Name: Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige Methode zur Identifizierung chemisch-genetischer Interaktionen in Saccharomyces cerevisiae. Diese Technik ermöglicht Forschern, biologische Prozesse und Toleranzgene gezielt zu untersuchen.

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Die Forschung im Labor CJN durch Betriebskostenzuschüsse von NSERC, der Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI) und der Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch) unterstützt.

HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Verfahrens ist in Figur 2 skizziert. 1. Bestimmung der wachstumshemmende Dosis <ol><li> Herstellung von Hefe-Nacht-Kultur HINWEIS: Der Hefeextrakt-Pepton-Dextrose Wachstumsmedium (YEPD) im Sinne dieses Protokolls ist ein Standardrezept 13. <ol><li> Streak aus BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) Zellen auf einer YEPD-Agar-Platte und Inkubation für 48 Stunden bei 30 ° C oder bis sichtbare Kolonien zu bilden. </li><li> Übernachtkulturen herzustellen durch Inokulieren von 5 ml YEPD flüssigen Medium in einem sterilen Kulturgefäß mit einer Einzelkolonie. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C mit kontinuierlicher Rotation oder Schütteln. Die Kultur wird in der Regel erreichen die Sättigung von der Morgen (~ 2 × 10 8 Zellen / ml). </li></ol></li><li> Solide Agarmedien Zubereitung mit unterschiedlichen chemischen Dosen <ol><li> Bereiten Sie einige Vorräte andie Chemikalie bei 100x gewünschte Endkonzentration in einem geeigneten Lösemittel getestet werden. HINWEIS: Wirksame Konzentrationen werden von der chemischen abhängen und muss empirisch ermittelt werden. Es ist daher ratsam, zunächst zu testen eine breite Endkonzentrationsbereich, dh von niedrigen uM bis hoch mM. </li><li> Für jede Konzentration der zu testenden Chemikalie, Aliquot 3 ml geschmolzenem YEPD-Agar mit einem mehrere sterile Kulturröhrchen. Platz in 55 ° C Wasserbad auf erstarrt halten. </li><li> Für jede Konzentration der zu testenden Chemikalie werden 30 ul der 100-fach Verbindung in geschmolzenem Medium, Wirbel 2-3 sec mischen und Pipette 1 ml in jedes Paar von doppelten Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen. Achten Sie darauf, ein Fahrzeug sind nur Kontrolle. Lassen Platten über Nacht bei Raumtemperatur einstellen. Werfen Sie keine zusätzliche Medien. </li></ol></li><li> Verteilt Plattierzellen <ol><li> Impfen Sie 10 ml YEPD flüssige Medien mit 2 ul einer gesättigten Hefekultur, über Nacht, wie in Schritt 1 aufgewachsen.1.2. </li><li> Platte 25 ul verdünnt Hefekultur pro Well, gleichmäßig mit sterilen Glasperlen oder Stange und damit die Platte unter einer Flamme trocknen. Inkubieren Platte bei 30 ° C für 48 Stunden. </li><li> Bewerten des Wachstums von Hefe (sowohl Anzahl und Größe der Kolonien) auf den Platten. Wählen einer subletalen Konzentration der Verbindung, die nicht das Wachstum hemmt, um mehr als 10% bis 15%, um den Bildschirm durchzuführen. </li></ol></li></ol> 2. Systematische Chemical Genetische Bildschirm <ol><li> Wartung von Lösch-Mutante-Array (DMA) und Vorbereitung der Quelle-Platte <ol><li> Für eine detaillierte Beschreibung über den Aufbau Deletionsmutante Arrays aus Glycerin Aktien finden Sie in Baryshnikova et al. 14 verwiesen. Sobald Deletionsmutanten in einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte angeordnet wurde, kann der DMA für einige Monate bei 4 ° C gelagert werden. Replizieren auf YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418 wie nötig, um Kolonien zu wachsen in jede verhindernandere. HINWEIS: Mehrere serielle Replikationen sollte vermieden werden, um den Verlust von langsamem Wachstum zu verhindern und das Auftreten von Suppressormutanten minimieren. Dies ist besonders relevant, wenn die Aufrechterhaltung der Sammlungen als Haploiden. </li><li> Führen Sie alle Replikat-Plating Schritte mit einer mikrobiellen Anordnen Robotersystem. Alternativ manipulieren angeordnet Kolonien mit manuellen Pinning-Tools. HINWEIS: Die Hefe Löschen Kollektion ist so Haploiden und Diploide von mehreren kommerziellen Quellen erhältlich und wird in der Regel als Glyzerin in 96-Well-Platten geliefert. </li></ol></li><li> Kondensieren der Deletionsmutante Array <ol><li> Bereiten 250 ml YEPD-Agarmedium, enthaltend 200 ug / ml G418. Die effektive Konzentration von G418 können variieren und jede Menge sollte empirisch überprüft werden. </li><li> Bereiten fünf YEPD Agarplatten durch Gießen von 50 ml YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418 pro Platte. Tun Sie dies einen Tag vor Kondensation des Array und damit die Platten bei Raumtemperatur abkühlenratur über Nacht auf eine ebene Unterlage. HINWEIS: Vier Platten werden für die Sammlung bei 1536-Dehnungs Dichte erforderlich ist, wird die fünfte Platte als extra gegossen. </li><li> Entfernen Sie die 16 Petrischalen, die das mutierte Löschen Sammlung bei einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) zu kommen. </li><li> Wischen Sie Kondensation, die mit eine heikle Aufgabe wischen auf dem Deckel jeder Platte gebildet hat. Bei Nichtbeachtung kann es zu Wassertröpfchen führen, dass auf dem Array und Kreuzkontamination von angeordneten Mutanten hinterlegt. </li><li> Mit einem mikrobiellen Array Pinning Roboter, kondensieren die DMA von einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte (16 Petrischalen), um 1536 Kolonien pro Platte (4 Petrischalen). Führen Sie diese, so dass der 1. Kolonie von Platte 1 Stifte 1 Spalte 1 der verkürzten Reihe rudern, um die 1. Kolonie Platte 2 Zeile 1 Spalte 2, der 1. Kolonie Platte 3 zu Zeile 2 und Spalte 1, und der 1. Kolonie Platte 4 zu Zeile 2Spalte 2. </li><li> Inkubieren Sie die Konzern-Array bei 30 ° C über Nacht. </li><li> Untersuchen Sie das Array, um eine einheitliche Übertragung von Kolonien von der Quelle Platten zu gewährleisten. Es werden mehrere leere Positionen, absichtlich in das Array aufgenommen, die als Richtschnur dienen, um sicherzustellen, das DMA korrekt (4A) kondensiert sein. HINWEIS: Diese greift auf die Quellplatten für Replikaplattierung auf Medien, die die Testverbindung sein. Eine Hand Platte kann für mehrere Pinnings verwendet werden. Auch viele Roboter Gegenläufig-Funktion, die eine ähnliche Anzahl von Hefe werden jedes Mal übertragen gewährleisten müssen. </li></ol></li><li> Replica Platte Deletionsmutante Array <ol><li> Bereiten 700 ml der Kontrolle (nur Vehikel) und 700 ml Versuchsmedien (chemische haltigen). Das ist genug, zur Durchführung des Assays in dreifacher Ausfertigung (12 Platten pro Zustand, plus zwei Extrakosten). </li><li> Gießen Sie 50 ml YEPD-Agar, der Prüfsubstanz oder Steuer pro Platte. Lassen Sie die Platten to bei Raumtemperatur über Nacht abkühlen lassen auf eine ebene Unterlage. </li><li> Verwendung des Roboters zu Replikaplatte inokulieren die DMA auf drei Sätze von Platten, die Chemikalien an der experimentell bestimmten Konzentration, sowie drei Sätze von Platten, die die Vehikelkontrolle. Platten bei Raumtemperatur inkubieren 24-48 h. </li></ol></li></ol> 3. Speicherfolien und Datenanalyse <ol><li> Platten Entfernen von Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) vor der Bilderzeugung kommen. Dadurch wird die Bildung von Kondenswasser während Abbildung der Platten zu verhindern. </li><li> Bildplatten 24 und 48 Stunden nach Entfernen des Deckels und Platzierung der Vorderseite nach unten auf einem Flachbettscanner. Machen Sie Bilder mit einer Auflösung von mindestens 300 dpi. Alternativ können Sie eine Digitalkamera zur Erfassung von Bildern. Wenn dabei konfrontiert Ort Platten auf einem dunklen Hintergrund, und entfernen Sie den Deckel zu Bild. HINWEIS: Das Dateiformat und Positionierung der Platten wird auf der Quantifizierung Programm abhängen. </li&gt; <li> Führen Quantifizierung und den Vergleich der Array Koloniegrößen mit einem der vielen Open-Source-Programme, einschließlich Balony 15. SGAtools 16 und ScreenMill 17. </li></ol> 4. Validierung von Screen HINWEIS: In dieser Phase wird mehrere Hefe-Mutanten Deletionen als überempfindlich auf die Chemikalie punkten. Diese chemisch-genetischer Interaktionen muss nächste auf zwei Arten überprüft werden. Zunächst wird die Identität der empfindliche Stämme sollten durch PCR bestätigt werden. Zweitens müssen die Chemikalien-Sensitivität unabhängig gewertet. Folgenden Abschnitten wird eine kurze Protokoll zur Durchführung von Tests, um Spotting Dehnungsempfindlichkeit, eine Technik, die in Hefe Biologie gemeinsam zu überprüfen. <ol><li> Streak out gewünschte (allergisch) Mutanten aus der Deletion Sammlung Hefe auf YEPD-Agar, enthaltend 200 ug / ml G418. Inkubiere bei 30 ° C bis Kolonien bilden. Stellen Sie sicher, das Erbgut des Stammes durch diagnostische PCR mit Primern nachProtokoll des Herstellers. </li><li> Impfen Sie 5 ml der YEPD Flüssigkeit für jeden Stamm beimpft und über Nacht bei 30 ° C mit einer Rotation oder Schütteln. </li><li> Messen OD 600 und verdünnt jede Belastung in sterile dH 2 O OD 600 = 1 Diese werden nun die normierten Hefekulturen. </li><li> Dispense 100 ul der normalisierten Wildtyp-Hefe (BY4741) Kultur und A1 einer 96-Well-Platte. Dispense 100 ul von bis zu sieben zusätzliche Belastungen in die Vertiefungen B1-H1. </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette auf 90 ul sterilem dH 2 O in die Vertiefungen A2-H2 bis A6-H6 verzichten. Schließlich bereiten eine Reihe von 1:10 Verdünnungen normalisierte Hefekulturen. Starten Sie durch serielles Pipettieren von 10 ul der Spalte 1 Spalte 2 mit einer Mehrkanalpipette, und weiter über die Platte mit 96 Vertiefungen bis sechs Verdünnungen hergestellt werden (dh 10 0 bis 10 -5). </li><li> Übertragen Sie 2-5 ul der verdünnten Hefekulturen in einem Raster mit einer MehrkanalPipette auf YEPD festen Medien, die chemischen und Fahrzeugsteuerung. Platten bei der geeigneten Temperatur für 24-48 Std. </li><li> Untersuchen Platten und vergleichen Sie die Empfindlichkeit des ausgewählten Mutanten gegen chemische (bezogen auf BY4741-Steuerung). Bildplatten bei 24 und 48 h, wie in Schritt 3.2. HINWEIS: Während der Identifizierung mehrerer überempfindlich Stämme mit verwandten Gen Ontologien oder Funktionen verleiht Vertrauen auf die Gültigkeit des Bildschirms, Umwandlung eines überempfindlichen Deletionsstamm mit einem Plasmid, das eine Wildtyp-Kopie des Gens wird benötigt, um förmlich festgestellt werden, dass ein Gen, Löschen von Interesse (und nicht versteckt zweiten Standort Mutationen) verursacht Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hier skizziert ist ein Ansatz zur Erzeugung von chemisch-genetischer Interaktionsprofile. Das Verfahren ist einfach: durch Vergleich Koloniegrößen von jedem Stamm in umfassenden Gendeletion Sammlungen in Gegenwart und in Abwesenheit einer chemischen, alle Gene benötigt wird, um eine chemische Insult tolerieren identifiziert. Annotation Bereicherung Analyse des resultierenden Liste sensibler Stämme können dann verwendet werden, um einen Einblick in eine Chemikalien Wirkungs bieten. Während dieses Protokolls für Bäckerhef...

Die genetischen Tools und Ressourcen im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae haben großen funktionellen Genomik Studien, die gemeinsam ein neues Licht auf, wie Gene funktionieren, wie Netzwerke, um die Anforderungen von biologischen Systemen erfüllen zu können. Der Grundstein dieser Tools war die gemeinsame Erstellung eines vollständigen Satzes von nicht wesentlichen Gendeletionen aller offenen Leserahmen in Hefe 1,2. Eine auffallende Beobachtung war, dass nur ~ 20% der Hefe-Gene sind für die Lebensfähigkeit erforderlich, wenn als Haploiden unter Standardlaborbedingungen gezüchtet. Dies unterstreicht die Fähigkeit einer Zelle, durch die Nutzung alternativer biologischen Bahnen gegen genomische Perturbationen puffern. Genetische Mutanten, die individuell lebensfähig sind, aber tödlich in Verbindung, Signal angeschlossenen oder konvergent parallel biologische Pfade und bilden genetische Interaktionsnetzwerke, die biologische Funktion zu beschreiben. Mit der Entwicklung der bedingten temperature empfindlichen und hypomorphen Allele von essentiellen Genen die Technik nicht auf die Untersuchung von nicht-essentiellen Genen 3,4 beschränkt. Dieses Konzept wurde in einer genomischen Maßstab angewendet produziert eine unvoreingenommene genetische Interaktion Karte darstellen, wie Gene in ähnlichen zellulären Prozessen beteiligt Cluster zusammen 5. Chemische Störungen der genetischen Netzwerke Mimik Gendeletionen (Abbildung 1) 6. Abfragen von wachstumshemmenden Verbindungen gegen eine hochdichte Anordnung von Deletionsstämme Überempfindlichkeit identifiziert eine chemisch-genetischen Interaktionsprofil, also eine Liste von Genen, die erforderlich ist, um die chemische Beanspruchung verträgt. Wie genetische Interaktionen, Großbildschirme von chemischen Bibliotheken haben gezeigt, dass mit einem ähnlichen Wirkmechanismus Cluster zusammen 7 Verbindungen. Daher wird durch die Gründung der chemisch-genetische Wechselwirkungsprofil von einer Verbindung der Wirkmechanismus kann durch einen Vergleich mit lar entnehmen,ge-Skala synthetischen genetischen und chemischen genetische Interaktion Datensätze von 8,9. Groß chemisch-genetischen Screens, wo Dutzende von Verbindungen werden verhört wurden von Barcode Konkurrenztests durchgeführt. Bei diesem Ansatz wird die gepoolte Sammlung von Deletionsmutanten ist en masse über mehrere Generationen in einem kleinen Volumen an Medium, das eine chemische gezüchtet. Da jeder Deletionsmutante beherbergt eine einzigartige genetische Barcode wird die Lebensfähigkeit / Wachstum einzelner Mutanten innerhalb des Pools von Deletionsstämme von Microarray-oder Hochdurchsatz-Sequenzierung 10 verfolgt. Ableitung Fitness durch Überwachung Koloniegröße von physikalisch Array-Mutanten auf festem Agar, der eine bioaktive Verbindung gewachsen ist auch eine wirksame Methode, um chemisch-genetischer Interaktionen 11,12 identifizieren. Dieser Ansatz bietet eine kostengünstige Alternative für den Wettbewerb basierten Screening und zur Bestimmung von kleinen Bibliotheken von Chemikalien geeignet.Hier skizziert ist eine einfache Methode zur Erzeugung einer Liste von chemisch-genetischer Interaktionen in S. cerevisiae, die nicht auf der Molekularbiologie Manipulationen oder Infrastruktur angewiesen ist. Es erfordert nur eine Hefe Löschen Sammlung, einen Roboter oder manuell Pinning Gerät und frei verfügbaren Bildanalyse-Software.

<table><tbody><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Für YEPD flüssige/feste Medien bis zu 1% Endkonzentration (w/v)</td></tr><tr><td>Tyrpton Pulver</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>Für YEPD flüssige/feste Medien bis 2% Endkonzentration (w/v)</td></tr><tr><td>Dextrose-Anachämie</td><td></td> <td>31096-380</td><td>Für flüssige/feste YEPD-Medien auf 2 % Endkonzentration (w/v) &#8212 zugeben; Nicht autoklavieren. Bereiten Sie eine 20%ige Stammlösung vor, filtern Sie sie, sterilisieren Sie sie und geben Sie sie nach dem Autoklavieren zu den Medien.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>Für feste YEPD-Medien mit 2 % Endkonzentration (w/v)</td></tr> <tr><td>hinzufügen G418</td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>1.000x Bestand zu 200&nbsp; vorbereiten mg/ml in dH2O und Filter sterilisieren.&nbsp;</td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Kulturröhrchen</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petrischale</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>Mikrobieller Array-Pinning-Roboter mit hohem Durchsatz</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&copy; Petrischale</td><td>Sänger Instrumente&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>Box mit 200 Schüsseln</td></tr><tr><td>384 Short-Pin RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>Box mit 1.000 Pads</td></tr><tr><td>1536 RePad mit kurzen Stiften</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Box mit 1.000 Pads</td></tr><td colspan><tr>="4">Alternative Pinning-Tools:</td></tr><tr><td>Vollautomatische Robtic Systems</td><td>S& P robotics</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Mehrere automatisierte Koloniehandhabungs- und Bildgebungssysteme verfügbar.</td></tr><tr><td>Manuelle Pinning-Tools</td><td>V& P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>Handheld-Replikationswerkzeuge und Zubehör.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

schnelle identifikation von chemischen genetische interaktionen in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Die Ermittlung der Wirkungsweise von bioaktiven Chemikalien ist von Interesse für ein breites Spektrum von akademischen, pharmazeutischen und industriellen Wissenschaftlern. Saccharomyces cerevisiae oder Bäckerhefe, ist ein Modell, Eukaryoten, für die eine vollständige Sammlung von ~ 6000 Gen-Deletionsmutanten und hypomorphen essentielles Gen Mutanten sind im Handel erhältlich. Diese Sammlung von Mutanten verwendet werden, um systematisch erkennen chemisch-Gen-Interaktionen, dh Gene notwendig, eine chemische tolerieren. Diese Information wiederum berichtet über die wahrscheinliche Wirkungsweise der Verbindung. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die schnelle Identifizierung von chemischen genetischen Wechselwirkungen in Bäckerhefe. Wir zeigen, das Verfahren unter Verwendung des Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU), die eine wohldefinierte Wirkmechanismus besitzt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Kern TRAMP RNA-Exosom und DNA-Reparaturenzyme sind für die Proliferation in Gegenwart von 5-FU, die im Einklang mit früheren m ist erforderlichicroarray basierten Barcode-Chemie genetische Ansätze und das Wissen, dass 5-FU beeinträchtigt sowohl RNA als auch DNA-Stoffwechsel. Die erforderlichen Validierungsprotokolle dieser Hochdurchsatz werden ebenfalls beschrieben.

Als Validierung dieses Ansatzes Wir führten eine repräsentative chemische genetische Wechselwirkung Bildschirm des Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) gemäß dem oben beschriebenen Protokoll. 5-FU ist bekannt, die Thymidylat-Synthase sowie die DNA und RNA-Metabolismus 18 stören. Die chemischen genetischen Wechselwirkungen von 5-FU sind gut untersucht und wurden von Hefe Barcode-Mikroarray-Techniken unter Verwendung von sowohl heterozygote und homozygote Deletion Sammlungen 8,19 untersucht. Hier...

Hier stellen wir eine kostengünstige Methode zur Definition chemisch-genetischer Interaktionen in knospenden Hefen vor. Der Ansatz baut auf grundlegenden Techniken der Hefemolekularbiologie auf und eignet sich gut für die mechanistische Abfrage kleiner bis mittlerer Ansammlungen von Chemikalien und anderen Medienumgebungen.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hefezellen zu verwenden, um die biologischen Prozesse zu finden, auf die eine Chemikalie von Interesse abzielt. Dies wird erreicht, indem zunächst das Dosis-Wirkungs-Profil einer Chemikalie für Hefe bestimmt wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine vollständige Sammlung von Hefe-Gen-Knockout-Stämmen auf einer subletalen Dosis einer Chemikalie und auf einer Kontrollplatte zu züchten.Als nächstes werden Hefemutanten identifiziert, die überempfindlich auf die Chemikalie reagieren. Diese Liste wird bioinformatisch analysiert, um alle Gene aufzudecken, die zur Verträglichkeit der Chemikalie erforderlich sind. Der letzte Schritt besteht darin, ein biologisches Replikat des Experiments mit geringem Durchsatz durchzuführen.Dies bestätigt alle gefundenen chemischen Geninteraktionen. Letztendlich wird diese chemische genetische Screening-Methode mit hohem Durchsatz verwendet, um zu zeigen, welche Genprodukte und biologischen Signalwege verwendet werden, um die interessierende Chemikalie zu tolerieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. dem kompetitiven Wachstum von barcodierten Mutanten in Flüssigkulturen, besteht darin, dass keine molekularbiologischen Techniken erforderlich sind.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der chemischen Biologie zu beantworten, etwa wie ein neuartiges kleines Molekül das Wachstum eukaryotischer Zellen hemmen kann. Bereiten Sie zunächst eine Hefekultur über Nacht vor, indem Sie BY 4 7 4 1 Zellen auf einer A-Y-E-P-D-Platte ausstreift und 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren oder bis sich sichtbare Kolonien bilden. Wenn die Völker bereit sind.Bereiten Sie über Nacht Flüssigkulturen vor, indem Sie eine einzelne Kolonie auswählen und fünf Milliliter YEPD-Flüssigmedium in ein steriles Gefäß impfen. Dann über Nacht bei 30 Grad Celsius mit kontinuierlicher Rotation oder Schütteln inkubieren. Bereiten Sie anschließend feste Agarmedien vor, die verschiedene Dosen der zu testenden Chemikalie enthalten.Um dies zu tun. Zuerst werden mehrere Stammlösungen der interessierenden Chemikalie mit dem 100-fachen der Endkonzentration in einem geeigneten Lösungsmittel hergestellt. Dann aliquotieren Sie für jede zu prüfende Konzentration drei Milliliter geschmolzenen YEPD-Agar in mehrere sterile Kulturröhrchen.Die Röhrchen mit dem Agar in ein 55 Grad Celsius heißes Wasserbad legen, um eine Verfestigung des Agars zu verhindern. Nun, für jede Konzentration der Chemikalie, die bei 13 getestet werden soll, weiße Freisetzung der 100-fachen Verbindung an ein Aliquot geschmolzenen Agar tex, das Röhrchen für zwei bis drei Sekunden mischen und dann einen Milliliter aus jedem Röhrchen in doppelte Vertiefungen in einer 12-Welt-Platte pipettieren lassen, lassen Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Am nächsten Tag beimpfen Sie 10 Milliliter YEPD-Flüssigmedium mit zwei Mikrolitern der gesättigten Nachthefekultur.Pipettieren Sie dann 25 Mikroliter dieser Kultur auf die agarhaltige Chemikalie in den Vertiefungen der 12-Wal-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig mit sterilen Glasperlen oder einem sterilen Stab. Lassen Sie die Platte unter einer Flamme trocknen und inkubieren Sie die Platte dann 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Bewerten Sie nach Ablauf der Inkubationszeit die Gesamtzahl und Größe der Kolonien in den Vertiefungen.Identifizieren Sie eine subletale Konzentration der Verbindung, die das Wachstum nicht um mehr als 10 bis 15 % hemmt, um sie im Sieb zu verwenden. Die Deletionsmutantenrate wird bei einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte gehalten, indem auf 16 YEPD-Agarplatten repliziert wird, die 200 Mikroliter pro Milliliter G vier 18 enthalten. Verwendung eines mikrobiellen Arraying-Robotersystems oder manueller Pinning-Tools alle drei Monate.Lagern Sie die Platten bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie dann 250 Milliliter YEPD-Agarmedien mit der gleichen Konzentration von G, vier 18- oder fünf Agarplatten vor und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur auf einer ebenen, ebenen Fläche abkühlen. Nehmen Sie die Platten mit der Deletionsmutantensammlung bei vier Grad Celsius aus der Lagerung und lassen Sie die Platten auf Raumtemperatur kommen.Verwenden Sie ein Feinfühltuch, um Kondenswasser zu entfernen, das sich auf dem Deckel jeder Platte gebildet hat, um zu verhindern, dass sich Wassertröpfchen auf dem Array ablagern und die Array-Mutanten kreuzen. Lassen Sie den mikrobiellen Array-Pinning-Roboter das Deletionsmutanten-Array von einer Dichte von 384 Kolonien pro Platte auf 16 Petrischalen auf 1.536 Kolonien pro Platte auf vier Petrischalen kondensieren. Nachdem Sie das Array über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert haben, untersuchen Sie das Array, um einen gleichmäßigen Transfer der Kolonien von den Quellplatten sicherzustellen.Es werden mehrere leere Positionen in das Array integriert, die als Anhaltspunkt dafür dienen, dass das Deletionsmutanten-Array korrekt komprimiert wurde. Dies sind die Quellplatten, die für die Replikation auf Medien verwendet werden, die Ihre interessante Verbindung enthalten. Eine einzelne Quellplatte kann für mehrere Pinnings verwendet werden.Außerdem verfügen viele Roboter über Offset-Funktionen, die es ermöglichen, jedes Mal eine ähnliche Anzahl von Hefen zu übertragen. Um die Reparatur des Replik-Plattendeletions-Mutanten-Arrays einzurichten, werden nur 700 Milliliter Kontrollvehikel und experimenteller YEPD-Agar mit der interessierenden Chemikalie benötigt. Dies reicht aus, um den Assay in dreifacher Ausführung durchzuführen.Gießen Sie die Platten mit dem Kontroll- und Versuchsagar. Fügen Sie 50 Milliliter zu jeder Platte hinzu. Lassen Sie die Platten über Nacht auf einer ebenen, ebenen Fläche bei Raumtemperatur abkühlen und verwenden Sie den Roboter, um eine Platte zu replizieren.Das Doppelmutanten-Array wird auf drei Sätze von Platten mit Chemikalien in der experimentell bestimmten Konzentration sowie auf Rücksetzungen von Platten mit der Fahrzeugsteuerung geimpft. Inkubieren Sie die Platten auf der Tischplatte bei Raumtemperatur für insgesamt 24 bis 48 Stunden Bild. Die Platten sind 24 und 48 Stunden inkubiert, indem der Deckel entfernt und mit der Vorderseite nach unten auf einen Flachbettscanner gelegt wird.Nehmen Sie Bilder mit einer Auflösung von mindestens 300 DPI auf. Alternativ können Sie eine Digitalkamera verwenden, um Bilder aufzunehmen. Legen Sie in diesem Fall die Teller mit der Vorderseite nach oben auf einen dunklen Hintergrund und entfernen Sie die Deckel, um das Bild zu erhalten.Führen Sie dann die Quantifizierung und den Vergleich der Array-Koloniegrößen mit einem von mehreren Open-Source-Programmen durch, einschließlich Kugel-SGA-Tools und Siebfräse. In diesem Stadium werden mehrere Hefe-Deletionsmutanten als überempfindlich gegenüber der interessierenden Chemikalie eingestuft und die gewünschten überempfindlichen Mutanten aus der Hefe-Deletionssammlung auf YEPD übertragen. Ager mit 200 Mikrogramm pro Mikroliter G vier 18 inkubieren bei 30 Grad Celsius, bis sich Kolonien bilden.Nach der Verifizierung des Genotyps des Stammes durch diagnostische PCR und Agel-Elektrophorese inokulieren fünf Milliliter der YPD-Flüssigkeit mit jedem Stamm und inkubieren über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Rotation oder Schütteln. Messen Sie den OD 600 jeder Kultur und verdünnen Sie jeden Stamm auf einen OD 600 von eins in sterilem destilliertem Wasser. Dies sind nun die normalisierten Hefekulturen.Als nächstes werden 100 Mikroliter des normalisierten Wildtyps durch 4 7 4 1 Hefekulturen an die Vertiefung A einer von einer 96-Well-Platte abgegeben und 100 Mikroliter von bis zu sieben zusätzlichen Stämmen in die Vertiefungen abgegeben, B eins bis H eins. Geben Sie als Nächstes 90 Mikroliter steriles Wasser in Brunnen ab, A zwei bis H zwei bis a sechs bis H sechs. Bereiten Sie schließlich eine Serie von einer bis 10 Verdünnungen normalisierter G-Skulpturen vor.Beginnen Sie mit dem seriellen Pipettieren von 10 Mikrolitern der ersten Säule bis zur zweiten Säule mit einer Mehrkanalpipette und fahren Sie mit der 96-Well-Platte fort, bis sechs Verdünnungen vorgenommen wurden. Verwenden Sie dann die Mehrkanalpipette auf zwei bis fünf Mikroliter der verdünnten Hefekulturen in einem Gitter auf YEP D's, festen Medien, die Chemikalien und Vehikel enthalten. Inkubieren Sie die Platten nach der Inkubation 24 bis 48 Stunden lang bei der entsprechenden Temperatur.Untersuchen Sie die Platten und vergleichen Sie die Empfindlichkeit ausgewählter Mutanten gegenüber Chemikalien im Vergleich zu den Kontrollbildfolien BY 47 41 nach 24 und 48 Stunden. Wie zuvor zeigen die folgenden Bilder die Ergebnisse des Verfahrens zur Bestimmung der subin-inhibitorischen Konzentration der Chemikalie. Das erste Bild zeigt das Wachstum einer gesättigten BY 4 7 4 1 Kultur, die um eins bis 5.000 verdünnt und mit steigenden Konzentrationen von fünf Fluoruracil plattiert wurde.Die Konzentration von 10 Mikromolaren wird als sub-in-inhibitorische Dosis gewählt. Dieses Bild zeigt die Wachstumskurve von BY 4 7 41 Zellen in flüssigen Medien, die fünf Fluro-Uracil enthalten. Ungefähr viermal wurden 10 to die vier Zellen in dreifacher Ausfertigung abgeschieden und steigende Konzentrationen von fünf Fluor, Uracil und optische Dichten wurden alle 10 Minuten für 22 Stunden gemessen.Auch hier ist zu erkennen, dass die Dosis von 10 Mikromolaren die subin-inhibitorische Dosis ist. Die nächsten Bilder zeigen die Ergebnisse einer chemischen Genetik grün von fünf Fluor-Uracil. Hier ist ein S sachar visier deletion mutant array repliziert, das auf YPD-Agar repliziert wurde und rechts 10 mikromolare fünf Fluor Uracil und links eine DMSO-Kontrolle enthält.Diese Grafik zeigt die Ergebnisse der chemischen Genetik grün, das relative Wachstum der Mutanten auf 10 Mikromolaren. Fünf Fluor-Uracil sind im Vergleich zur DMSO-Kontrolle hier nach einer Strahlposition geordnet. Das relative Wachstum der Mutanten auf Uracil mit 10 Mikromolaren und fünf Floren im Vergleich zur DMSO-Kontrolle ist nach dem Verhältnis der Koloniegröße geordnet.In beiden Diagrammen ist ein Verhältnisschwellenwert von weniger als 0,8 angegeben. Dieses letzte Bild zeigt die Ergebnisse von drei Validierungsassays. Serielle Verdünnungen mehrerer isolierter mutierter Stämme wurden auf der DMSO-Kontrolle auf der linken Seite, 10 Mikromolaren, fünf Fluor-UIL in der Mitte und 0,015 % Methylmethansulfonat auf der rechten Seite gezüchtet.Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, dass Sie auch mit einer zuverlässigen Kopie des Deletionsmutanten-Arrays arbeiten, um alle Ergebnisse mit einer unabhängigen Methodik wie Hefe-Spotting-Assays oder Hefe-Tetraden-Dissektion zu validieren. Diese Technik bietet Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Forschung an kleinen Molekülen ein effizientes Mittel, um die Wirkungsweise einer Verbindung mit Ansätzen auf Systemebene in knospenden Hefen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Systematische, groß angelegte synthetische genetische (Gen-Gen-oder Epistase) Interaktion Bildschirme können verwendet werden, um genetische Redundanz und Weg cross-talk zu erkunden. Hier haben wir eine High-Throughput-quantitative synthetischen genetischen array Screening-Technologie beschreiben, bezeichnet ESGA dass wir für die Aufklärung epistatische Beziehungen und erforschen genetische Interaktion Netze in den...

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

In diesem Video demonstrieren wir den modifizierten Hefe-Ein-Hybrid-Assay, der mehrere Proteine nachweist, die mit der Ziel-DNA interagieren. Die transformierten Hefezellen enthalten die Ziel-DNA-Sequenz stromaufwärts des Reportergens. Zusätzlich exprimieren sie Transkriptionsfaktor-Proteine. Wenn die Proteine Komplexe bilden und an die Ziel-DNA binden, wird das Reportergen exprimiert und kann enzymatisch nachgewiesen werden.

Modifizierter Hefe-One-Hybrid-Assay zum Nachweis von heteromeren Proteinkomplex-DNA-Wechselwirkungen

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Wir präsentieren eine einfache Suppressor Bildschirm Protokoll in Kernspaltung Hefe. Diese Methode ist effizient, Mutagen-frei und selektiv für Mutationen, die oft auf einen einzigen genomischen Locus auftreten.  Das Protokoll ist geeignet für die Isolierung von Unterdrücker, die Wachstumsstörungen in Flüssigkultur lindern, die durch eine Mutation oder ein Medikament verursacht werden.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Die reziproke Hemizygosität durch Sequenzierung (RH-seq) ist eine leistungsstarke neue Methode, um die genetische Grundlage eines Merkmalsunterschieds zwischen den Arten abzubilden. Pools von Hemizygoten werden durch Transposon-Mutagenese erzeugt und ihre Fitness wird durch Wettbewerbswachstum mit einer durchgehenden Sequenzierung verfolgt. Die Analyse der resultierenden Daten zeigt Gene, die dem Merkmal zugrunde liegen.

Genetische Kartierung von Thermotoleranzunterschieden zwischen Spezies von Saccharomyces Hefe über Genom-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Bakterielle Krankheitserreger sezernieren Proteine in den Wirt, die auf entscheidende biologische Prozesse abzielen. Die Identifizierung der Wirtswege, auf die bakterielle Effektorproteine abzielen, ist der Schlüssel zur Bekämpfung der molekularen Pathogenese. Hier wird eine Methode beschrieben, bei der ein modifizierter Hefesuppressor und ein Toxizitäts-Bildschirm verwendet werden, um Wirtswege aufzuklären, die von toxischen bakteriellen Effektorproteinen angegriffen werden.

Identifizierung von Wirtspfaden, die von bakteriellen Effektorproteinen mit Hefetoxizität und Suppressor-Screens gezielt werden

Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.

Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Hier beschreiben wir die Verwendung von Grafix (Gradient Fixation), einer Glyceringradientenzentrifugation in Gegenwart eines Vernetzers, um Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren zu identifizieren, die vorübergehend an den Spleißosomkomplex binden.

Verwendung von Grafix zum Nachweis transienter Interaktoren von Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für einen Multicopy-Suppressor-Gen-Screen in Schizosaccharomyces pombe. Dieser Bildschirm verwendet eine genomweite Plasmidbibliothek, um Suppressorklone eines Funktionsverlust-Phänotyps zu identifizieren, der mit einem Abfragemutantenstamm assoziiert ist. Neuartige genetische Suppressoren der ell1-Nullmutante wurden mit diesem Screen identifiziert.

Genetischer Screen zur Identifizierung von Multicopy-Suppressoren in Schizosaccharomyces pombe

Die D-Loop Capture (DLC) und D-Loop Extension (DLE) Assays nutzen das Prinzip der Proximity-Ligation zusammen mit quantitativer PCR, um D-Loop-Bildung, D-Loop-Extension und Produktbildung am Ort eines induzierbaren doppelsträngigen Bruchs in Saccharomyces cerevisiae zu quantifizieren.

Nachweis homologer Rekombinationszwischenprodukte mittels Proximityligation und quantitativer PCR in Saccharomyces cerevisiae

Lernen Sie eine kostengünstige Methode zur Identifizierung chemisch-genetischer Interaktionen in Saccharomyces cerevisiae. Diese Technik ermöglicht Forschern, biologische Prozesse und Toleranzgene gezielt zu untersuchen.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in

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