Echtzeit-Elektrophysiologie: Mit Closed-loop Protokolle Probe neuronaler Dynamik und darüber hinaus

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, in vitro dynamische Clamps in kortikalen Neuronen mit der frei verfügbaren Software-Toolbox LCG durchzuführen. Dies wird erreicht, indem Scheiben des somatosensorischen Kortex der Ratte für Patch-Clamp-Aufzeichnungen aus den Parametallzellen vorbereitet werden. In einem zweiten Schritt wird eine Reihe automatisierter elektrophysiologischer Protokolle auf die aufgezeichnete Zelle angewendet, die eine Standardcharakterisierung der Zelle ermöglichen, die für nachfolgende Analysen und Vergleiche zwischen Zelltypen nützlich sein wird.

Als nächstes wird die Injektion von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Ereignissen simuliert. Um den hohen Leitfähigkeitszustand, den die neokortikalen Neuronen in vivo erleben, nachzubilden, zeigen die Ergebnisse, wie die synaptische Hintergrundinjektion den Gewinn der kortikalen Zellen moduliert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden ist die Möglichkeit, experimentelle Aufzeichnungen in kompliziertere Arbeitsabläufe einzubetten, indem beispielsweise das Ergebnis eines experimentellen Protokolls als Eingabe für ein anderes Protokoll verwendet wird.

Diese Methode kann dazu beitragen, elektrophysiologische Protokolle zu standardisieren, die Datenanalyse zu beschleunigen und den Weg für den Datenaustausch zwischen Laboren zu ebnen. Obwohl diese Methode ursprünglich für den Großhandel mit Patch-CLA-Aufzeichnungen in vitro entwickelt wurde, kann sie auch bequem für andere experimentelle Vorbereitungen und Protokolle verwendet werden, wie z. B. In-vivo-Pflaster, CLA-Aufzeichnungen oder Beschleuniger-Aufzeichnungen mit Mikro-Arrays des Rennens. Nach der Extraktion des Rattenhirns das Kleinhirn entsorgen und die beiden Hemisphären entlang der Mittellinie mit einem Skalpell trennen, überschüssige Flüssigkeit von einer der Hemisphären entfernen und mit einem Tropfen Sekundenkleber auf eine schräge Plattform kleben.

Geben Sie dann schnell ein paar Tropfen eines Liquors über das Gehirn und übertragen Sie es in die Vibram-Kammer. Entferne die ersten 2,5 bis drei Millimeter des Hirngewebes mit einer Klinge. Passen Sie anschließend die Schnittgeschwindigkeit und -frequenz an, um die Beschädigung der Schnittoberfläche zu begrenzen.

Stellen Sie anschließend die Dicke auf 300 Mikrometer ein und beginnen Sie mit dem Schneiden. Sobald die Klinge den Kortex passiert hat, verwende eine Rasierklinge oder eine gebogene Nadel, um einen Schnitt über dem Hippocampus und an den Rändern des kortikalen Bereichs von Interesse zu machen. Danach werden die Scheiben in eine Multi-Well-Inkubationskammer bei 36 Grad Celsius überführt.

Platzieren Sie bei diesem Verfahren eine Scheibe mit der 40-fachen Vergrößerungslinse in der Aufnahmekammer. Suchen Sie nach gesunden Zellen in Schicht fünf und 600 bis 1000 Mikrometern. Unterhalb der Gehirnoberfläche haben diese Zellen in der Regel einen geringeren Kontrast, ein glattes Aussehen und sind nicht geschwollen.

Sobald eine gesunde Zelle gefunden wurde, beladen Sie ein Drittel der Mikropipette mit intrazellulärer Lösung. Platzieren Sie es dann in der Kopfstufe des vorkonfigurierten Linux-Betriebssystems. Starten Sie einen Befehl.

Fügen Sie die Eingabeaufforderung der Shell hinzu. Geben Sie diesen Befehl ein, um sicherzustellen, dass die Datenerfassungskarte den Verstärker nicht ansteuert. Üben Sie dann einen Überdruck von 30 bis 50 Millibar aus, indem Sie den Kolben der Spritze drücken, der mit dem Pipettenhalter verbunden ist.

Platzieren Sie anschließend die Pipette etwa 100 Mikrometer über der Scheibe und bewegen Sie die Pipette mit dem Annäherungsmodus des Mikrom-Manipulators in Richtung der Zielzelle. Stellen Sie danach den Pipettenoffset am Elektrophysiologie-Verstärker ein und geben Sie einen 10-Millivolt-Testimpuls im Voltage-Clamp-Modus aus. Überwachen Sie den Pipettenwiderstand mit dem Befehl LCG SEAL-Test und reduzieren Sie dann den Druck auf 10 bis 30 Millibar, indem Sie den Kolben der Spritze zurückziehen.

Nähern Sie sich vorsichtig der Zelle und prüfen Sie, ob sich ein Grübchen bildet, indem Sie das Bild auf dem Monitor der Videokamera beobachten. Überwachen Sie gleichzeitig eine durch den Prüfimpuls hervorgerufene Widerstandserhöhung, indem Sie die auf dem Monitor angezeigte Stromwellenform beobachten. Wenn der Pipettenwiderstand zunimmt und sich ein Grübchen an der Zelle bildet, lassen Sie sofort den Druck ab und üben Sie einen sanften Unterdruck auf die Pipette aus, um die Dichtungsbildung zu unterstützen.

Verringern Sie in der Zwischenzeit das Haltepotenzial schrittweise auf minus 70 Millivolt. Wenden Sie ein sanftes Saugen an, um die Zellmembran aufzubrechen und die gesamte Zellkonfiguration zu etablieren. Charakterisieren Sie dann die Zelle in Bezug auf ihre elektrischen Eigenschaften.

Mit dem Befehl LCGE-Code. Hier ist das durchschnittliche Aktionspotenzial eines geflickten Parametall-Neurons der Schicht fünf mit einer Schwelle von minus 50,5 Millivolt. Diese Abbildung zeigt die Messung der passiven Reaktionen auf die hyperpolarisierenden Ströme.

Die Identifizierung der grundlegenden aktiven Eigenschaften der Zelle zeigt, dass es sich bei der Zelle um ein reguläres Spiking-Neuron handelt, und es gibt eine minimale Anpassung, um simulierte exzitatorische, postsynaptische Potentiale zu injizieren, die in das Verzeichnis wechseln, in dem das nächste Experiment gespeichert wird, indem Sie diesen Befehl an der Eingabeaufforderung der Shell eingeben. Anstatt auf herkömmliche Hardware-Steuerungen des Verstärkers zu reagieren. Um den Brückenausgleich und die Kapazitätskompensation anzuwenden, schätzen Sie den Elektrodenkern, der für die Durchführung der aktiven Elektrodenkompensation erforderlich ist, indem Sie diesen Befehl ausgeben.

Der vollständige Kern ist die Summe aus zwei Komponenten, einem schnellen Elektrodenkern und einem langsameren Membrankern, der den exponentiellen Schwanz erzeugt, der im vollen Kern beobachtet wird. Ersteres stellt ein nicht-parametrisches Modell der Pipette dar. Bei der Strominjektion zur Trennung von Membran- und Elektrodenkernen fordert der LCG-Kernel-Befehl den Benutzer auf, die Anzahl der Punkte einzugeben, aus denen der schnelle Elektrodenkern besteht. Wählen Sie als Nächstes eine Zahl aus, so dass der Elektrodenkern das Ende des Exponentialzerfallsschwanzes bedeckt.

Führen Sie dann mit diesem Befehl das dynamische Klemmenexperiment durch. Visualisieren Sie abschließend die Ergebnisse. Hier ist die Nachbildung von in vivo ähnlicher Aktivität mit dynamischer Klemmung.

Rote und blaue Spuren stellen die Simulation von exzitatorischen bzw. inhibitorischen Synapsen dar. Und hier sind die Spannungsspuren, die von einem L-Fünf-Parametall-Neuron aufgezeichnet wurden, das einem Bombardement von erregenden oder hemmenden postsynaptischen Strömen ausgesetzt war. Der entsprechende erregende, hemmende und Gesamtstrom, der in die Zelle injiziert wird, ist in der Tabelle dargestellt.

Das Rasterdiagramm der Spikes, die in 20 Versuchen generiert wurden, zeigt, dass das Neuron auf dieselbe Eingabe äußerst zuverlässig und präzise reagieren kann. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dynamische Lampenexperimente mit der frei verfügbaren Software-Toolbox durchführen können. LCG. Dieses Verfahren kann auf andere Closed-Loop-Protokolle ausgeweitet werden, um eine Vielzahl von Themen zu untersuchen, die von neuronaler Erregbarkeit bis hin zu komplexen Netzwerkinteraktionen reichen.