Name: Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikel Dextransulfat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Erfahren Sie die Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikeln mit Dextransulfat. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung wirksamer Trägersysteme für Stammzelltherapien.

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HL671795, HL048743 und HL108630: Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse unterstützt.

1. Vorbereitung der SDF-1α Glycan Nanopartikel Aufgrund der Zweck der in vivo-Abgabe, Sterilisieren alle Behälter, Pipetten und Spitzen in der Zubereitung verwendet. <ol><li> Die folgenden Stammlösungen in hochreinem Wasser: 1% Dextransulfat; 1M NaOH (steril mit einem PES-Membran gefiltert); 0,1% Chitosan in 0,2% Eisessig (Filter durch 0,8 und 0,22 um Filter nacheinander und Einstellen des pH auf 5,5 mit NaOH später); 0,1M ZnSO 4; 15% Mannit; und 0,92 mg / ml SDF-1α (in Aliquots bei -80 ° C gelagert, und bei 4 ° C gehalten wurde, einmal aufgetaut). </li><li> Sterilisieren Stammlösungen durch 0,22 um Filtermembranen. Beurteilen Endotoxinspiegel in der hergestellten Lösung mit Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) Gelklumpens Assay. Stellen Sie sicher, dass die Pegel &lt;0,06 EU / ml. </li><li> In 0,18 ml Reinstwasser in ein 1,5 ml-Glasfläschchen mit einem magnetischen Rührstab. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 800 Umdrehungen pro Minute. 0,1 ml 1%Dextransulfat und rühre 2 min. Hinzufügen 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml von 0,92 mg / ml SDF-1α-Lösung) und rühre 20 min. </li><li> In 0,33 ml 0,1% Chitosan tropfenweise und unter Rühren für 5 min. Ändern Rührgeschwindigkeit auf die maximale und 0,1 ml 0,1 M ZnSO 4 langsam mit einer 0,1 ml Spritze (über 1 min). </li><li> Zurückzukehren Rührgeschwindigkeit auf 800 Upm und rührt 30 min. Fügen Sie 0,4 ml 15% Mannit und rühren für 5 min. Übertragen der Reaktionsmischung auf ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 16.000 × g bei 4 ° C für 10 min. Anmerkung: Die Anwesenheit von Mannit erleichtert die Resuspension der Partikel nach Zentrifugation. Abhängig von der Dichte des Pellets kann Mannit Konzentration von 0% bis 5% variieren. Vollständige Resuspendierung der Partikel nach jedem Zentrifugationsschritt ist kritisch, um Aggregate in der endgültigen Suspension zu vermeiden. </li><li> Überstand wird abgesaugt und mit einer Pipette den letzten Tropfen Flüssigkeit langsam zu entfernen. 0,2 ml 5% Mannit. Hängen Sie das Pellet mit 0,5 ml, 29 G needle Spritze. 1 ml 5% Mannit. Zentrifugieren bei 16.000 xg für 15 min. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.6. </li><li> Saugen Sie den Überstand. Das Pellet in 0,2 ml 5% Mannit. Bewahren Sie die Partikel-Suspension bei 4 ° C. Anmerkung: Die Partikelsuspension kann auch bei -80 ° C gefroren gelagert oder lyophilisiert werden. Einschließlich 5% Mannitol in der Suspension ist wesentlich, um die Aggregation der Partikel nach dem Einfrieren und Auftauen oder nach Lyophilisierung und Rehydratisierung zu verhindern. Mannitol kann durch Zentrifugieren der Suspension nach der Lagerung entfernt werden. </li></ol> 2. Messung der Partikelgröße und Zetapotential Die Teilchengröße und Zeta-Potential werden durch dynamische Lichtstreuung und Elektrophorese-Lichtstreuung, die jeweils analysiert, mit einer in der Materialliste angegeben Teilchenanalysator. <ol><li> Richten Sie die folgenden Parameter für Partikelgrößenmessung: Thesaurierung Zeiten: 70; Wiederholungszeiten: 4; Temperatur: 25 ° C;Verdünnungsmittel: Wasser; Intensitätseinstellung: auto. </li><li> Verdünnen Sie die SDF-1α-DS-CS-Probe mit Wasser (10-fache Verdünnung). Last 100 ul der Probe auf eine wegwerfbare UV Küvette wie einem Eppendorf Küvette. Die Küvette in den Küvettenhalter einsetzen. Warten Sie auf die Intensitätseinstellung zu &quot;Optimum&quot; (~ 10.000 cps) zu erreichen. Starten Sie die Datenerfassung. </li><li> Nachdem die Messung abgeschlossen ist, notieren Sie die Kumulanten Ergebnisse der Durchmesser (nm) und Polydispersitätsindex. Der Mittelwert der von jedem der vier wiederholten Ablesungen stammenden Ergebnisse und die Berechnung der Standardabweichung. </li><li> Last 500 ul des 10-fach verdünnten Partikelprobe zu einer Durchflusszelle zum Zeta-Potential-Messung. Richten Sie die folgenden Parameter für die Messung: Thesaurierung Zeiten: 10; Wiederholzeiten: 5; Temperatur: 25 ° C; Verdünnungsmittel: Wasser; Intensitätseinstellung: auto. Aufzeichnung der Ergebnisse des Zetapotential (mV). Durchschnitt das Ergebnis von jedem der 5 wiederholten Ablesungen stammenden, und berechnen Sie die Standard deviation. </li></ol> 3. Quantifizierung von SDF-1α in den Teilchen <ol><li> Verdünne freier Form SDF-1α, um Konzentrationen von 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 und 0,05 mg / ml in 1,3 x Laemmli-Probenpuffer. Verdünnen 6 ul SDF-1α-DS-CS Proben mit 40 ul 1,3x Laemmli-Probenpuffer. (Bereiten 4x Laemmli Lager-Puffer, der 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% Glycerin, 0,05 mg / ml Bromphenolblau und 8% 2-Mercaptoethanol. Teilen Sie die Stammlösung in kleine Aliquots bringen und -20 ° C zur Einzelnutzung.) </li><li> Erhitzen Sie die Proben bei 100 ° C für 10 min. Vortex die Proben zweimal (jeweils 10 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit) während des 10 min Erhitzungsdauer, um die Teilchen vollständig zu dissoziieren. Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur für 2 min. Zentrifuge bei 10.000 × g für 0,5-1 min hinunter die Wasserkondensat zu bringen. Vortex wieder gut mischen. Hinweis: An dieser Stelle sollte der Probenlösung klar ohne sichtbare Niederschlag vorhanden sein. </li><li> Last 10 &amp;# 181; l Probe / Vertiefung zu einem 4-20% SDS-Gel. Führen Elektrophorese bei 200 V für 20 min. Färben Sie das Gel mit Coomassie-Blau-Färbung Protein. </li><li> Untersuchen Sie die Proteinbande Dichte von SDF-1α mit einem Molekular Imager und Densitometrie-Analyse-Software. Berechnen der Menge des SDF-1α in den Teilchen mit einer Standardkurve mit freiem SDF-1α-Standards konstruiert. </li></ol> 4. In-vitro-Freisetzungstest <ol><li> Mischungs SDF-1α Glykan Teilchen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ohne Calcium und Magnesium (D-PBS) bei einem Verhältnis 1: 1 (v / v). </li><li> Teilen Sie die Partikelsuspension in 0,05 ml-Aliquots in 1,5-ml-Röhrchen. Laden der Proben auf den Boden der Röhrchen. Einleiten von Luftblasen zu vermeiden oder die Oberfläche der Flüssigkeit zu stören. Verschließen Sie die Spitze der Röhrchen mit Parafilm. Anmerkung: Dabei wird die Flüssigkeit am Boden während der nachfolgenden oben nach unten auf dem Drehrohrmischer sein. </li><li> Drehen Sie die Rohre auf 37 &amp;# 176; C auf einer rotierenden Mikrorohr Mixer. Aliquots Entfernen aus den Rohren in den angegebenen Zeiten und sofort zu zentrifugieren die Proben bei 16.000 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Trennen Sie die Überstände und Pellets und Rekonstitution des Pellets mit 0,05 ml D-PBS. Lagern Sie die Proben bei -20 ° C. Nachdem alle Proben gesammelt werden, prüft die Überstände und Pellets auf einem SDS-Gel, wie oben beschrieben. </li></ol> 5. Migration Assay Dieser Test misst die chemotaktische Aktivität von SDF-1α. Wechselwirkung von SDF-1α mit seinem Rezeptor (CXCR4) auf der Zelloberfläche bewirkt Migration der Zelle in Richtung der SDF-1α Gradienten. In diesem Assay werden die Zellen in einen oberen und und SDF-1α-Lösung (die durch eine semipermeable Membran von einer unteren Vertiefung getrennt) in einer unteren Vertiefung geladen. <ol><li> Verdünne SDF-1α (frei oder partikelgebundene Form) mit Migrationspuffer (RPMI-1640-Medium, das 0,5% Rinderserumalbumin) in einem 3-fold serielle Verdünnung, um Endkonzentrationen von 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 und 0,05 ng / ml. </li><li> Hinzufügen von 0,6 ml der verdünnten SDF-1α Lösung oder Migrationspuffer allein (negative Kontrolle), um ein gut in der 24-Well-Platte. In 0,57 ml Migrationspuffer auf eine gut (Eingabezellensteuerung). Bei 37 ° C für 30 min. Legen Sie einen durchlässigen Zellkultureinsatzes wie Transwell (Porengröße 5 um, Durchmesser 6,5 mm) auf der Oberseite des unteren gut. Last 0,1 ml Jurkat-Zellen (5 × 10 5) in den Transwell einzufügen. Laden 0,03 ml Zellen direkt an die Eingangszelle Kontrollvertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 2 h in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Entfernen Sie die Transwell-Einsätze. Übertragen Sie die Zellen, die zu den unteren Vertiefungen in ein 4 ml Polystyrolröhrchen eingewandert sind. Zählen Sie die migrierten Zellen mit einem Durchflusszytometer. </li><li> Migrations Berechnen als Prozentsatz der Eingangszellennummer (Zellennummer in der Eingangszelle Kontrollkavität x 100/30) nach Subtraktion der Anzahlen in negative Kontrollen (Zellen, die Vertiefungen, die nur Migrationspuffer migriert). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wie oben erwähnt, werden die DS-CS Nanopartikeln durch Ladungsneutralisation zwischen Polyanion (DS) und Polykation (CS) Molekülen gebildet. Da die Ladungswechselwirkung während der Molekular Kollision leicht, die Konzentration der Polymerlösungen und die Rührgeschwindigkeit beim Vermischen von entscheidender Bedeutung für die Größe der resultierenden Teilchen. Ein genereller Trend ist, dass mehr DS und CS-Lösungen 15 und höhere Rührgeschwindigkeit Ergebnis in kleinere Partikel verdünnt. <p class="jove_co...

Dextransulfat (DS) und Chitosan (CS) sind Polysaccharide mit mehreren substituierten negativ geladenen Sulfatgruppen (DS) oder positiv geladenen Amingruppen (deacetyliert CS). Wenn in einer wässrigen Lösung gemischt, die zwei Polysacchariden Polyelektrolytkomplexe durch elektrostatische Wechselwirkungen. Die resultierenden Komplexe können große Aggregate, die aus der wässrigen Lösung (Präzipitate)-Phase abgetrennt werden, oder kleine Teilchen, die in Wasser dispergierbare (Kolloide) sind zu bilden. Die spezifischen Bedingungen, die zu diesen Ergebnissen beigetragen haben, wurden ausführlich untersucht und wurden zusammengefasst und in einer aktuellen Bewertung 1 im Detail dargestellt. Unter diesen Bedingungen sind die entgegengesetzt geladenen Polymere müssen 1) deutlich unterschiedliche Molmasse zwei grundlegende Anforderungen für die Herstellung von in Wasser dispergierbaren Teilchen; und 2) in einem nicht-stöchiometrischen Verhältnis vermischt werden. Diese Bedingungen werden die ladungsneutrale komplexierten Polymersegmente durch Ladungs ​​erzeugt erlaubenNeutralisation zu trennen und bilden den Kern des Teilchens, und das überschüssige Polymer an der Außenschale 1 bilden. Die in diesem Protokoll beschrieben Glykan Partikel zur pulmonalen Verabreichung von Nanometerdimensionen bestimmt und sind entworfen net werden negativ geladen, und. Die negative Oberflächenladung verringert die Wahrscheinlichkeit der zellulären Aufnahme der Teilchen 2,3. Partikel von Nanometerdimension erleichtern den Durchgang durch die distalen Atemwege. Um dieses Ziel zu erreichen, ist die Menge des DS in dieser Zubereitung von mehr als CS (Gewichtsverhältnis 3: 1); und hochmolekulare DS (Gewichtsmittel MW 500.000) und Niedermolekulare CS (MW-Bereich von 50 bis 190 kDa, 75-85% deacetylierte) verwendet. SDF-1α ist ein Stammzelle Homing Faktor, der die Referenzfahrt-Funktion durch seine chemotaktische Aktivität ausübt. SDF-1α spielt eine wichtige Rolle in der Referenzfahrt und der Wartung von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark, und bei der Einstellung von progenitor Zellen peripheren Gewebe für Verletzungen Reparatur 4,5. SDF-1α hat eine Heparin-Bindungsstelle in der Proteinsequenz, die das Protein an Heparin / Heparansulfat, Dimere zu binden, aus Protease (CD26 / DPPIV) Inaktivierung geschützt werden, und mit Zielzellen in Wechselwirkung über Zelloberflächenrezeptoren ermöglicht 6-8. DS ähnliche strukturelle Eigenschaften wie Heparin / Heparansulfat; So kann die Bindung von SDF-1α DS wäre ähnlich der des natürlichen polymeren Liganden. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir die Herstellung von SDF-1α-DS-CS Nanopartikel. Die Verfahren stellen eine der Formulierungen, die bisher untersucht wurden, 9. Das Protokoll ist ursprünglich aus einer Untersuchung von VEGF-DS-CS-Nanopartikeln 10 angepasst. Eine kleine technische Herstellung beschrieben, die leicht mit den gleichen Stammlösungen und Herstellungsbedingungen skaliert werden kann. Nach der Herstellung werden die Teilchen b gekennzeichnety Prüfung ihrer Größe, Zetapotential, das Ausmaß der SDF-1α Einarbeitung in vitro Freigabezeit, und die Aktivität des einge SDF-1α.

<table><tbody><tr><td>Dextransulfat</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>Chitosan, niedermolekulares Gewicht</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alpha</td><td>Erstellt nach Referenz 8.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter, PES-Membran 0,22&nbsp; &#956; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>magnetische Mikrorührstäbchen (2&nbsp; x&nbsp; 7&nbsp; mm)</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen-Kit; SUN-SRi</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Delsa Nano C Partikelanalysator&nbsp;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue Safe Protein Stain</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>Molekularer Imager VersaDoc MP 4000 System</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Permeable Supports</td><td>Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent plus Bausatz</td><td>Fisher</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung und charakterisierung von sdf-1α-chitosan-nanopartikel dextransulfat

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) und Dextransulfat (DS) sind geladene Polysaccharide (Glykane), die Nanopartikel auf Basis von Polyelektrolytkomplexen bilden, wenn sie unter geeigneten Bedingungen gemischt werden. Die Glykan-Nanopartikel sind nützliche Träger für Proteinfaktoren, die die In-vivo-Abgabe der Proteine erleichtern und ihre Retention im Zielgewebe aufrechterhalten. Die Glykan-Polyelektrolyt-Komplexe eignen sich auch hervorragend für die Proteinabgabe, da der Einbau in wässriger Lösung erfolgt, was die Wahrscheinlichkeit einer Inaktivierung der Proteine verringert. Proteine mit einer Heparin-Bindungsstelle haften leicht an Dextransulfat und werden wiederum durch die Bindung stabilisiert. Diese Partikel sind auch weniger entzündlich und giftig, wenn sie in vivo verabreicht werden. In dem unten beschriebenen Protokoll wird zunächst SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), ein Stammzell-Homing-Faktor, gemischt und mit Dextransulfat inkubiert. Chitosan wird der Mischung zugesetzt, um Polyelektrolytkomplexe zu bilden, gefolgt von Zinksulfat, um die Komplexe mit Zinkbrücken zu stabilisieren. Die resultierenden SDF-1α-DS-CS-Partikel werden auf Größe (Durchmesser) und Oberflächenladung (Zetapotential) gemessen. Die Menge des eingebauten SDF-1α wird bestimmt, gefolgt von Messungen seiner in vitro Freisetzungsrate und seiner chemotaktischen Aktivität in partikelgebundener Form.

Die Größe und Zetapotential der vorbereiteten SDF-1α-DS-CS-Partikel mit einer Partikelanalysegerät bestimmt. Figur 1 zeigt die Analyse der Größenmessung. Aus den Ergebnissen von Kumulanten vier wiederholten Messungen erhalten wird, ist die mittlere hydrodynamische Durchmesser der SDF-1α-DS-CS Partikel 661 ± 8,2 (nm) und die Polydispersität beträgt 0,23 ± 0,02. Das Ergebnis der Zetapotentialmessung ist in Fig. 2 gezeigt Von den fünf wiederholten Messungen, das Zetapotential der SDF-1α-DS...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, SDF-1α, einen Stammzell-Homing-Faktor, in Dextransulfat-Chitosan-Nanopartikel einzubauen. Die resultierenden Partikel werden auf ihre Größe und ihr Zetapotenzial sowie auf den Gehalt, die Aktivität und die In-vitro-Freisetzungsrate von SDF-1α aus den Nanopartikeln gemessen.

Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikel Dextransulfat

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, SD F1 Alpha Chias und Dextransulfat-Nanopartikel herzustellen und zu charakterisieren. Die Herstellung der Nanopartikel erfolgt, indem zunächst der Stammzell-Homing-Faktor Stroma-Zell-abgeleiteter Faktor 1 Alpha oder SDF-1α mit Dextransulfat gemischt wird, um die Bindung an das negativ geladene Glykan zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt wird Ozan, ein positiv geladenes Glykan, der Mischung zugesetzt, wodurch ein Polyelektrolyt-Komplex mit Dextransulfat entsteht.Anschließend wird Zinksulfat hinzugefügt, um die Komplexe durch Zinkbrücken zu stabilisieren. Das resultierende Partikel besitzt einen dichten Kern, der von einer negativ geladenen Hülle umgeben ist. Die Partikel werden anschließend hinsichtlich ihrer Größe und Zetapotential sowie des Gehalts und der Aktivität von S df one alpha in den Nanopartikeln gemessen. Der Hauptvorteil der SDF one alpha-Glycan-Nanopartikel besteht darin, dass das eingebaute SDF one alpha vollständig aktiv ist, ohne aus den Partikeln freigesetzt werden zu müssen.Daher könnten die Partikel nützlich sein, um als stationäres Hermin-Signal in der Stammzelltherapie zu dienen. Bereiten Sie zunächst die Stammlösungen gemäß der schriftlichen Anleitung vor und sterilisieren Sie diese durch 0,22-Mikron-Filtermembranen. Bestimmen Sie die Endotoxin-Konzentrationen in der hergestellten Lösung mittels Ulmus-amebozyt-Lysat-Gel-Clot-Assay.Stellen Sie sicher, dass die Konzentrationen unter 0,06 Endotoxin-Einheiten pro Milliliter liegen. Geben Sie anschließend 0,18 Milliliter ultrareines Wasser in ein 1,5-Milliliter-Glasfläschchen, das einen Magnetrührer enthält. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 800 min⁻¹ ein und geben Sie dann 0,1 Milliliter 1% Dextransulfat hinzu. Rühren Sie zwei Minuten lang nach. Fügen Sie 0,08 Milligramm SD F1 Alpha hinzu und rühren Sie 20 Minuten lang. Geben Sie tropfenweise 0,33 Milliliter 0,1 % Tizen zu und rühren Sie fünf Minuten lang. Ändern Sie die Rührgeschwindigkeit auf das Maximum und geben Sie langsam 0,1 Milliliter Zinksulfat mit einer gasdichten Spritze zu. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit wieder auf 800 U/min ein und rühren Sie 30 Minuten lang. Geben Sie anschließend 0,4 Milliliter 15 %iges Mannitol zu und rühren Sie nach fünf Minuten weiter. Überführen Sie das Reaktionsgemisch in ein 1,5-Milliliter-Fugeglas und zentrifugieren Sie es 10 Minuten bei 16.000 G und vier Grad Celsius.Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und mit einer Pipette den letzten Tropfen Flüssigkeit abziehen. Langsam 0,2 Milliliter 5 % Mannitol hinzufügen und das Pellet mit einer 0,5-Milliliter-Spritze mit Nadel der Größe 29 G aufnehmen. Danach ein zusätzliches Milliliter 5 % Mannitol hinzufügen, bevor zentrifugiert wird.Ein zweites Mal bei 16.000 ×g für 15 Minuten. Nach Wiederholung des Resuspendierungs-Zentrifugationsprozesses den Überstand abpipettieren und das Pellet in 0,2 Milliliter 5 % Mannitol resuspendieren. Die Partikelgröße und das Zetapotential werden mittels dynamischer Lichtstreuung bzw. elektrophoretischer Lichtstreuung analysiert.Wählen Sie zunächst ein Verfahren aus der SOP-Liste aus, die Parameter für die Partikelgrößenmessung mittels dynamischer Lichtstreuung enthält. Wie im Textprotokoll angegeben, verdünnen Sie die SD F1 Alpha-Partikelprobe mit Wasser. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter der Probe in eine Einweg-UV-Q-Vet, beispielsweise eine Einor-Q-Vet.Setzen Sie den Q vet in den Zellhalter ein und warten Sie, bis die Intensitätsanpassung optimal ist, bevor Sie mit der Datenaufnahme beginnen. Nach Abschluss der Messung notieren Sie die kumulativen Ergebnisse für Durchmesser und Polydispersitätsindex. Mitteln Sie die Ergebnisse aus den vier wiederholten Messungen und berechnen Sie die Standardabweichung für die Messung des Zetapotentials mittels elektrophoretischer Lichtstreuung.Geben Sie 500 Mikroliter der zehnfach verdünnten Partikelprobe in die Durchflussküvette. Wählen Sie ein Betriebsverfahren aus der SOP-Liste für das Zeta-Potential, die die im Textprotokoll aufgeführten Parameter für die Messung enthält. Notieren Sie die Ergebnisse des Zeta-Potentials.Anschließend die Ergebnisse der fünf wiederholten Messungen mitteln und die Standardabweichung berechnen. Die verdünnten Proben von freiem und partikelgebundenem SD F1-alpha in Laly-Probenpuffer bei 100 Grad Celsius 10 Minuten lang erhitzen. Während des 10-minütigen Erhitzens die Proben zweimal verwirbeln, um die Partikel nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur für zwei Minuten vollständig zu lösen; danach bei 10.000 G 0,5 bis eine Minute zentrifugieren, um das kondensierte Wasser abzutrennen, und erneut verwirbeln, um gut zu mischen.An diesem Punkt sollte die Probelösung klar sein, ohne sichtbaren Niederschlag. Danach 10 µL Probe pro Vertiefung auf ein 4–20 %iges SDS-Polyacrylamidgel (SDS-Gel) auftragen. Die Elektrophorese 20 Minuten lang bei 200 Volt durchführen, bevor das Gel mit Kumasischem Blau-Proteinfärbemittel angefärbt wird.Untersuchen Sie die Proteinbandendichte von SD F1 alpha mithilfe eines molekularen Bildgebungssystems und einer Dichtometrie-Analyse-Software. Berechnen Sie die Menge an S DF one alpha in den Partikeln anhand einer Standardkurve, die mit freien SDF one alpha-Standards erstellt wurde, um den In-vitro-Freisetzungsassay durchzuführen. Mischen Sie die SD F1 alpha-Glykan-Partikel mit Docos-Phosphat-Puffer-Salzlösung ohne Calcium und Magnesium oder DPBS im Verhältnis 1:1. Teilen Sie die Partikelsuspension in Aliquots von 0,05 Milliliter in 1,5-Milliliter-Röhrchen auf.Die Proben bis zum Boden der Röhrchen abfüllen. Dabei vermeiden, dass Luftblasen entstehen oder die Flüssigkeitsoberfläche gestört wird. Die Röhrchen mit Parafilm verschließen.Danach die Röhrchen 37 Grad Celsius auf einem rotierenden Mikroröhrchen-Mixer drehen. Entnehmen Sie Aliquote zu den vorgesehenen Zeitpunkten aus den Röhrchen und zentrifugieren Sie die Proben unverzüglich nach der Zentrifugation 10 Minuten bei 16.000 G bei vier Grad Celsius. Trennen Sie die Überstände und Pellets.Anschließend das Pellet mit 0,05 Milliliter DPBS resuspendieren. Nachdem alle Proben gesammelt wurden, werden die Überstände und Pellets auf einem SDS-Gel analysiert. Wie zuvor misst dieser Assay die chemotaktische Aktivität von S df.Eine Alpha-Interaktion von S df ein Alpha mit seinem Rezeptor verursacht die Migration der Zelle in Richtung des SD F1-Alpha-Gradienten. Verdünnen Sie zunächst die freie oder partikelgebundene Form von SD F1 Alpha mit Migrationspuffer in einer dreifachen seriellen Verdünnung auf die im Textprotokoll aufgeführten Endkonzentrationen. Geben Sie 0,6 Milliliter der verdünnten SD F1-Alpha-Lösung in eine Vertiefung der 24-Loch-Platte für die negative Kontrolle.Führen Sie dasselbe für das Migrationspuffer durch, fügen Sie anschließend jedoch 0,57 Milliliter Migrationspuffer in ein Loch für die Eingangszellenkontrolle hinzu. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Danach stellen Sie eine durchlässige Zellkultur-Einlage, wie beispielsweise einen Transwell, auf die untere Kammer und geben 0,1 Milliliter Jerk-Hat-Zellen in die Transwell-Einlage.Anschießend 0,03 Milliliter Zellen direkt in die Eingangszellensteuerung geben. Die Platte zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einem 5 % Kohlendioxid-Inkubator inkubieren. Nach der Inkubation die Zellkultur-Einlagen entfernen.Überführen Sie die Zellen, die in die unteren Wells migriert sind, in ein vier Milliliter fassendes Polystyrolröhrchen. Zählen Sie die migrierten Zellen mit einem Durchflusszytometer. Berechnen Sie abschließend die Migration als Prozentsatz der eingesetzten Zellzahl nach Abzug der Werte der negativen Kontrollen.Hier gezeigt ist die Analyse der Partikelgrößenmessung von SD F1 alpha Dextran Sulfat Ozan. Das CUMUL-Ergebnis zeigt einen hydrodynamischen Durchmesser der Partikel von 671 Nanometern und eine Polydispersität von 0,24. Dieser Screenshot zeigt eine der fünf wiederholten Messungen des Zetapotentials der SD F1 alpha DExT-Strand-Sulfat-Ozan-Partikel.Das Zeta-Potential beträgt minus 24,7 Millivolt. Die Menge an S df1 alpha in den S df1 alpha-Dextran sulfat-Ozan-Partikeln wird mittels SDS-Gelelektrophorese bestimmt. Gezeigt ist hier ein kumasi-gefärbtes SDS-Gel mit geladenen Proben von SD F1 alpha-Standards, Dextran sulfat-Kaizan-Kontrollnanopartikeln und SD F1 alpha-Dextran sulfat-Kaizan-Nanopartikeln.Eine Standardkurve wird aus der Dichteanalyse der SD F1 Alpha-Standard-Banden erstellt. Die Berechnung aus der Standardkurve zeigt an, dass die S DF one alpha-Konzentration in der SDF one alpha-Nanopartikelprobe 0,03 Milligramm pro Milliliter beträgt. Um die in-vitro-Freisetzungsrate von S DF one alpha aus den Nanopartikeln zu bestimmen, wurde die Menge an freigesetztem S DF one alpha im Überstand und die Menge an partikelgebundenem sdf one alpha im Pellet durch Kumasi-Färbung eines SDS-Gels gefolgt von einer Zytometrie-Analyse bestimmt. Die Aktivität des partikelgebundenen S DF one alpha wird mittels eines Migrationsassays gemessen und mit der von freiem SDF one alpha verglichen, wie hier dargestellt.Die partikelgebundene SDF-1α verursachte in allen gemessenen Konzentrationen den gleichen Migrationsgrad wie die freie SDF-1α. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Formulierung der Glykan-Protein-Partikel verändert werden kann. Je nach spezifischer Anwendung können andere Proteine eingebaut und unterschiedliche Formulierungen verwendet werden, um die Partikelgröße zu variieren.Wir hoffen, dass in diesem Video die grundlegenden Techniken zur Vorbereitung der Gewinnung von Nanopartikeln sowie zur funktionellen Analyse des eingebauten SDF-1α veranschaulicht wurden.

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Forschung

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Chemistry

Chemie

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