Methoden zur Zytotoxizität und Immunsuppression mit brennbarem Tabakwaren Vorbereitungen Bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen der Zubereitung von Tabakprodukten auf die Zytokinsekretion und die Abtötung von Zielzellen durch P-BMCs zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst kultivierte P-BMCs mit Vollrauchzustand, Medium oder Nikotin behandelt werden und dann eine intrazelluläre Färbung der behandelten p-BMCs durchgeführt wird, um ihre Zytokinproduktion zu bestimmen. Alternativ werden CFSE-markierte K 5 62-Zellen mit vollrrauchkonditionierten mediumbehandelten PBMC-Effektorzellen co-kultiviert, und die Lebensfähigkeit der K 5 62-Zellen wird durch Sieben-A- bis d-Färbung qualifiziert.

Letztendlich werden die Auswirkungen der Zubereitungen aus brennbaren Tabakerzeugnissen auf die P-BMCs aus beiden Assays mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die Hauptvorteile unserer Techniken oder der bestehenden Methoden, wie z.B. dem Chrom-Release-Assay oder dem ALI-Spot, sind, dass unsere Methoden einen hohen Durchsatz haben, nicht radioaktiv sind und wir die Zellfunktionalität messen können. Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die biologischen Wirkungen von Tabakproduktzubereitungen geben.

Es kann auch zur Bewertung anderer Verbindungen angewendet werden, die die Tolike-Rezeptor-vermittelten und STIC-Funktionen von PBMC-Effektorzellen beeinflussen, bevor mit dem Färbeverfahren begonnen wird. Verdünnen Sie den gesamten Rauchzustand, das Medium und das Nikotin in den angegebenen Konzentrationen. In RPMI vollständiges Medium bis zu einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte.

Geben Sie dann 100 Mikroliter P-BMCs, suspendiert in vollständigem Medium in einer Konzentration von eins mal 10, zu den sechs Zellen pro Vertiefung, um ein Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung zu erhalten. Decken Sie dann die Platte ab und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach drei Stunden waschen Sie die Zellen und aspirieren den Überstand.

Decken Sie dann die Platte wieder ab und wirbeln Sie sie ein, um die Pellets zu dissoziieren. Waschen Sie die Zellen noch zwei weitere Male, einmal in eiskaltem Laufpuffer und einmal in vollständigem Medium nach der zweiten Wäsche. Behandeln Sie sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 mit 200 Mikrolitern Vollmedium, ergänzt mit Golgi Plug und LPS.

Dann die Zellen mit eiskaltem Laufpuffer waschen und nach 20 Minuten mit 100 Mikrolitern Cyto fix pro Vertiefung bei vier Grad Celsius behandeln, die Zellen dreimal mit eiskalter Dauerwelle waschen. Geben Sie dann 45 Mikroliter Zytodauerwelle in jede Vertiefung, gefolgt von fünf Mikrolitern jedes der aufgeführten Antikörper. Nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen dreimal waschen und in 200 Mikrolitern eiskaltem, 2%igem Formaldehyd fixieren.

Anschließend werden die Zellen in 12 mal 75 Millimeter große Röhrchen überführt und die Proben auf einem Durchflusszytometer analysiert. Nach der Zubereitung einer Platte mit Tabakerzeugnis, das wie gerade demonstriert behandelt wurde, wird eine Kultur von K 5 62-Zellen gewaschen, die mit einer Fluenz von 80 % Co in 10 Millilitern DPBS geerntet wurden. Wiederbelebung. Suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern DPBS und zählen Sie die Zellen.

Dann geben Sie einen Milliliter frisch zubereiteter CFSE-Arbeitslösung zu ein bis zwei mal 10 bis siebten K 5 62 Zellen in einen Milliliter Vollmedium und dispergieren Sie die Zellfärbung durch Vortexen. Inkubieren Sie die Zellen nach genau zwei Minuten bei Raumtemperatur, fügen Sie 200 Mikroliter FBS hinzu und wirbeln Sie die Zellen erneut vor und inkubieren Sie sie weitere zwei Minuten lang. Nach der zweiten Inkubation waschen Sie die Zellen in 10 Millilitern vollständigem Medium, resuspendieren Sie das Pellet dann in weiteren 10 Millilitern vollständigem Medium und zählen Sie die Zellen.

Nun werden die mit Tabak behandelten p BMCs zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Setzen Sie dann die Abdeckung wieder auf, resuspendieren Sie die Zellen durch Vortexen und waschen Sie sie in 200 Mikrolitern vollständigem Medium pro Well. Um den Tötungstest zu starten, fügen Sie die CFSE-markierten K 5 62-Zellen im Verhältnis eins zu 15 zum pbmc hinzu und inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Nach fünf Stunden schleudern Sie die Zellen herunter und entsorgen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Pellets durch Vortexen und waschen Sie dann die Zellen mit 200 Mikrolitern Laufpuffer pro Vertiefung, fügen Sie dann 95 Mikroliter Laufpuffer hinzu, gefolgt von fünf Mikrolitern mit sieben A und d für ein Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern pro Vertiefung. Zum Schluss inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten.

Geben Sie dann 100 Mikroliter Laufpuffer in jede Vertiefung und übertragen Sie das gesamte Volumen auf die entsprechenden Faxröhren, um den Prozentsatz von sieben a, a, d und CFSE-positiven Zellen zu bestimmen. Durch die durchflusszytometrische Analyse wird eine dosisabhängige Zunahme des Zelltods bei Vollrauch konditioniertem Medium nach 24 Stunden beobachtet, wobei fast 80% der Zellen bei vier Mikrogramm pro Milliliter Equin Nikotineinheiten abgestorben sind. Eine Behandlung der p BMCs für nur drei Stunden führt jedoch selbst bei fünf Mikrogramm pro Milliliter Equin Nikotineinheiten des ganzen rauchkonditionierten Mediums nach 24 Stunden nicht zu einer signifikanten Toxizität.

Ein vergleichbarer Grad des Zelltods wird vor der Behandlung mit 3000 Mikrogramm pro Milliliter Nikotin nach drei Stunden nicht festgestellt, die Nikotinbehandlung verursacht keinen messbaren Zelltod vor der Behandlung mit 2000 Mikrogramm pro Milliliter Konzentration mit Vollrauchzustand, Medium und Nikotin, gefolgt von der Stimulation des TLR-Vier-Rezeptors durch LPS, führt zu einer dosisabhängigen Abnahme der sezernierten Zytokine. Der Grad der Unterdrückung variiert jedoch zwischen den einzelnen Zytokinen. Des Weiteren, wenn Zellen nur sechs Stunden lang mit LPS und Golgi Plug behandelt werden, wird eine Abnahme der Anzahl intrazellulärer Zytokin-positiver Zellen nach Exposition gegenüber Vollrauch-Bedingungsmedium beobachtet, selbst bei den niedrigeren Konzentrationen von Equin Nikotineinheiten im Vergleich zur Nikotinexposition.

Tatsächlich zeigen die Ergebnisse dieses Abtötungsassays, dass die Exposition gegenüber 1,56 Mikrogramm pro Milliliter Vollrauchmedium die Abtötungsfähigkeit der Effektor-PBMC-Population im Vergleich zur Kontrolle und den niedrigeren Dosiskonzentrationen signifikant reduziert. Während die Nikotinbehandlung in hohen oder niedrigen Konzentrationen die Abtötungsfähigkeit der Effektor-PBMC-Population nicht beeinträchtigt, während diese Verfahren versucht werden. Es ist wichtig, bei der CFSE-Markierung sowie bei den Antikörperverdünnungen, der Markierungszeit und den Inkubationstemperaturen präzise zu sein.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Antikörpermarkierungstechniken in der Durchflusszytometrie einsetzen können, um die Auswirkungen von Tabakproduktzubereitungen oder anderen Behandlungen auf mononukleäre Zellen des peripheren Blutes zu bestimmen.