Laser Mikrodissektion - Eine Demonstration der Isolation der einzelnen Dopamin-Neuronen und die gesamte ventrale Tegmentum

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Dopamin-Neuronen aus Gewebeschnitten auf Objektträgern zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst gefrorenes ventrales Mesencephalon-Gewebe entweder auf stilisierte Objektträger oder auf Stiftmembran-Objektträger geschnitten wird. Als nächstes werden Dopamin-Neuronen mit einer schnellen fluoreszierenden Immunhistochemie markiert.

Dann wird das Gewebe dehydriert und in das Laser-Capture-Mikroskop geladen. Dann werden die markierten Dopamin-Neuronen mit dem Infrarotlaser an die LCM-Kappe angehängt und die RNA oder das Molekül von Interesse isoliert. Die Ergebnisse zeigen, dass RNA in ausreichender Menge und Qualität für quantitative PCR-Messungen mittels Laser-Capture-Mikroskopie gewonnen werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. groben Dissektionen oder Mikrostanzen, besteht darin, dass einzelne Zellpopulationen isolierte oder sehr diskrete Gehirnregionen sein können. Zur Vorbereitung der RNA-Isolierung tauchen Sie entweder Seline-Präparate oder Polyethylen-Methylat- oder Pen-Membranglas-Objektträger in eine Dekontaminationslösung und waschen Sie sie mit RNAs freiem Wasser dreimal mit einer abgestuften Reihe von RNAs, mit freiem Ethanol, dehydrieren Sie die Objektträger und trocknen Sie sie 30 Minuten lang mit einem Kryostaten vakuumtrocknen, schneiden Sie Gewebeschnitte mit einer Dicke von 10 Mikrometern und montieren Sie sie auf die vorbereiteten RNAs. Freie Objektträger halten die Proben während des Schneidens eingefroren, um die RNA-Qualität zu erhalten.

Als nächstes zur Durchführung der Immunhistochemie. Verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um das Gewebe zu umranden, und lassen Sie es dann in einer Eins-zu-Eins-Aceton-Methanol-Lösung trocknen. Fixieren Sie das Gewebe 10 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius. Nachdem Sie das Gewebe aus dem Gefrierschrank genommen haben, bedecken Sie die Schnitte 10 bis 10 Minuten lang mit 100 bis 200 Mikrolitern Tyrosinhydroxylase-Antikörper NPBS und 1%Tritton.

Verwenden Sie dann PBS mit 1%tritton, um die Objektträger zu spülen, bevor Sie die Abschnitte mit 100 bis 200 Mikrolitern Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG abdecken, das mit Alexa Fluor 4 88 markiert ist, fünf Minuten lang inkubieren und dann PBS verwenden, um die Objektträger zweimal zu spülen. Dehydrieren Sie anschließend die in die Proben integrierte Reihe von RNAs mit freiem Ethanol für jeweils 30 Sekunden, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Eine Minute und eine Sekunde in Xylol inkubieren, fünf Minuten waschen.

Entfernen Sie die Objektträger unmittelbar vor der Verwendung für LCM und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Nachdem Sie die LCM-Kappen und die Objektträger geladen und das LCM-System gemäß dem Textprotokoll eingerichtet haben, stellen Sie die IR-Lasererfassung ein und richten Sie sie auf Stärke. Platzieren Sie die Kappe in einem Bereich des Objektträgers, der vom Gewebe auf der Capture-Laser-Symbolleiste entfernt ist.

Wählen Sie Aktivieren, passen Sie den Leistungsimpuls und die Anzahl der Treffer des Lasers an. Zünden Sie den IR-Laser ab, wenn sich die Kappe über einem Teil des Objektträgers ohne Gewebe befindet, und prüfen Sie, ob der Laser die LCM-Kappenmembran ausreichend schmilzt. Nachdem Sie die Intensität des IR-Lasers angepasst haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie den Capture-Laser aus, um den Laser so zu richten, dass er LCM an einzelnen Dopamin-Neuronen von Cline-Vorbereitungsobjektträgern durchführt.

Beginnen Sie damit, sich in den interessierenden Bereich zu begeben, um die Zellen einzufangen und einzelne Zellen von einer Cline-Vorbereitungsseite zu erfassen. Wählen Sie in der Symbolleiste der Mikrodissektion die Registerkarte LCM und dann das Einzelpunktsymbol aus. Verwenden Sie anschließend in der Symbolleiste des Mikroskops die Registerkarte Verschluss, um zwischen Fluoreszenz und Hellfeld zu wechseln, wobei die Registerkarten Fluoreszenzfilter die entsprechenden Filter auswählen, und verwenden Sie die Registerkarten Objektive, um die Vergrößerung zu ändern.

Sobald die interessierenden Zellen im Live-Videofenster sichtbar sind, passen Sie die Punktgröße, die zum Markieren der interessierenden Zellen verwendet wird, an die ungefähre Größe der Zellen an. Markieren Sie die gewünschten Zellen, indem Sie das Symbol für einen einzelnen Punkt auswählen und dann auf die Zellen klicken. Sobald die Zellen in der Mikrodissektions-Symbolleiste markiert sind, wählen Sie die Registerkarte "Ausschneiden und Erfassen" und der IR-Laser feuert automatisch auf alle markierten Zellen.

Bewegen Sie die Kappe vom Schnitt weg und auf einen offenen Bereich des Objektträgers, um zu überprüfen, ob die Zellen auf der LCM-Kappe erfasst sind. Wenn Sie mit der Entnahme von Gewebe fertig sind, bewegen Sie die Kappe, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Kappe klicken und Verschieben nach und dann Entladen auswählen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie den für die Immunhistochemie verarbeiteten Objektträger als Leitfaden, um den interessierenden Bereich aus dem Gewebe auf der Stiftmembran auszuwählen. Wählen Sie in der Symbolleiste für die Mikrodissektion die Registerkarte "Ausschneiden und Erfassen" aus, wählen Sie dann die Registerkarte "Schnittlinie" aus und skizzieren Sie mit der mit Immunhistochemie beschrifteten Folie als Leitfaden den interessierenden Bereich unter dem 10-fach-Ziel.

Testen, abfeuern und zielen Sie mit den IR- und UV-Lasern, wie bereits gezeigt. Wählen Sie in diesem Video in der Symbolleiste für Mikrodissektion die Registerkarte "Go Capture and Cut" aus. Ziehen Sie dann die LCM-Kappe vom Gewebe ab, um festzustellen, ob das Gewebe aus dem Schnitt entfernt und an der Kappe befestigt wurde.

Wenn Sie mit der Entnahme von Gewebe fertig sind, um die Kappe zu entfernen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Kappe und wählen Sie Verschieben, um dann die Mikroskopbilder in diesen Abbildungen zu entladen. Die folgenden Bilder zeigen, dass LCM in der Lage ist, einzelne immunreaktive Dopamin-Neuronen mit dem IR-Laser oder den IR- und UV-Lasern zu isolieren, da die häufigste Verwendung von Zellen in Geweben, die mit LCM isoliert wurden, die RNA-Analyse ist. Die vorgestellten Verfahren wurden optimiert, um die RNA-Integrität zu erhalten, was sich in einer relativen Verringerung der Höhe des RRNA 28 S-Peaks im Vergleich zum 18 S-Peak zeigt, dass die RNA-Qualität in LCM-Proben mit geringerer Integrität nach Immunhistochemie reduziert war, gefolgt von einer Aceton-Fixierung im Vergleich zur gesamten Gehirn-RNA. Um die Menge an RNA zu messen, die aus Neuronen gewonnen wurde, die über L-C-M-R-N-A aus Dopamin-Neuronen aus dem ventralen blaugrünen Bereich von Kochsalzpräparaten gewonnen wurden, wurden Objektträger basierend auf der Standardkurve isoliert, die insgesamt 17,3, 24,8 und 50,9 Pikogramm pro Mikroliter aus 5, 100 bzw. 200 Dopamin-Neuronen isoliert wurden.

E Unter Verwendung von QPCR zur Messung der RNA-Qualität wurde ein Bereich von Konzentrationen von RNA des gesamten Gehirns und RNA von den Dopamin-Neuronen umgekehrt transkribiert und das Beta-Aktin-Gen gemessen. Aus diesen Messungen wurden Konzentrationen von drei Punkt 55, 6 0,82 und 20 Punkt 58 Pikogramm pro Mikroliter von 5, 100 bzw. 200 Dopamin-Neuronen berechnet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Laser-Capture-Mikroskop verwenden, um einzelne Dopamin-Neuronen oder Regionen von Dopamin-Neuronen zu isolieren.