde stark verzerrt, und Kavitation war hartnäckig. Diese cytoarchitectonical Änderungen werden in motorische und sensorische Veränderungen im Verhalten der Tiere ausgewertet übersetzt mit geeigneten Tests wie der Basso Maus Skala für Bewegungsapparat Funktion und die von Frey Haare und Ethylchlorid Tests für sensorische Funktion, wie wir in früheren Publikationen 8 gezeigt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Representative Bilder des intakten Rückenmark vor und after Verletzungen. (A) Intact Rückenmark. (B) Rückenmark nach 0,35 mm Kompression. Die Pfeile zeigen die Grenze von Verletzungen. Asterisk indentifies Epizentrum der Verletzung. D = Rücken, L = Seiten. Maßstab:. 0,50 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" width="650" /> Abbildung 2. Repräsentative Bilder der Maus Rückenmark vor und nach Kompressionsverletzung bei unterschiedlichen Druckbreiten. (A) Sagittalschnitt Steuerrückenmark. (B) Frontalschnitt im Epizentrum einer 0,35 mm SCI 7 Tage nach Kompressionsverletzung (dpi). (C, E, G) Sagittalschnitte von Rückenmark 3 dpi auf eine Breite von 0,25 , 0,35 oder 0,55 mm. (D, F, H) Sagittalschnitte von H &amp; E gefärbten Rückenmarks 7 dpi zu einer Breite von 0,25, 0,35 oder 0,55 mm. Asterisk indentifies Epizentrum der Verletzung. Alle Abschnitte mit H &amp; E gefärbt. D = Rücken, L = Seiten. Maßstab:. 1,25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52318/52318fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

Modelle für Rückenmarksverletzungen sollten hochgradig reproduzierbar sein. Wir zeigen, dass das kalibrierte Zangenkompressionsmodell der Rückenmarksverletzung eine einfach anzuwendende chirurgische Methode zur Erzeugung reproduzierbarer Verletzungen des murinen Rückenmarks ist.

Calibrated Zange Modell Spinal Cord Injury Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die notwendigen Schritte zur Erzeugung einer reproduzierbaren Quetschung des Rückenmarks bei Mäusen mithilfe kalibrierter Pinzetten zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem vorsichtig die Haut- und Muskelschichten über der Wirbelsäule entfernt und die korrekte Zielwirbel identifiziert werden. Anschließend wird an den betreffenden Wirbeln eine Laminektomie durchgeführt, um das Rückenmark freizulegen, und dann werden kalibrierte Pinzetten verwendet, um die Rückenmarkverletzung zu erzeugen.Die Ergebnisse veranschaulichen das Ausmaß der Schädigung im Rückenmarksgewebe nach einer Kompression des Rückenmarks mithilfe histochemischer Techniken. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben. Sie führen ein äußerst empfindliches Verfahren an einem kleinen Tier mit geringem Fehlerspielraum durch.Dies ist ein empfindliches Gewebe, und Sie könnten versehentlich eine schwerwiegendere Verletzung verursachen, als beabsichtigt. Daher empfiehlt es sich, zunächst zu üben. Zur Vorbereitung der Operation sammeln Sie Folgendes: chirurgische Instrumente und Reagenzien, Pinzette, Van-Scheren, URS-Messer, Retraktor-Nähte, Hautklammern, Wattestäbchen, sterile Kochsalzlösung, chirurgische Tupfer und Isofluran, das in Verbindung mit einer Narkosemaschine verwendet wird. Autoklavieren Sie die Instrumente für einen einzelnen Eingriff und verwenden Sie einen Instrumentensterilisator, um die Instrumente zwischen den Operationen zu sterilisieren. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit 70 % Isopropylalkohol und legen Sie chirurgische Tücher an, um sicherzustellen, dass während der Operation ein steriles Feld aufrechterhalten wird.Nachdem jedes Mäuschen vor der Operation gewogen wurde, verabreichen Sie einmalig eine Dosis von 0,05 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht Buprenorphin subkutan, sobald das Tier anästhesiert ist. Gemäß dem Textprotokoll wird Augensalbe aufgetragen, um eine Austrocknung der Augen zu verhindern, und die dorsale Fläche der Maus wird im Bereich von etwa einem Zentimeter um die beabsichtigte Inzisionsstelle herum rasiert. Zur Desinfektion der Inzisionsstelle wird eine Jodlösung verwendet, gefolgt von 70 % Isopropylalkohol. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, bevor Sie mit der Operation beginnen.Führen Sie zunächst einen Zehen- oder Schwanzquetschtest durch, um die Reflexe zu überprüfen. Falls keine vorhanden sind, verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt entlang der dorsalen Wirbelsäule zu machen und die Haut zu durchtrennen.Setzen Sie den Retraktor ein, um die Haut vom Rückenmark zurückzuhalten. Überprüfen Sie erneut auf Reflexe. Entfernen Sie dann das Gewebe auf beiden Seiten des Rückenmarks, um die Muskulatur freizulegen, die den Wirbelbogen bedeckt; runden Sie den Rücken, um Orientierungspunkte wie die Grenzen zwischen den Wirbeln besser visualisieren zu können.Folgende Orientierungspunkte sollten sichtbar sein: Der untere Winkel des Schulterblatts, der der Wirbelsegment T sieben entspricht, sowie die Spitze der natürlichen Krümmung des Rückenmarks der Maus bei TT 12 bei geeigneter Beleuchtung. Bestimmen Sie den Zwischenraum zwischen den Wirbeln.Danach das hintere Ende von T 10 lokalisieren und mit einer feinen Pinzette (Dumont Nr. 5) gerade genügend Muskeln und Faszie senkrecht zum Zwischenwirbelraum durchtrennen, um den Dornfortsatz und das hintere Laminar von T 10 freizulegen. Einige Anteile des Gewebes am Laminar und Dornfortsatz entfernen, um einen schmalen Streifen des Rückenmarks freizulegen. Falls erforderlich, mit Gewebepinzetten die Wirbelsäule stabilisieren.Führen Sie anschließend die Laminektomie durch, indem Sie eine Seite eines kleinen VNA-Scherblatts entlang der dorsolateralen Seite des Wirbels direkt unterhalb des Bogenplättchens einführen. Machen Sie dann kleine, vorsichtige Schnitte, um die linke Seite des Wirbelbogens zu durchtrennen. Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Seite.Stellen Sie sicher, dass kein Druck auf das Rückenmark mit einem Wattestäbchen oder einem chirurgischen Tupfer ausgeübt wird. Falls erforderlich, vorsichtig Druck ausüben, um die Blutung zu stoppen. Achten Sie darauf, dass kein Druck auf das Rückenmark ausgeübt wird.Nachdem die Einschnitte erfolgt sind, heben Sie den dorsalen Bereich der Wirbel auf und entfernen vorsichtig alle Gewebestrukturen. Falls erforderlich, verwenden Sie geeignete Maßnahmen zur Blutstillung. Stellen Sie mithilfe geeigneter Zangen oder Laminektomie-Zangen sicher, dass die lateralen Seiten des Rückenmarks frei von Wirbelknochen sind, damit die kalibrierten Zangen für die Kompressionsverletzung korrekt beidseits des Rückenmarks angebracht werden können.Platzieren Sie nun die kalibrierten Dumont-Nummer-fünf-Präparierscheren ungefähr in der Mitte des freigelegten Rückenmarksegments, wobei sich die Schenkel der Pinzette im epiduralen Raum befinden und die Spitzen den Boden des Wirbelkanals berühren. Drücken Sie vorsichtig auf das Rückenmark, bis sich die Abstandshalter verbinden, und halten Sie diese Position 15 Sekunden lang aufrecht.Danach vorsichtig die Druckkraft lösen und die kalibrierten Pinzetten aus dem Rückenmark entfernen. Steriles Salin auftragen, um die Homöostase wiederherzustellen, und die Muskelschicht über dem Rückenmark vorsichtig vernähen, wobei darauf geachtet wird, das Rückenmark nicht zu stören oder Druck darauf auszuüben.Schließen Sie die Haut über der Wunde mit entweder Nähten oder Hautklammern. Verabreichen Sie einen Milliliter lactatisierte Ringer-Lösung pro 10 Gramm Körpergewicht, um der Dehydrierung entgegenzuwirken. Stellen Sie die Maus vorher in einen käfig mit streubettfreiem Untergrund auf eine Heizplatte, die auf etwa 37 Grad Celsius eingestellt ist.Überwachen Sie das Tier in einer ruhigen Umgebung, bis es das Bewusstsein wiedererlangt hat. Danach bringen Sie es in einen normalen Käfig mit Einstreu für die ersten drei Tage nach der Operation, verabreichen subkutan alle 12 Stunden eine Dosis von 0,05 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht Buprenorphin und danach nach Bedarf zweimal täglich zur Schmerzbehandlung. Wenden Sie den vorgeschriebenen Handgriff an, um die Blase des Tieres manuell zu entleeren, indem Sie vorsichtig den Bauch des Tieres abtasten, um die Blase zu lokalisieren, und sanften, nach unten gerichteten Druck ausüben, bis die Blase vollständig entleert ist.Aufgrund der eingeschränkten Mobilität des Tieres unmittelbar nach der Operation sind die notwendigen Maßnahmen zu ergreifen, um dem Tier Zugang zu Futter und Wasser zu ermöglichen, indem Nassfutter und Hydrogel bereitgestellt werden. Zur Beurteilung von Gewebeschäden nach Laminektomie und Kompressionen des Rückenmarks am Punkt 25 Millimeter siehe den Textprotokoll. Am Punkt 35 Millimeter oder Punkt 55 Millimeter wurden jeweils an 12 Mäusen Eingriffe durchgeführt, und diese wurden drei oder sieben Tage nach der Verletzung durch intrakardiale Perfusion wie hier gezeigt getötet.Die Kompression des Rückenmarks verursacht Verletzungen mit dem Epizentrum an der Stelle der Kompression, wobei sich die Auswirkungen der Verletzung über mehrere Millimeter in rostraler und kaudaler Richtung erstrecken. Diese Abbildung zeigt, dass die Schwere der Verletzungen zunahm, je geringer der Abstand zwischen den Abstandshaltern war. Beispielsweise führten die Kompressionen mit 25 Millimeter und 35 Millimeter zu einem Hohlraum, der im Modell mit 55 Millimeter drei Tage nach der Kompression nicht zu beobachten war. Drei Tage nach der Verletzung befand sich Blut im Epizentrum der Verletzung und in den umgebenden Regionen, das sieben Tage nach der Verletzung nicht mehr vorhanden war. Nach sieben Tagen nahm das dorsale und ventrale weiße Mark im Epizentrum deutlich an Größe ab.Die Organisation der grauen Substanz war stark verzerrt und die Kavitation persistierte, wie zuvor gezeigt wurde; die zytoarchitektonischen Veränderungen gingen mit motorischen und sensiblen Beeinträchtigungen im Verhalten der Tiere einher, die mittels der Besso-Maus-Skala zur Beurteilung der motorischen Funktion sowie der Von-Frey-Haar- und Ethylchlorid-Tests zur Bewertung der sensorischen Funktion evaluiert wurden. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Methoden durchgeführt werden, wie beispielsweise die direkte Transplantation von Zellen oder die Injektion weiterer therapeutischer Reagenzien in das Rückenmark, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, etwa ob eine bestimmte Therapie den Outcome nach einer Rückenmarksverletzung verbessern kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Eine zuverlässige und wiederholbare Möglichkeit, eine zervikale einseitige Verletzung des Rückenmarks mit der Infinite Horizon Impaktor produzieren wird beschrieben. Die Methode nutzt die Vorteile eines maßgeschneiderten Rahmen und spannen, um die Wirbelsäule zu stabilisieren. Das standardisierte Verfahren und biomechanischen Parameter führen zu Verletzungen ausreichende und nachhaltige Verletzungen.

Ein Modell von gequetscht Einseitige Cervical Spinal Cord Injury Mit dem Infinite Horizon Impactor

Quelle: Elzat, E. Y. Y., et al., Etablierung eines Modells für Rückenmarksverletzungen bei Mäusen auf der Grundlage einer minimal-invasiven Technik. J. Vis. Exp. (2022). Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion einer Prellungsverletzung im Rückenmark T9 in einem Mausmodell unter Verwendung einer koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen. Auf das Rückenmark auf T9-Niveau wird ein Gewicht fallen gelassen, das eine Prellung verursacht, die sofort eine Verfärbung und Schwellung des...

Induktion einer Rückenmarksprellung in einem Mausmodell unter Verwendung einer koaxialen Plattform für Rückenmarksverletzungen

Quelle: Zheng, W. et. al., Diffusion Tensor Magnetic Resonance Imaging in Chronic Spinal Cord Compression. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Diffusions-Tensor-Bildgebung bei der Beurteilung der chronischen Rückenmarkskompression. Durch die Analyse von Wasserdiffusionsmustern, fraktionaler Anisotropie und scheinbaren Diffusionskoeffizienten zeigen die Ergebnisse axonale Schäden in komprimierten Regionen. Die Ergebnisse bieten wichtige Einblicke in die Pathologie des Rückenmarks und die...

Beurteilung der Rückenmarkskompression mit Hilfe der Diffusions-Tensor-Bildgebung

Ein Modell der Quetschung schweren Verletzungen des Rückenmarks beschrieben. Detaillierte präoperative, operative und postoperative Schritte beschrieben, um ein konsistentes Modell zu erhalten.

Eine Prellung Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Wirbelkörperstabilisierung ist zur Minimierung Variabilität und für die Erstellung von konsistenten experimentellen Rückenmarksverletzungen notwendig. Mit einem maßgeschneiderten Stabilisierungsvorrichtung in Verbindung mit der NYU / Mascis Impaktor Gerät, haben wir hier die richtige Ausrüstung und Verfahren zur Erzeugung von reproduzierbaren halb kontusive zervikalen (C5) Rückenmarksverletzungen bei erwachsenen Ratten nachgewiesen.

A Novel Wirbelstabilisierungsverfahren zur Herstellung Gequetscht Rückenmarksverletzungen

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer reproduzierbaren Rückenmarkskompressionsverletzung (SCI) bei der neugeborenen Maus. Das Modell bietet eine vorteilhafte Plattform für die Untersuchung von Mechanismen adaptiver Plastizität, die der spontanen funktionellen Erholung zugrunde liegen.

Ein Neonatal Maus Spinal Cord Injury Kompression Modell

Wir führen ein Gewebeverdrängungs-basiertes Continal-Rückenmarksverletzungsmodell ein, das bei erwachsenen Mäusen eine konsistente Verletzung des Rückenmarks verursachen kann.

Ein Tissue Displacement-basierte Contusive Spinal Cord Verletzung Modell in Mäusen

Minimalinvasive Techniken und ein einfaches Laborgerät verbessern die Reproduzierbarkeit des Rückenmarksverletzungsmodells, indem sie operative Schäden an den Versuchstieren reduzieren und die Aufrechterhaltung der anatomischen Morphologie ermöglichen. Die Methode lohnt sich, weil die zuverlässigen Ergebnisse und das reproduzierbare Vorgehen die Untersuchung der Mechanismen der Krankheitsheilung erleichtern.

Etablierung eines Maus-Kontusionsmodells für Rückenmarksverletzungen basierend auf einer minimal-invasiven Technik

Das vorliegende Protokoll, das das zentrale Rückenschnursyndrom (CCS) bei Mäusen simuliert, hat die Wiederholbarkeit verbessert und die Operationsschäden der Versuchstiere minimiert, wodurch eine übermäßige Störung der anatomischen Struktur vermieden wurde. Die Strategie in dieser Studie ist vorteilhaft, da sie die Erforschung von Verletzungsmechanismen ermöglicht, indem sie konsistente Ergebnisse liefert.

Etablierung des Modells des Zentralschnursyndroms in der C57BL/6J-Maus

Hier wird ein neuartiges automatisiertes Gerät zur Quetschung von Rückenmarksverletzungen für Mäuse vorgestellt, das Modelle für Rückenmarksverletzungen mit unterschiedlichem Grad genau herstellen kann.

Automatisierter Impaktor für das Modell einer kontusiven Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Lernen Sie die kalibrierte Zangenmethode zur Rückenmarkskompression bei Mäusen. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare Verletzungsmodelle für die Neurowissenschaftsforschung mit histochemischer Schadensanalyse.

Calibrated Zange Modell Spinal Cord Injury Compression

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