Name: Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Polyacrylamidgelen für Invadopodia- und Traction-Force-Assays bei Krebszellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung invasiver Eigenschaften und Zellkontraktilität in Abhängigkeit von Matrixsteifigkeit.

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1. Herstellung der Glasdeckgläser für PAAs <ol><li> Reinigen 12 mm Deckgläser mit fusselarm Tücher. </li><li> Flamme die 12 mm Deckgläser und der 14 mm Deckglas in der Mikrowell jedes 35 mm Glasbodenschale, indem sie durch einen Bunsenbrenner mit einer Pinzette. </li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen mit 200 ul 0,1 N NaOH für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Absaugen und Luft trocknen Sie die Vertiefungen 30 Minuten. </li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen, die mit 50 bis 100 &amp; mgr; l 3-Aminopropyltrimethoxysilan für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Abzug. Diese Chemikalie reagiert mit Kunststoff; daher verwenden Glaspipetten und nicht die Vertiefungen füllen vollständig den Kontakt mit der Schale aus Kunststoff zu vermeiden. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen, die mit hochreinem Wasser für etwa 10 Minuten, bis der 3-Aminopropyltrimethoxysilan deutlich. </li><li> Spülen Sie die Vertiefungen, die mit hochreinem Wasser zweimal mit einer Spritzflasche. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml Reinstwasser eint Raumtemperatur auf einem Schüttler bei einer mittleren Geschwindigkeit (~ 1 Hz) für 10 Minuten gesetzt. </li><li> Absaugen und Luft trocknen Sie die Vertiefungen 30 Minuten. </li><li> Behandeln die Vertiefungen mit 2 ml 0,5% ige Glutaraldehyd-Lösung bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei einer mittleren Geschwindigkeit (~ 1 Hz) für 30 Minuten gesetzt. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml hochreinem Wasser bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei mittlerer Geschwindigkeit (~ 1 Hz) für 10 Minuten eingestellt. Wiederholen zwei weitere Male für insgesamt 30 min. </li><li> Trocken Vertiefungen in einem steilen Winkel (60º oder mehr) für 30 min. Hinweis: Geschirr kann für 2 Monate in einem Exsikkator aufbewahrt werden. </li></ol> 2. Herstellung von PAA für Invadopodia Assays <ol><li> Für eine 1-ml-Lösung des weichen PAA (8% Acrylamid und 0,05% BIS), vereinige 200 ul 40% Acrylamid, 25 ul 2% BIS, und 574 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 1). </li><li> Für eine 1-ml-Lösung von der Fest PAA (8% Acrylamid und 0,35% BIS), vereinige 200 ul 40% iges Acrylamid, 175 &amp; #181; l von 2% BIS, und 409 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 1). </li><li> Für eine 1-ml-Lösung des starren PAA (12% Acrylamid und 0,60% BIS), vereinige 300 ul 40% iges Acrylamid, 300 ul 2% BIS, und 169 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 1). </li><li> Entgasen Sie die Lösungen für 15 Minuten. Geben Sie 200, 215, und 230 ul 1 mg / ml Humanplasmafibronektin in ultrareinem Wasser zu den weichen, harten und starren PAA-Lösungen auf. Bei allen Lösungen, fügen 1 ul 10 mg / ml Acrylsäure-N-Hydroxysuccinimid (NHS) -Ester, 5 ul einer 100 mg / ml Ammoniumpersulfat und 2 ul N, N, N &#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamin (TEMED ; Tabelle 1). Mischen Sie mit sanften Pipettieren und vermeiden, Blasen in Lösungen. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Ul) </td><td> 2% (Ul) </td><td> Ultrapure Wasser (Ul) </td><td> 1 mg / ml FN (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ul) </td><td> TEMED (Ul) </td><td> Elastisch Modul (Pa) </td></tr><tr><td> Weich </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 574 </td><td> 200 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Schwer </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 409 </td><td> 215 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Starr </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 169 </td><td> 230 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22.692 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Bestandteil volumes und resultierende Elastizitätsmoduli für weiche, harte und starre PAAs im invadopodia Assays verwendet. AA = Acrylamid, FN = Fibronectin, APS = Ammoniumpersulfat. <ol start="5"><li> Pipettieren Sie 8,48 ul des PAA-Lösung auf dem Zentrum von jeder Vertiefung. Hinweis: Dieses Volumen theoretisch ergibt eine PAA von 75 um in der Dicke. </li><li> Senken Sie den geflammten Seite der 12 mm Deckglas auf die Tröpfchen im Mikrotiterplatten mit einer Pinzette. </li><li> Zulassen des sandwich PAA Lösung für 15-30 min zu polymerisieren. Stellen Sie sicher, Polymerisation, indem Sie das übrig gebliebene Lösung. </li><li> 2 ml 1x PBS zu jeder Schale und entfernen Sie die 12 mm Deckgläser mit einer Pinzette. Anmerkung: 10x PBS wird im Labor hergestellt und 0,011 M KH 2 PO 4, 1,54 M NaCl und 0,056 M Na 2 HPO 4 zusammensetzt. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml 1x PBS bei Raumtemperatur für 5 min. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li></ol> 3. PReparatur von PAA für Traction Force-Assays <ol><li> Für eine 1-ml-Lösung des weichen PAA (8% Acrylamid und 0,05% BIS), vereinige 200 ul 40% Acrylamid, 25 ul 2% BIS, und 566 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 2). </li><li> Für eine 1-ml-Lösung von der Fest PAA (8% Acrylamid und 0,35% BIS), vereinige 200 ul 40% iges Acrylamid, 175 ul 2% BIS, und 401 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 2). </li><li> Für eine 1-ml-Lösung des starren PAA (12% Acrylamid und 0,60% BIS), vereinige 300 ul 40% iges Acrylamid, 300 ul 2% BIS, und 161 &amp; mgr; l ultrareinem Wasser (Tabelle 2). </li><li> Entgasen Sie die Lösungen für 15 Minuten. Nach Zugabe von 200, 215, und 230 ul 1 mg / ml menschliches Plasma-Fibronektin zu den weichen, harten und starren PES-Lösungen sind. Mit Ultraschall 8 ul von 200 nm rot fluoreszierende Mikrosphären (Anregung / Emission von 580/605 nm) für 30 Sekunden. Für jede Lösung werden 8 ul von 200 nm rot fluoreszierende Mikrosphären,1 ul 10 mg / ml Acrylsäure-NHS-Ester, 5 ul einer 100 mg / ml Ammoniumpersulfat und 2 ul TEMED (Tabelle 2). Mischen Sie mit sanften Pipettieren und vermeiden, Blasen in Lösungen. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Ul) </td><td> 2% BIS (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> Ultrapure Wasser (Ul) </td><td> 1 mg / ml FN (Ul) </td><td> Mikrosphären (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ul) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ul) </td><td> TEMED (Ul) </td><td> Elastisch Modul (Pa) </td></tr><tr><td> Weich </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 566 </td><td> 200 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Schwer </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 401 </td><td> 215 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Starr </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 161 </td><td> 230 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22.692 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Ingredient und resultierend Elastizitätsmoduli für weiche, harte und starre PAAs der Zugkraft Assays verwendet AA = Acrylamid, FN = Fibronectin, APS = Ammoniumpersulfat. <ol start="5"><li> Pipettieren Sie 8,48 ul des PAA-Lösung auf dem Zentrum von jeder Vertiefung. Hinweis: Dieses Volumen theoretisch ergibt eine PAA von 75 um in der Dicke. </li><li> Senken Sie den geflammten Seite th GentlyE 12 mm Deckglas auf die Tröpfchen im Mikrowell mit einer Pinzette. </li><li> Zulassen des sandwich PAA Lösung für 15-30 min zu polymerisieren. Stellen Sie sicher, Polymerisation, indem übriggebliebene Lösung. </li><li> 2 ml 1x PBS zu jeder Schale und entfernen Sie die 12 mm Deckgläser mit einer Pinzette. </li><li> Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml 1x PBS bei Raumtemperatur für 5 min. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li></ol> 4. Herstellung von ECM für Invadopodia Assays <ol><li> Erhitze das Gelatine-Lösung (1% Gelatine und 1% Saccharose) auf 37 ° C. </li><li> Behandeln Sie die PAA mit 150 ul der Gelatine-Lösung für 1 min vorsichtig absaugen vom Boden der Mikrovertiefungen beim Halten der Glasboden Gerichte zu einem Winkel von 45 °. </li><li> Man trocknet die verbleibende dünne Gelatineschicht auf die PAA in die Vertiefungen in einem steilen Winkel (60 ° oder mehr), um das Trocknen für 60 min zu optimieren. </li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer gekühlten 0,5% Glutaraldehyd-Lösung auf ice für 15 Minuten, gefolgt von Raumtemperatur für 30 min. </li><li> 5 min Waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer 1 × PBS. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer Natriumborhydrid-Lösung für 1 min. Klopfen Sie leicht Gerichte auf der Bank, um Blasen, die an der Oberfläche der Gelatine bilden zu entfernen. </li><li> Aspirieren und waschen Sie die Vertiefungen mit 2 ml einer 1 × PBS für 5 min. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li><li> Verdünne eines FITC-markierten Humanplasmafibronektin Lösung auf 50 ug / ml mit einer 1 × PBS und Zentrifugation bei 175.000 × g bei 4 ° C für 15 min. Entweder kaufen kommerziell erhältlichen markierten Fibronektin oder beschriften Sie sie wie folgt: <ol><li> Man löst 5 mg Fibronektin werden in 10 ml Boratpuffer (170 mM Natriummetaborattetrahydrat und 40 mM NaCl) und in einen Dialyseschlauch. </li><li> Etikett der Fibronektin durch das Schlauchsystem in 200 ml Boratpuffer, enthaltend 6 mg gelöstes FITC bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührerbei der niedrigsten Einstellung 1,5 Stunden in der Dunkelheit eingestellt. </li><li> Dialyse mit 500 ml einer 1 × PBS auf einem Magnetrührer bei der niedrigsten Einstellung für 3 Tage in einem dunklen kalten Raum (4 ° C) mit zwei Lautstärke ändert sich täglich. </li><li> Berechnen FITC-markiertem Fibronektin-Konzentration basierend auf der optischen Dichte des verdünnten Aliquots (1: 200) bei 280 nm und 493 nm als [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4-fache der Verdünnungsfaktor von 200 mal 2 (welche Konten für die Glycerin Konzentrieren des Fibronektin im nächsten Schritt), wodurch mg / ml-Einheiten. </li><li> Dialyse über Nacht in einer 50% Glycerin-Lösung auf einem Magnetrührer bei der niedrigsten Einstellung über Nacht in einer dunklen kalten Raum bei 4 ° C eingestellt.) </li></ol></li><li> Behandeln Sie die Vertiefungen mit 150 ul des FITC-markiertem Fibronektin-Lösung bei Raumtemperatur für 60 min im Dunkeln. </li><li> Sorgfältig absaugen FITC-markiertem Fibronektin-Lösung aus dem Boden der Mikrovertiefungen beim Halten der Glasboden Gerichteein Winkel von 45 ° und dann füllen die Glasbodenschalen mit 70% Ethanol-Lösung bei Raumtemperatur für 10 Minuten in einer dunklen Zelle Kultur Haube für die Sterilisierung. Außerdem füllen Glasbodenschale Deckel oder wischen Sie mit fusselarm Tücher in 70% Ethanol eingeweicht. </li><li> Waschen Glasbodenschalen, indem sie mit 1x PBS für 5 min. Wiederholen noch zweimal mit 2 ml 1x PBS für insgesamt 15 min. </li></ol> 5. Vorbereitung und Imaging von Invadopodia Assays <ol><li> Hinzufügen 25.000 Krebszellen in 2 ml invadopodia Medium (1: 1 DMEM und RPMI 1640 mit 5% proteinarme Serum, 10% fetales Rinderserum und 20 ng / ml frisch zugegeben epidermaler Wachstumsfaktor), um die Glasboden Geschirr und beimpft und über Nacht. </li><li> Absaugen und behandeln die Vertiefungen, die mit 2 ml einer 3,7% Paraformaldehydlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 20 Minuten, um die Zellen zu fixieren. </li><li> Nach zwei schnellen Waschungen mit 2 ml 1x PBS, behandeln die Vertiefungen, die mit 2 ml einer 0,1% Triton X-100-Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 5 min, um die Zellen zu permeabilisieren. </li><li> Nach einem Schnellwäsche mit 2 ml 1x PBS, behandeln die Vertiefungen, die mit 3% Rinderserumalbumin blockiert Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 60 Minuten, um die Zellen zu blockieren. </li><li> In Blockierungslösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 60 min: die Vertiefungen mit 150 ul Maus-Anti-Cortactin Antikörper (750 1) zu inkubieren. </li><li> Mit 2 ml 1x PBS 5 min waschen Vertiefungen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li><li> Inkubieren der Vertiefungen mit 150 ul Ziegen-Anti-Maus-633-Antikörper (1: 500) und 546 Phalloidin (1: 750) in der Blockierungslösung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 60 min. </li><li> Mit 2 ml 1x PBS 5 min waschen Vertiefungen. Diesen Vorgang zweimal wiederholen für insgesamt 15 min. </li><li> Fügen Sie sechs Tropfen Eindeckmedium zu jeder Vertiefung zu füllen und decken mit 22 x 22 Deckgläser. </li><li> Bild Cortactin und Aktin zu invadopodia identifizieren mit Anregungs- und Emissionsfilter von 632/647 nm und556/570 nm, mit einem hohen NA, 40X Ölimmersionslinse auf einem Weitwinkel-inversen Mikroskop. Ebenso Bild Fibronektin zu ECM Abbau identifizieren mit einer Anregungs- und Emissionsfilter von 492/518 nm. </li></ol> 6. Vorbereitung und Imaging von Traction Force-Assays <ol><li> In 15.000 Krebszellen in 2 ml invadopodia Medium zu den Glasboden Speisen und Inkubation über Nacht. </li><li> Absaugen Medium in den Glasboden Speisen und ersetzen mit 2 ml L-15-Medium, mit den gleichen Ergänzungsmittel (5% Low-Protein-Serum, das 10% fötales Rinderserum und 20 ng / ml frisch hinzugefügt epidermaler Wachstumsfaktor), vorge -warmed bis 37 ° C. </li><li> Die Glasbodenschalen in einer Umgebungskammer inkubieren auf einem umgekehrten Mikroskop auf 37ºC voräquilibriert mit hoher Luftfeuchtigkeit für 1 Stunde. </li><li> Nehmen Sie vier Sätze von Bildern mit einem hohen NA, 40X-Objektiv auf einem Weitwinkel-inverses Mikroskop mit einem automatisierten Bühne, um zelluläre Positionen zu markieren: <ol><li> Bildzellen aufp der PAA mit Phasenkontrast (&quot;Phase&quot; Bild). </li><li> Bild fluoreszierenden Mikrokügelchen mit Anregungs- und Emissionsfiltern von 560/645 nm durch Fokussieren leicht unter den Zellen, bis die erste Schicht aus Mikrosphären an der Oberseite der PAAs scharf eingestellt ist (&quot;gestresst&quot; image). </li><li> Außerdem konzentrieren sich auf den Boden der PAAs (unter Verwendung der Mikrokugeln als Marker), und nehmen ein Bild (&quot;bottom&quot; image). Anmerkung: Der Zweck dieses Bild wird auf den z-Position, um den tatsächlichen PAA Dicke an jeder Position für Zugkraft Berechnungen wie im Repräsentative Ergebnisse beschrieben erhalten aufzuzeichnen. </li><li> Nachdem diese Bilder an mehreren Positionen erworben worden, vorsichtig mischen in 220 ul 10% Triton-X-Lösung zur Entfernung der Zellen. Bildmikrokugeln an der Oberseite des PAA an jeder Position, wie zuvor beschrieben (&quot;null&quot; image). </li></ol></li></ol>

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Diese Arbeit wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl K25CA143412 (Parekh) unterstützt. Wir möchten Sie erkennen an, dass zusätzliche Unterstützung wurde von der Abteilung für HNO-Heilkunde zur Verfügung gestellt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Wir stellen ein Verfahren zum Herstellen PAAs, die als Grundlage für invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden kann, invasiv und kontraktilen zelluläre Verhalten korrelieren. Während PAAs seit langem verwendet, um an Steifigkeit Wirkungen auf Zellen und berechnet die Zugkräfte 18,24,27 ist dieses Protokoll das erste parallele Assays, die auf PAAs mit den gleichen Steifigkeiten zu entwickeln, die das Vordringen kontraktilen Zellverhalten in Reaktion auf Matrix korrelieren mechanische Eigenschaften. Rich...

Die Steifigkeit des Tumor-assoziierten ECM wurde als wichtiger Faktor bei der Fahrt malignem Verhalten durch Erhöhung Actomyosin Kontraktilität 1-3 identifiziert. Obwohl dieser Effekt hauptsächlich bei Brustkrebszellen gezeigt hat Matrixsteifigkeit wurde gefunden invasiven Eigenschaften von Zellen, die aus einer Vielzahl von Krebs 4-8 darauf hindeutet, dass Tumor Steifigkeit kann in anderen Arten von Krebs eine Rolle spielen abgeleitet verändern. Vernetzte Geweben während invasiver Migration dringen, Krebszellen zu verwenden Aktin reiche Klebstoff Vorsprünge als invadopodia die Proteinasen zu lokalisieren, um die ECM 9 fokal verschlechtern bekannt. Invadopodia werden als ein Markenzeichen der invasiven Zellen und in Tumorzellinvasion und Metastasierung 10,11 in Verbindung gebracht. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Matrix Steifigkeit invadopodia Zahlen zu regulieren und die damit verbundenen Abbau ECM 4,12 durch Myosin II-Aktivität und mechanosensitive Proteine ​​12. Angesichts derKorrelation zwischen Tumordichte und Krebs Aggressivität 13,14 legen diese Ergebnisse einen Mechanismus, durch den Krebszellen um starre Tumorgeweben zu antworten Invasion und Metastasierung durch Actomyosin Kontraktilität fahren. In vitro ECM Steifigkeit und in vivo Gewebedichte wurde gezeigt, dass invasive Verhalten von Krebszellen 1,15-17 regulieren. Während Actomyosin Kontraktilität scheint wichtig zu sein in diesem Prozess, aktuelle Studien Konflikt, ob metastasiertem Fähigkeit korreliert erhöht oder verringert Kontraktionskräfte 6,18-20. Darüber hinaus bleibt es unbekannt, ob diese Kräfte direkt vermitteln invadopodia Aktivität 21. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass Krebszellen Kontraktionskräfte waren abhängig von Matrix Steifigkeit und waren prädiktiv für ECM Abbau durch invadopodia 5. Diese Ergebnisse legen nahe, dass zelluläre Kräfte können eine wichtige Rolle bei der Tumorprogression durch Vermittlung invadopodia ac spielenvität als Reaktion auf die mechanischen Eigenschaften der Tumor-Mikroumgebung. Um invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen 5 korrelieren, modifizierten wir ein Protokoll für die Erstellung von PAA mit unterschiedlichen Steifigkeiten, die früher verwendet wurde, um die Steifigkeit abhängige invadopodia Aktivität 4,12,22 zu untersuchen. Durch chemisch vernetzenden Humanplasmafibronektin gesamten PAAs können diese modifizierten Hydrogele als Grundlage sowohl für invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, um sicherzustellen, dass Zellen erfahren die gleichen Steifigkeiten in beiden Experimenten 5. In den invadopodia Tests bietet das Fibronektin eine natürliche Bindungsdomäne für Gelatine, die überlagerte ECM an die PAA verlinken auf Matrixabbau zu erkennen. In der Zugkraft Tests bietet das Fibronektin einen Liganden für direkte zelluläre Adhäsion an Mikrosphären Verschiebungen verwendet werden, um zelluläre Zugkräfte berechnen zu erkennen. Dieses Verfahren führt zu, was wir weich, hart genannt,und starre PAA, die auf Glasboden Gerichte gebunden sind und Elastizitätsmodul, E, der 1023, 7307 und 22.692 Pa 5, die den Bereich der mechanischen Eigenschaften für den normalen und Krebsgewebe 23 berichtet erstrecken.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyltrimethoxysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid (40%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Acrylsäure NHS-Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>frisch im Abzug zubereiten 10 mg/ml in DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A22283</td><td>kann auch Rhodamin</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Bio-Rad verwenden</td><td>161-0700</td><td>frische 10%ige Lösung in 1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606</td><td>mit 6 Tropfen in Mikrovertiefungen</td></tr><tr><td>BIS (2%) füllenBio-Rad</td><td></td> <td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td>3% für die Blocklösung in 1x PBS herstellen und in 4 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Deckgläser (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschlauch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>Pre-Equilibrat in Boratpuffer für 15 - 30 min</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Verwendung zur Herstellung von Invadopodien Medium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Verwendung zur Herstellung von Acrylsäure NHS-Esterlösung</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Leben Technologien</td><td>PHG0311</td><td>zur Herstellung von Invadopodien-Medium</td></tr><tr><td>verwendet werden, Ethanol</td>, <td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td>, <td>verdünnt mit Reinstwasser auf 70 %</td></tr><tr><td>FBS</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td>, <td>Verwendung zur Herstellung von Invadopodien-Medium</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td>, <td>Schutz vor Licht</td></tr>, <tr><td>Gelatine</td><td>Polysciences</td><td>00639</td><td>stellen Sie in der Regel 10 ml 1%ige Saccharose/1%ige Gelatinelösung in PBS her und lagern Sie sie bei 4 μGrad; C (PBS vorheizen, um Gelatine leicht aufzulösen)</td></tr><tr><td>Glasbodenschalen (35 mm Deckgläser)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Deckgläser sind unbeschichtet</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (25%)</td><td>Polysciences</td><td>01909</td><td>verdünnen mit 1x PBS auf 0,5</td></tr>%<tr><td>Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 633 Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches Plasmafibronektin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>5 ml Reinstwasser hinzufügen, um 1 mg/ml herzustellen; aliquot in Volumina basierend auf der Verwendung, um übermäßige Einfrier- und Auftauzyklen zu vermeiden</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>zur Herstellung von 10x PBS-Material</td></tr> verwenden <tr><td>Maus Anti-Cortactin 4F11 Antikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>zur Herstellung von 10x PBS-Material</td></tr> verwenden<tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>zur Herstellung von 10x PBS Stamm und Boratpuffer</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>verdünnt mit Reinstwasser auf 0,1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (proteinarmes Serum)</td><td>BD Biosciences</td><td>355500</td><td>zur Herstellung von Invadopodien Medium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Acros</td><td>416785000</td><td>Stellen Sie in der Regel 10 % Vorrat in 1x PBS her, bereiten Sie ihn im Abzug vor und fügen Sie einige ml starkes NaOH hinzu, um Paraformaldehyd leicht aufzulösen, und bringen Sie ihn dann mit starkem HCl wieder auf pH 7,4 zurück)</td></tr><tr><td>PBS (steril)Cellgro</td> <td>21-040-CV</td><td>Verwendung für Zellkulturen</td><td></td></tr> <tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Verwendung zur Herstellung von Invadopodien Medium</td></tr><tr><td>Natriumborhydrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>Zubereitung frisch im Abzug 1 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>Natriummetaborat-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0251</td><td>zur Herstellung von Boratpuffer</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>verwenden, typischerweise 10 ml 1% Saccharose/1% Gelatinelösung in PBS herstellen und bei 4 & Grad lagern; C (PBS vorheizen, um Gelatine leicht aufzulösen)</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td>10% Stamm in 1x PBS herstellen und so wie es ist für die Zellentfernung im Zugkraftassay verwenden oder mit 1x PBS zum Färben verdünnen</td></tr></tbody></table>

polyacrylamidgelen für invadopodia und traction force-assays auf krebszellen

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Starre Tumorgewebe sind stark bei der Regulierung der Krebszelle Migration und Invasion verwickelt. Invasive Migration durch vernetzte Gewebe durch actin reichen Vorsprünge genannt invadopodia die proteolytisch die extrazelluläre Matrix (ECM) abzubauen erleichtert. Invadopodia Aktivität hat sich gezeigt, abhängig von ECM Steifigkeit und Krebszellenkontraktionskräfte darauf hindeutet, dass die Steifigkeit Signale können diese subzellulärer Strukturen durch Actomyosin Kontraktilität zu regeln sein. Invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in vitro mit invadopodia und Zugkraft-Assays auf Basis von Polyacrylamid-Gelen (PAAs) unterschiedlicher Steifigkeiten korreliert werden. Invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in vitro mit invadopodia und Zugkraft-Assays auf Basis von Polyacrylamid-Gelen (PAAs) unterschiedlicher Steifigkeiten korreliert werden. Während einige Unterschiede zwischen den beiden Tests bestehen, die hier vorgestellte Protokoll liefert ein Verfahren für die Erstellung PAAs thbei in beiden Tests verwendet werden und sind leicht an die spezifischen biologischen und technischen Anforderungen des Benutzers.

Im invadopodia Assay werden invadopodia typischerweise durch Colokalisierung von Markern wie Actin und Cortactin bei punktförmigen Strukturen innerhalb des Zellenkörpers (1) identifiziert. Sowohl aktiv abzubauen und nicht-abbau invadopodia kann gezählt werden und werden dadurch bestimmt, ob diese Strukturen mit schwarzen Bereichen fehlt Fluoreszenzsignal im FITC-markiertem Fibronektin (Figur 1) kolokalisiert differenziert. Invadopodia manuell gezählt und ECM-Abbau pro Zelle wird durch d...

Mechanische Steifigkeit in der Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der malignen Verhalten durch Erhöhung invadopodia Aktivität und Actomyosin Kontraktilität. Verwendung Polyacrylamidgelen (PAAs), kann invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, die invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in Reaktion zu untersuchen, um die Steifigkeit Matrix.

Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Polyacrylamid-Gele herzustellen, die sowohl in Invasionstests als auch in Podien- und Zugkraftassays eingesetzt werden können, um die invasiven und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die 14-Millimeter-Deckgläser in den Glasblossom-Dishs aktiviert werden, um sicherzustellen, dass die Polyacrylamid-Gele an das Glas gebunden werden. Anschließend werden Polyacrylamid-Lösungen für beide Assays hergestellt, um Gele mit unterschiedlichen Steifigkeiten bzw. mechanischen Eigenschaften zu erhalten.Dann werden die invadierten Podien-Assays mit einer dünnen Schicht fluoreszenzmarkierter extrazellulärer Matrix vorbereitet, um den Abbau nachzuweisen. Abschließend werden die Assays mit Krebszellen besiedelt und über Nacht inkubiert, gefolgt von der Fixierung und Färbung der Invasoren, Podien-Platten sowie der Live-Cell-Imaging der Zugkraft-Platten. Letztendlich erfolgt die Bildgebung von Invasoren, Podien und dem Abbau der extrazellulären Matrix mittels Fluoreszenzmikroskopie.Während die Fluoreszenz- und die Hellfeldmikroskopie verwendet werden, um Mikrokügelchen bzw. Zellen für die

polyacrylamide-gels-for-invadopodia-traction-force-assays-on-cancer

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

In diesem Video zeigen wir die experimentelle Techniken verwendet, um konform, extrazellulären Matrix (ECM) beschichtete Substrate für Zellkulturen herzustellen, und die durchaus in Zugkraft Mikroskopie und Beobachten Auswirkungen der ECM Steifigkeit auf das Verhalten der Zelle.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

Wir beschreiben die prototypische Verfahren zur Herstellung Mikroskop Deckgläser mit fluoreszierenden Gelatine zur Visualisierung invadopodia-vermittelte Matrixabbau beschichtet. Rechenverfahren Verwendung verfügbarer Software für die Quantifizierung der resultierenden Ebenen der Matrix Proteolyse durch einzelne Zellen innerhalb einer Mischpopulation und für Gruppen, die vielzelligen gesamte mikroskopische Felder dargestellt.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Dieses Video beschreibt den Zugkraftmikroskopie-Assay. Der Assay bestimmt die zelluläre Traktion von menschlichen Dickdarmkrebszellen auf der extrazellulären Matrix, die auf einem weichen, elastischen Hydrogel mit eingebetteten fluoreszierenden Kügelchen vorhanden ist. Die resultierende Verschiebung der fluoreszierenden Kügelchen wird mit einer entsprechenden Software gemessen.

Traktionszytometrie-Assay: Eine Methode zur Quantifizierung der Zugkraft, die von Krebszellen auf die EZM ausgeübt wird

Häufig verwendet werden, sind sehr zugänglich Methoden zur Untersuchung der Zellmigration und Invasion in vitro beschrieben. Das erste Verfahren ist die Zelle Wundverschluss Assay misst die Zellbeweglichkeit. Die zweite Methode ist die Transwell-Migration und Invasion Assay, der die chemotaktische und invasive Kapazität der Zellen beurteilt.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Unser Labor hat DNA-vernetzte Polyacrylamid-Hydrogele, ein dynamisches System Hydrogel entwickelt, um die Effekte der Modulation Gewebesteifigkeit auf die Zellfunktion zu verstehen. Hier bieten wir Schaltpläne, Beschreibungen und Protokolle, um diese Hydrogele vorzubereiten.

Herstellung von DNA-vernetztem Polyacrylamid, Hydrogele

Es wird ein Protokoll zur Extraktion primärer menschlicher Zellen aus chirurgischem Dickdarmtumor und normalem Gewebe beschrieben. Die isolierten Zellen werden dann auf weichen, elastischen Substraten (Polyacrylamid-Hydrogelen) kultiviert, die durch ein extrazelluläres Matrixprotein funktionalisiert und mit fluoreszierenden Mikrokügelchen eingebettet sind. Die Traktionszytometrie wird durchgeführt, um zelluläre kontraktile Spannungen zu beurteilen.

Isolierung von primären humanen Colon Tumorzellen von Surgical Gewebe und Kultivierung sie direkt auf weiche elastische Substrate für Traction Cytometry

Hier wird eine Methode beschrieben, die eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in einem Multiwell-Plattenformat ermöglicht. Die Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann von jedem Forschungslabor leicht übernommen werden. Es wäre besonders nützlich in der Forschung, die sich auf das Verständnis steifigkeitsabhängiger Zellreaktionen konzentriert.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Traktionsmikroskopie integriert mit Mikrofluidik für chemotaktische kollektive Migration

Um voranzukommen, müssen Wachstumskegel Zugkräfte gegen die äußere Umgebung ausüben. Die Erzeugung von Zugkräften ist abhängig von der Aktindynamik und der Kupplungskupplung. Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zur Analyse der Aktindynamik, der Kupplungskupplung und der Zugkräfte für den Wachstumskegelvorschub.

Analysen von Aktindynamik, Kupplungskupplung und Zugkraft für den Wachstumskegelvorschub

Wir beschreiben Verbesserungen an einer Standardmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte, die auf dem Mikrokontaktdruck mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt von Punktarrays extrazellulärer Matrixproteine auf weichen Hydrogelen basiert. Diese Methode ermöglicht eine einfachere und konsistentere Herstellung von Inselmustern, die für die Steuerung der Zellgruppenform unerlässlich sind.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Erfahren Sie die Herstellung von Polyacrylamidgelen für Invadopodia- und Traction-Force-Assays bei Krebszellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung invasiver Eigenschaften und Zellkontraktilität in Abhängigkeit von Matrixsteifigkeit.

Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

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