Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente ist es, die Ausbreitung und komplexe Toxizität von PreOn-ähnlichen Proteinen mit Hilfe des Metazoen-Modellorganismus C elegance zu untersuchen. Dies wird durch die Überwachung des intra- und intrazellulären Transports von Vesikel, die das PreOn-ähnliche Protein enthalten, mit Hilfe der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie erreicht. Als nächstes folgen gewebespezifische Faltungssensoren und ubiquitär exprimierter Stress.

Reporter werden verwendet, um zellautonome und nicht-zellautonome Effekte auf die zelluläre Fitness zu bewerten. Anschließend wird ein genomweites RNAi-Screening durchgeführt, um neue Modifikatoren der PreOn-induzierten Toxizität zu identifizieren. Das Screening wird in Flüssigkultur durchgeführt, wobei Thrashing als Messwert für die Toxizität verwendet wird.

Schließlich wird der Wurmtracker, ein Plugin für Bild J, verwendet, um die Bewegung von C elegance in Kombination zu quantifizieren. Diese Methoden ermöglichen es, genetische Signalwege, die an der interzellulären Bewegung von PreOn-ähnlichen Proteinen beteiligt sind, und ihre nicht-zellautonome Toxizität auseinanderzukitzeln. Nach der Herstellung von synchronisierten transgenen Linien der Sea Elegance-Kontrolle und der PreOn-Domäne und 10%-Agros-Pads pipettieren Sie gemäß dem beigefügten Textprotokoll drei Mikroliter 100 Nanogramm Polystyrolkügelchen und drei Mikroliter vier Millimolar Limassol in das Agros-Pad.

Mit einem Platindraht-Plektrum werden Würmer im gewünschten Alter von einer Platte in die Lösung übertragen und mit einem Deckglas die Würmer auf subzellulärer Ebene abgebildet. Legen Sie einen Objektträger in den Objektträgerhalter eines konfokalen Mikroskops und verwenden Sie ein 63 x oder 100 x 1,4 NA Ölobjektiv. Öffnen Sie als Nächstes METAMORPH und wählen Sie Multidimensionale Erfassung.

Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Haupt" die Kontrollkästchen für Zeitraffer und Journale ausführen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Speichern" den Verzeichnisordner zum Speichern von Dateien aus oder erstellen Sie ihn und weisen Sie der Datei einen Namen zu. Verwenden Sie auf der Registerkarte "Wellenlänge" Yoko Quad Red oder eine gleichwertige Beleuchtung der MRFP-Bildgebung und stellen Sie die Belichtung auf 100 bis 300 Millisekunden und die Kameraverstärkung auf 100 bis 300 ein. Legen Sie anschließend auf der Registerkarte Zeitraffer das Zeitintervall auf eine Sekunde, die Dauer auf fünf Minuten und die Anzahl der Zeitpunkte auf 301 fest.

Unter der Registerkarte Journale. Für die Journalauswahl wählen Sie A FC setzen, Z halten und A FC zurück zu Z halten für den Typ Select Special zweimal und für Anfangspunkt den Beginn des Zeitpunkts und das Ende des Zeitpunkts auswählen. Wenn die Einrichtung abgeschlossen ist, drücken Sie die Erfassungstaste. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Partikelverfolgungsanwendungen verwendet werden, um die dynamischen Eigenschaften von Discus zu messen.

Nach der Synchronisierung der transgenen und vom Typ Nematoden der Prionendomäne und dem Kopieren der inger RNAI-Bibliotheksplatten gemäß dem Textprotokoll werden duplizierte RNAi-Platten bei 37 Grad Celsius und 300 U/min inkubiert, um HT ein 15 E coli-Bakterium mit dem leeren Vektor L 4 4 4 0 als Kontrolle zu verwenden. Züchten Sie es separat in einem Kulturröhrchen und übertragen Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 65 Mikroliter der Kultur in ein Viertel der Vertiefungen von 2 96. Well-Platten mit einer automatisierten Workstation, die einen Mehrkanalkopf enthält.

10 Mikroliter von fünf Millimolaren verdünntem IPTG in jede Vertiefung der RNAi-Bakterien und Kontrollplatten geben. Verschließen Sie sie wieder, bevor Sie sie drei Stunden lang inkubieren, während die Bakterien inkubieren. Mischen Sie die synchronisierte Wildtyp-Kontrolle und transgene L-1-Larven und M-Neun-Puffer gut und pipettieren Sie fünf bis 10 Mikroliter auf ein Glasmikroskop.

Schieben Sie die Zählung der Würmer und berechnen Sie die Anzahl der Würmer pro Mikroliter. Nach der dreistündigen bakteriellen Inkubation nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und lassen sie auf Raumtemperatur kommen, um zu vermeiden, dass die Würmer durch Hitze gestresst werden. Ergänzen Sie anschließend den M neun Puffer mit IPTG-Cholesterin und Antibiotika gemäß dem Textprotokoll.

Und fügen Sie das entsprechende Volumen der transgenen Wurmlösung der PreOn-Domäne bis zu einer Endkonzentration von 15 Würmern pro Mikrolitermischung hinzu, um sie gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie dann 50 Mikroliter in jede Vertiefung der RNAi-Platten und in die Vertiefungen einer der leeren Vektorkontrollplatten. Geben Sie die Wildtyp-Wurmlösung in die zweite Kontrollplatte.

Lassen Sie dann alle Platten unversiegelt, um eine Belüftung zu ermöglichen und die Flüssigkultur am Verdampfen zu hindern, indem Sie vier bis fünf Platten aufeinander stapeln und sie mit einem feuchten Papiertuch umwickeln, gefolgt von Aluminiumfolie. Inkubieren Sie die Platten vier Tage lang bei 20 Grad Celsius und 200 U/min. Verwenden Sie für die Platten eine Falcon 4 M 60-Kamera, die an einen Computer mit einem Monitor angeschlossen ist, um im Vergleich zu kontrollbehandelten transgenen Tieren aus der PreOn-Domäne eine visuelle Sichtprüfung durchzuführen.

Der Hauptvorteil der Verwendung einer automatisierten Liquid-Handling-Workstation zur Abgabe der Würmer in die R-RNAi-Platten besteht darin, dass die Variabilität und die Anzahl der Würmer pro Vertiefung erheblich reduziert werden. Um einen Motilitätsassay auf festen Platten durchzuführen und RNAi-Klonkandidaten zu validieren, züchten RNAi-Bakterien über Nacht gemäß dem Textprotokoll. Verwenden Sie dann ein millimolares IPTG, um die Expression von DS-RNA drei Stunden lang zu induzieren.

Verwenden Sie 150 Mikroliter jedes RNAi-Bakterienklons, um zuvor vorbereitete NGM-Platten zu säen und in einer dünnen Schicht zu verteilen. Lassen Sie die Bakterien zwei Tage lang bei Raumtemperatur im Dunkeln unter einem Stereomikroskop trocknen. Bestimmen Sie die Menge der synchronisierten Würmer und der Suspension wie oben beschrieben und geben Sie 25 bis 30 l eine Larve in jede Versuchsplatte.

Inkubieren Sie die Nematoden vier Tage lang bei 20 Grad Celsius, bis die Würmer erreichen. Am zweiten Tag des Erwachsenenalters, um die Beweglichkeit von Würmern zu quantifizieren, schalten Sie die Kamera und die einfache PCI-Bildgebungssoftware ein. Klicken Sie auf das Kamerasymbol, um die Anpassung der Bildgebungsbedingungen zu aktivieren.

Richten Sie als Nächstes die Imaging-Bedingung wie folgt ein. Stellen Sie die Verstärkung auf den Zero-Light-Modus, den High-Speed-Index auf eins und das Binning auf zwei ein. Klicken Sie dann auf Live und Auto Exposure und passen Sie die Lichtverhältnisse an, indem Sie die Mikroskopspiegel sowie die Helligkeits- und Kontrastregler bewegen.

Klicken Sie auf Zeit, scannen und geben Sie einen Ordner und einen Dateinamen ein, setzen Sie die Feldverzögerung auf 20 Millisekunden und die Stoppzeit auf 30 Sekunden. Drücken Sie auf Live-Review, um den Bereich der Platte auszuwählen, der aufgenommen werden soll. Dann klopfen Sie den Teller drei- bis viermal auf die Bühne.

Bestätigen Sie schnell seine Position im Sichtfeld und drücken Sie Start, nachdem die Aufnahme des Films beendet ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie Montagesequenz exportieren, um den Film aus einem CXD-Format in eine A VI-Datei zu exportieren. Um die Motilitätsvideos zu analysieren, öffnen Sie Bild J, wählen Sie die Registerkarte Plugins, wählen Sie dann Wurmtracker und wählen Sie Worm Tracker Batch, und wählen Sie das Verzeichnis aus, das alle zu analysierenden Dateien enthält. Laden Sie im Haupteingabefenster von Worm Tracker Batch die Eingabewerte, wie hier beschrieben. Eine Erklärung für jeden der Parameter finden Sie in den Anweisungen, die dem Plugin beiliegen.

Klicken Sie auf OK und lassen Sie die Bewegungsanalyse laufen. Um die Ergebnisse zu kuratieren, bestätigen Sie schließlich, dass alle erkannten Spuren von tatsächlicher Meereseleganz stammen, und beseitigen Sie Artefakte. Öffnen Sie die TXT-Dateien, die für jeden Film erstellt wurden, und kopieren Sie die Informationen in eine Datei mit einer Datenanalysesoftware.

Öffnen Sie die erstellten Etiketten-ZIP-Dateien und führen Sie die resultierenden Etiketten-TIFF-Dateien aus, um falsche Wurmspuren manuell zu überprüfen und zu entfernen. Yesper Peterson, ein ehemaliger Postdoc im Labor, hatte zuerst die Idee für den Wurmtracker als Ersatz für unsere manuelle Bewertung von CL Elegance motil, die eine Aussage für die Toxizität ist. Der Wurm-Tracker ermöglicht es uns, diese Experimente automatisiert und ohne Verzerrung durch den Benutzer durchzuführen und gleichzeitig mehr Bedingungen in kürzerer Zeit mit Hilfe von Zeitraffer-Bildgebung zu bewerten.

Das RFP mit R two E two, das sich in röhrenförmigen Vesikeln ansammelt, wurde innerhalb und zwischen Zellen transportiert, indem Coex einen Faltungssensor oder Stressreporter exprimierte. Zusammen mit der PreOn-ähnlichen Proteinzelle können autonome und nicht-zellautonome Effekte bewertet werden. Die Expression von R zwei E zwei in Muskelzellen führt zu einem früheren Beginn der Q 44-Aggregation im Darm, was zeigt, dass R zwei E zwei nicht-zellautonome Auswirkungen auf die Proteostase hat Co-Expression von R zwei E zwei Mit dem SOD drei PGFP Transkriptioneller oxidativer Stress Reporter führt zu einer Hochregulierung des Reporters in verschiedenen Geweben, Dies zeigt, dass die PreOn-Domäne eine oxidative Stressantwort induziert, die nicht zellulär autonom dem gesamten Genom-Screen folgt.

Dieser Film zeigt, dass hochauflösende Bildgebung und Visualisierung auf dem Computerbildschirm das gleichzeitige Screening eines Viertels einer Platte ermöglichen. Einmal gemeistert, kann dieses Screening-Protokoll in 12 Runden mit 25 Platten pro Sitzung durchgeführt werden. Wenn zwei Sitzungen pro Woche durchgeführt werden, kann die gesamte RNAi-Bibliothek innerhalb von sechs Wochen gescreent werden. Der Wurmtracker wurde verwendet, um die Motilität der C-Eleganz zu quantifizieren, wie hier zu sehen.

Worm Tracker konvertiert ein Originalvideo in ein Binärformat und jedem Wurm wird eine Spur zugewiesen. Verarbeitete Videos können mit überlagerten Spuren angezeigt werden, um Artefakte manuell zu entfernen. Der Parameter Körperlängen pro Sekunde normalisiert sich für mögliche Größenunterschiede. Fadenwürmer.

Mit dieser Methode wurden 35 Suppressoren der PreOn-induzierten Toxizität identifiziert, die den Motilitätsphänotyp auf mindestens 133 % und bis zu 256 % im Vergleich zu kontrolliert behandelten Würmern erhöhten. Beim Leasing des Wurmtrackers ist es wichtig, daran zu denken, die erhaltenen Wurmspuren manuell zu überprüfen. Die Software leistet hervorragende Arbeit bei der Identifizierung der Würmer, aber manchmal kann der Hintergrund immer noch fälschlicherweise als Tier identifiziert werden.

Denken Sie daher daran, Ihre Videos zu überprüfen, nachdem Sie den Wurm-Tracker auf ihnen ausgeführt haben. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich neurodegenerativer Erkrankungen zu beantworten, z. B. ob ein bestimmtes Krankheitsverbindungsprotein in der Lage ist, sich von Zelle zu Zelle auszubreiten, oder ob es einen Zusammenhang zwischen der interzellulären Übertragung und der komplexen Toxizität dieser Proteine gibt. Kinder.