Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikel Dextransulfat

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Herstellung und Charakterisierung von SD F1 Alpha Chias und Dextransulfat-Nanopartikeln. Die Herstellung der Nanopartikel erfolgt durch erstes Mischen des Stammzell-Homing-Faktors, des stromalen zellabgeleiteten Faktors eins alpha oder S df eins alpha mit Dextransulfat, um eine Bindung an das negativ geladene Glykan zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt wird Ozon dem Gemisch ein positiv geladenes Glykan zugesetzt, das einen Polyelektrolytkomplex mit Dextransulfat bildet.

Als nächstes wird Zinksulfat zugegeben, um die Komplexe mit Zinkbrücken zu stabilisieren. Das resultierende Teilchen hat einen dichten Kern, der von einer negativ geladenen Hülle umgeben ist. Anschließend werden die Partikel auf ihre Größe und ihr Zetapotenzial sowie auf den Gehalt und die Aktivität von S df one alpha in den Nanopartikeln gemessen. Der Hauptvorteil der SDF one alpha Glykan-Nanopartikel besteht darin, dass das eingebaute SDF one alpha voll aktiv ist, ohne von den Partikeln freigesetzt zu werden.

Daher könnten die Partikel nützlich sein, um als stationäres Herminsignal in der Stammzelltherapie zu dienen. Bereiten Sie zunächst Stammlösungen vor, wie im Textprotokoll beschrieben, und sterilisieren Sie sie durch 0,22-Mikron-Filtermembranen. Bestimmen Sie den Endotoxingehalt in der vorbereiteten Lösung mit dem Ulu-Amöbenzyt-Lysat-Gelgerinnsel-Assay.

Stellen Sie sicher, dass die Werte weniger als 0,06 Endotoxineinheiten pro Milliliter betragen. Anschließend werden 0,18 Milliliter Reinstwasser in ein 1,5-Milliliter-Glasfläschchen gegeben, das einen magnetischen Rührstab enthält. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 800 U/min ein, fügen Sie dann 0,1 Milliliter 1%Dextransulfat hinzu und rühren Sie nach zwei Minuten um.

0,08 Milligramm SD F1 alpha hinzufügen und 20 Minuten lang rühren. Tropfen weise 0,33 Milliliter 0,1%Tizen hinzufügen und fünf Minuten lang rühren. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf das Maximum und fügen Sie langsam 0,1 Milliliter Zinksulfat mit einer gasdichten Spritze hinzu.

Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 800 U/min zurück und rühren Sie 30 Minuten lang. Fügen Sie dann 0,4 Milliliter 15% Mannitol hinzu und rühren Sie nach fünf Minuten um. Das Reaktionsgemisch wird in ein 1,5-Milliliter-Fugenröhrchen umgefüllt und 10 Minuten lang bei 16.000 g und vier Grad Celsius zentrifugiert.

Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und mit einer Pipette den letzten Tropfen Flüssigkeit entfernen. Fügen Sie langsam 0,2 Milliliter 5%iges Mannitol hinzu und suspendieren Sie das Pellet mit einer 0,5 Milliliter 29-Gauge-Nadelspritze. Fügen Sie dann vor dem Zentrifugieren einen weiteren Milliliter 5%Manitol hinzu.

Ein zweites Mal bei 16.000 GS für 15 Minuten. Nach Wiederholung des Resus-Suspensionszentrifugationsprozesses wird der Überstand abgesaugt und das Pellet in 0,2 Millilitern 5%igem Mannitol resuspendiert. Die Partikelgröße und das Zetapotenzial werden durch dynamische Lichtstreuung bzw. elektrophoretische Lichtstreuung analysiert.

Wählen Sie zunächst eine Operationsprozedur aus der SOP-Liste aus, die Parameter für die Partikelgrößenmessung durch dynamische Lichtstreuung enthält. Wie im Textprotokoll aufgeführt, verdünnen Sie die SD F1 alpha-Partikelprobe mit Wasser. Laden Sie dann 100 Mikroliter der Probe in einen Einweg-UV Q Vet wie einen Einor Q Vet.

Setzen Sie den Q vet in den Küvettenhalter ein und warten Sie, bis die Intensitätseinstellung optimal ist, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen. Nach Abschluss der Messung sind die kumulierten Ergebnisse des Durchmessers und des Polydispersitätsindex aufzuzeichnen. Die Ergebnisse jeder der vier wiederholten Messungen werden gemittelt und die Standardabweichung für die Messung des Zetapotenzials durch elektrophoretische Lichtstreuung berechnet.

Laden Sie 500 Mikroliter der zehnfach verdünnten Partikelprobe in die Durchflusszelle. Wählen Sie eine Operationsprozedur aus der Liste der Zeta Potential SOP aus, die Parameter für die Messung enthält, wie sie im Textprotokoll aufgeführt sind. Notieren Sie die Ergebnisse des Zetapotenzials.

Mitteln Sie dann die Ergebnisse aus jedem der fünf wiederholten Messwerte und berechnen Sie die Standardabweichung. Die verdünnten Proben von freiem und partikelgebundenem SD F1 alpha werden in Laly-Probenpuffer 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius erhitzt. Wirbeln Sie die Proben während des 10-minütigen Erhitzens zweimal vortexen, um die Partikel vollständig zu dissoziieren, nachdem Sie die Proben zwei Minuten lang auf Raumtemperatur abgekühlt hatten, die Zentrifuge hatte 10.000 Gs für 0,5 bis eine Minute, um den Wasserkondensatwirbel wieder gut zu mischen.

Zu diesem Zeitpunkt sollte die Probenlösung klar sein und kein sichtbarer Niederschlag vorhanden sein. Laden Sie dann 10 Mikroliter Probe pro Vertiefung in ein Gel mit vier bis 20 % Natrium-ESAL-Sulfat oder SDS. Führen Sie die Elektrophorese 20 Minuten lang bei 200 Volt durch, bevor Sie das Gel mit Kumasi-Blau-Protein-Färbung färben.

Untersuchen Sie die Proteinbandendichte von SD F1 alpha mit einem molekularen Imager und einer Densitometrie-Analysesoftware. Berechnen Sie die Menge an S DF one alpha in den Partikeln anhand einer Standardkurve, die mit freien SDF one alpha-Standards erstellt wurde, um den In-vitro-Freisetzungsassay durchzuführen: Mischung aus SD F1 alpha-Glykanpartikeln mit Docos-Phosphatpuffer-Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium oder DPBS im Verhältnis eins zu eins. Die Partikelsuspension wird in 1,5-Milliliter-Röhrchen in 0,05-Milliliter-Aliquoten aufgeteilt.

Laden Sie die Proben auf den Boden der Röhrchen. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen oder das Aufwirbeln der Oberfläche der Flüssigkeit. Versiegeln Sie die Oberseite der Rohre mit Paraform.

Drehen Sie dann die Röhrchen bei 37 Grad Celsius auf einem rotierenden Mikroröhrchenmischer. Entfernen Sie die Aliquote zu den angegebenen Zeiten aus den Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben unmittelbar nach dem Zentrifugieren 10 Minuten lang bei 16.000 g bei vier Grad Celsius. Überstände und Pellets voneinander trennen.

Konstituieren Sie dann das Pellet mit 0,05 Millilitern DPBS. Nachdem alle Proben entnommen wurden, untersuchen Sie die Überstände und Pellets auf einem SDS-Gel. Wie zuvor misst dieser Assay die chemotaktische Aktivität von S df.

Eine Alpha-Interaktion von S df und einem Alpha mit seinem Rezeptor bewirkt eine Wanderung der Zelle in Richtung des SD F1 alpha-Gradienten. Zu Beginn wird die freie oder partikelgebundene Form von SD F1 alpha mit Migrationspuffer in einer dreifachen seriellen Verdünnung auf die im Textprotokoll aufgeführten Endkonzentrationen verdünnt. Für die Negativkontrolle werden 0,6 Milliliter der verdünnten SD F1 alpha-Lösung in eine Vertiefung in der 24-Well-Platte gegeben.

Führen Sie die gleiche Funktion für den Migrationspuffer aus, fügen Sie dann 0,57 Milliliter Migrationspuffer zu einem Well für das Eingabezellensteuerelement hinzu. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Legen Sie dann einen permeablen Zellkultureinsatz, z. B. Transwell, auf die untere Vertiefung und laden Sie 0,1 Milliliter Jerk-Hat-Zellen in den Transwell-Einsatz.

Laden Sie dann 0,03 Milliliter Zellen direkt in das Eingabezellensteuerelement. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Entfernen Sie nach der Inkubation die Zellkultureinsätze.

Übertragen Sie die Zellen, die in die unteren Vertiefungen gewandert sind, in ein Vier-Milliliter-Polystyrolröhrchen. Zählen Sie die migrierten Zellen mit einem Durchflusszytometer. Berechnen Sie schließlich die Migration als Prozentsatz der eingegebenen Zellennummer nach Subtraktion der Zahlen in den Negativkontrollen.

Hier ist die Analyse der SD F1 alpha-Dextransulfat-ozan-Partikelgrößenmessung dargestellt. Das CUMUL-Ergebnis zeigt, dass der hydrodynamische Durchmesser des Partikels 671 Nanometer und die Polydispersität 0,24 beträgt. Dieser Screenshot zeigt eine der fünf wiederholten Messungen des Zetapotentials der SD F1 alpha DExT Strang Sulfate ozan Partikel.

Das Zetapotential liegt bei minus 24,7 Millivolt. Die Menge an S df one alpha in den S df one alpha Dextran Sulfat ozan Partikeln wird durch SDS-Gelelektrophorese geschätzt. Hier ist ein Kumasi-gefärbtes SDS-Gel mit SD F1 alpha Standards, Dextransulfat Kaizan Kontrollnanopartikeln und SD F1 alpha Dextransulfat Kaizan Nanopartikeln geladen.

Eine Standardkurve wird aus der Dichteanalyse der SD F1 Alpha Standard-Banden erstellt, die Berechnung aus der Standardkurve zeigt, dass die S DF Eins-Alpha-Konzentration in der SDF-Ein-Alpha-Nanopartikel-Probe 0,03 Milligramm pro Milliliter beträgt. Um die in vitro Freisetzungsrate von S DF one alpha aus den Nanopartikeln zu bestimmen, wurde die Menge an freigesetztem S DF one alpha im Supernat und die Menge an partikelgebundenem sdf one alpha in den Pellets durch Kumasi-Färbung eines SDS-Gels mit anschließender zytometrischer Analyse bestimmt. Die Aktivität des partikelgebundenen S DF one alpha wird mit einem Migrationsassay gemessen und mit diesem verglichen, einem freien SDF one alpha, wie hier gezeigt.

Das teilchengebundene SDF one alpha induzierte bei allen gemessenen Konzentrationen das gleiche Ausmaß der Migration wie ein freies s DF one alpha. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Formulierung der Glykanproteinpartikel verändert werden kann. Je nach Anwendung können andere Proteine eingebaut und unterschiedliche Formulierungen verwendet werden, um die Partikelgröße zu variieren.

Wir hoffen, dass dieses Video die grundlegenden Techniken zur Vorbereitung des Sammelns von Nanopartikeln und die anschließende Funktionsanalyse des eingebauten SDF one alpha demonstriert.