Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Hallo, mein Name ist Helen Kuster und ich arbeite in der kardiovaskulären Forschungsgruppe von Dr. Harold und Professor an der Auto Vica University in MacBook. Wir interessieren uns für die Isolationscharakterisierung von marinen Monozyten, um sie für Vehikel im Kollateralschiffswachstum zu verwenden. Für die Kultivierung von Monozyten aus dem Knochenmark sind die folgenden Hauptschritte erforderlich: Erste Mausanästhesie und Zervixluxation, zweite Extraktion und Spülung des Femurs.

Dritte Filterung des Knochenmarks. Vierter nach Waschschritt, mittlerer fünfter, Kultivierung der Zellen auf ultraniedrigen Anheftplatten. Sechste Durchflusszytometrie.

Um Monozyten aus dem Knochenmark zu gewinnen, wird die Maus mit ISO-Fluor betäubt und durch Zervixluxation euthanasiert. Die Maus wird fixiert und die beiden unteren Gliedmaßen werden mit einem Steroidskalpell getrennt. Sowohl der Oberschenkelknochen als auch das Schienbein wurden entnommen und mindestens 90 Sekunden lang mit 96%Ethan-Ethanol gewaschen.

Danach müssen alle Schritte streng steril sein, um eine Kontamination zu vermeiden. Muskeln oder Sehnen werden aus dem Knochen entfernt. Femur und Tibia werden mehrmals mit warmem PBS gespült.

Für die Entnahme des Knochenmarks werden die proximalen und distalen Enden jedes Knochens mit einer feinen Schere durchtrennt. Um den Knochen zu spülen, benötigen wir eine Steroidnadel 28 G, eine Milliliterspritze und zwischen 10 und 15 Milliliter Medium pro Knochen. Anschließend wird das Knochenmark durch einen 70 Mikrometer S filtriert, wobei der Knochen mit einer feinen Pinzette gehalten wird.

Spülen Sie die Knochen nacheinander ab, bis sie illusionär werden. Um die Zellbelastung zu minimieren, üben Sie vorsichtig Druck auf den Stempel der Spritze aus. Spülen Sie das Sieb mit PBS aus.

Anschließend werden die Zellen bei 250 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Und sind Reus mit Medium suspendiert? Wiederholen Sie den Schritt nach diesem Schritt erneut.

Für Monozyten aus dem Knochenmark aus nativem Knochenmark verwenden wir M 199 mit 1 % Penicillin und Streptomycin und 10 % fetalem Hustenserum. Zusätzlich fügen wir am ersten Tag 20 Nanogramm pro Milliliter INE MCSF hinzu. Acht Nanogramm pro Milliliter Interfer-Gamma werden am letzten Tag der Kultur dem Medium zugesetzt.

Wenn eine Hochregulierung von MHC um zwei gewünscht wird, werden die Zellen in extrem niedrige Anhaftungsplatten mit dicken Vertiefungen ausgesät, um eine dauerhafte Adhäsion am Boden zu verhindern. Wir verwenden eine Konzentration von einmal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter mit bis zu sechs Millilitern pro Well. Die Anbauzeit beträgt fünf Tage bei einer Temperatur von 37 Grad und 5% Kohlendioxid.

Die Zellen werden täglich kontrolliert: Nach fünf Tagen sind zwischen 60 und 80% der Zellen Monozyten. Mein Name ist Martin Bachner und ich bin Medizinstudent hier an der Auto Fungi University in der Abteilung für Kardiologie, Anologie und Chronologie. Und wenn Sie die intravenöse Injektion durchführen, ist es wichtig, viel zu üben, bevor Sie es tun, da Sie sonst nicht in der Lage sind, die Monozyten angemessen anzuwenden.

Experimente haben gezeigt, dass Monozyten bei systemischer Anwendung am effektivsten bei der Verbesserung der Kunstagenesie sind. Eine gängige Art der systemischen Arzneimittelanwendung ist eine Tail-WA-Injektion. In unserem Fall injizieren wir 2,5 Millionen Monozyten, die resuspendiert sind, und Natriumchlorid.

Im Schwanz der Mausarterien befinden sich auf der ventralen und dorsalen Seite vier Gefäße und auf der lateralen Seite zwei Vertiefungen. Für die WA-Injektion müssen wir den Schwanz also um etwa 90 Grad drehen. Um die Handhabung zu erleichtern, sollte die Maus mit einem Heizkissen etwa 10 Minuten lang erwärmt werden.

Die Tiere sollten durch Erwärmung beobachtet werden. Dies ist wichtig, um Anzeichen einer Überhitzung zu erkennen. Darüber hinaus benötigen wir diesen Infektionserreger und eine 30-Gen-Nadel auf einer Ein-Milliliter-Insulinspritze.

Fixieren Sie das Tier vorsichtig in einem Fixiergerät, das das Einspritzen in den Schwanz viel einfacher macht. Stellen Sie sicher, dass die Maus genügend Platz zum Atmen hat, bevor Sie die Lösung in die Spritze laden. Vortex, die Monozytenlösung, um sicherzustellen, dass alle Monozyten injiziert werden können.

Desinfiziert die Injektionsstelle, um Infektionen zu vermeiden, nehmen Sie den Schwanz zwischen Ihren Schlag und Ihren Zeigefinger. An der distalsten Stelle wird die Nadel in einem flachen Winkel eingeführt. Wenn es in die Vene eingebracht wird, ist es sehr einfach, die Monozytenlösung zu injizieren.

Wenn es eine Blase gibt, ist das ein Zeichen für eine falsche Injektion. Sie sollten sofort aufhören und mehr versuchen. Proximal, versuchen Sie immer, langsam und nicht mehr als fünf Mikroliter pro Gramm zu injizieren.

Wenn die Injektion erfolgreich war, stoppen Sie die Blutung an der Injektionsstelle, indem Sie etwa eine Minute lang sanften Druck ausüben. Öffnen Sie am Ende des Vorgangs den Retraktor und setzen Sie die Maus in ihren Käfig, um Monozyten zu charakterisieren. Wir nutzen die Effekte mit einer Kombination von Antigenen, nämlich CD 11 B, F vier 80, CD 115 und GL eins.

Die Expression dieser Antigene korreliert mit einem Entwicklungsstadium für die Analyse der Monozyten. Wir haben die Fakten an Tag 0, 3, 5 und sieben gemacht, die Reinheit der Monozyten steigt am fünften Tag auf bis zu 90%. Um diese Reinheit zu erreichen, ist es wichtig, stark terrinische Makrophagen zu dezimieren.

Nicht-Terrinzellen werden durch die Verwendung von EDTA-freiem Waschpuffer erschöpft. Um die Terrinenzellen zu depletieren, verwenden wir EDTA, das Wash, Buffer und sanftes P Petting enthält. Dieses Diagramm zeigt die Hauptzelltypen für ihre One-End-Kultur.

Die verschiedenen gezeigten Zelltypen sind ein Lymphozyten, zwei Monozyten, drei Granulozyten, was die Reinheit der Monozyten nach dem fünften Tag erhöht. Und Kultur. Beachten Sie, dass die sich verändernde zelluläre Zusammensetzung während der Kultivierung der Zellpopulation einen Monozyten und zwei Makrophagen umfasst.

Abbildung zwei, Zeitleiste der CD 115-Expression während der Differenzierung. Beachten Sie, dass über 95% aller Zellen nach fünf Tagen Differenzierung CD 115-positiv sind, was darauf hindeutet, dass die überwiegende Mehrheit der Zellen entweder Monozyten oder Makrophagen sind. Die Klassifizierung kann auf Zellgröße und Granularität basieren, aber spezifische zelluläre Marker sind zuverlässiger.

Abbildung drei, Erhöhung der Expression der Reife von Monozyten-Makrophagen. Marker F vier 80, Tag fünf, zeigt das Erscheinungsbild einer Population mit intermediärer F vier 80-Expression, die mit dem Monozyten-Phänotyp übereinstimmt. Am siebten Tag ist die rechte Verschiebung der Expression von F vier 80 zu beobachten, die mit der Reifung der Makrophagen übereinstimmt.

Die Isolierung von Monozyten ist wichtig und essentiell für viele in vitro und in vivo Studien. Diese Zellen sind ein interessantes Ziel, zum Beispiel im Zusammenhang mit Erkrankungen wie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit oder der koronaren Herzkrankheit, die mit der Ischämie in Verbindung stehen. Knochenmark von FEMA und Tibia von Biopsiemäusen wird entnommen, indem die Knochen mit warmem Medium gespült werden, die Zellsuspension mit MCSF ergänzt und auf extrem niedrigen Anhaftungsflächen kultiviert wird, um Adhäsion zu vermeiden, die durch Adhäsion ausgelöste Differenzierung der Monozyteneigenschaften und die Differenzierung der Monozyten zu unterschiedlichen Zeitpunkten und Fakten mit Markern wie CD 11 b, CD 115 und FO 80 überprüft wird, um die Zellen zu phänotypisieren.

Wenn eine systemische Verabreichung von Medikamenten gewünscht wird, ist die intravenöse Injektion eine einfache und effektive Möglichkeit, dies zu tun. Wir haben die Methode beschrieben, um große Mengen an MI-Monozyten auf einfache und kostengünstige Weise aus dem Knochenmark zu isolieren. Mit dieser neuen Methode sind wir in der Lage, etwa 11 Millionen Monozyten pro Maus zu erzeugen.