Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Schnittkulturen mit klarer Hippocampus-Topographie herzustellen und die Neurogenese im Gyrus dentatus des Hippocampus zu bewerten. Dazu werden die Hippocampusscheiben zunächst in einer Kulturschale kultiviert, die mit einer speziellen Membran versehen ist. Als nächstes werden die sich teilenden Zellen mit einem mitotischen Marker markiert.

Das markierte Gewebe wird dann in Abschnitte geschnitten. Schließlich werden die Schnitte mit immunhistochemischen Standardverfahren gefärbt, um neugeborene Neuronen zu identifizieren. Letztendlich wird die Immunhistochemie und Zellzählung verwendet, um die Zelldichte und die Zelleigenschaften zu messen.

Im Allgemeinen kann es für Personen, die neu in dieser Technik sind, eine Herausforderung sein, da sie viel Übung erfordert. Die visuelle Demonstration ist von entscheidender Bedeutung, da die Präparierschritte und der Prozess des Transfers von Gewebe von der Kulturplatte in das Vibramstadium schwer zu erlernen sein können. Adam Moza, ein Doktorand in unserem Labor, wird das Verfahren demonstrieren und mit einer sauberen Skalpellklinge die beiden Hemisphären eines isolierten Wickelgehirns auseinanderschneiden.

Setze die linke Hemisphäre zurück in die große Petrischale und lege die andere PS-Seite nach unten in Eis. Kalte Präparierlösung. Betrachten Sie die mediale Fläche der rechten Hemisphäre und identifizieren Sie den Randfornix.

Ein markantes Band weißer Substanz entlang des medialen Randes des Hippocampus durchtrennte den Fornix mit nur etwa 0,5 Zentimetern der Skalpellklinge. Mit zwei Mikrospateln. Entfernen Sie den Hippocampus, indem Sie den Spatel der rechten Hand auf den Hirnstamm legen und den darüber liegenden Kortex anheben.

Mit dem Spatel der linken Hand. Heben Sie die Hirnrinde sanft an, um den lateralen Ventrikel und die mediale Oberfläche des Hippocampus freizulegen. Eine weiße, geschwungene Linie.

Die FIA sollte nun sichtbar sein. Richten Sie die Krümmung des Spatels an der Krümmung des Fia aus und drücken Sie den Spatel vorsichtig unter den FIA, schieben Sie den Spatel nach links und fahren Sie entlang der rostralen Koppelachse, bevor Sie ihn in dorsaler Richtung anheben. Um den Hippocampus zu entfernen, geben Sie den Hippocampus in eine separate kleine Petrischale mit eiskalter Präparierlösung.

Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der linken Hemisphäre, um den linken Hippocampus zu entfernen. Sobald sie isoliert sind, bringen Sie die Nilpferd-Campi vorsichtig in die Gewebezerkleinererstufe. Ordnen Sie sie nebeneinander und parallel zueinander und senkrecht zur Achse des Häckselmessers an.

Verwende einen Pinsel, um das Taschentuch zu positionieren, und gib ein paar Tropfen der Präparierlösung auf das Nilpferd. Campi. Schneiden Sie das Gewebe in 400-Mikrometer-Scheiben, ohne eine Pause einzulegen, um einzelne Scheiben zu entfernen. Nachdem der gesamte Hippocampus geschnitten wurde, übertragen Sie die Schnitte mit einem Pinsel vorsichtig in eine kleine Petrischale mit Präparierlösung. Trennen Sie die schwebenden Scheiben unter einem Präpariermikroskop vorsichtig mit einem Mikros, einem Spachtel und einem Pinsel.

Nehmen Sie anschließend eine zuvor mit einem Kultureinsatz vorbereitete Kulturplatte aus dem Inkubator und setzen Sie diese in die Laminar-Flow-Haube ein. Ziehen Sie mit einem feuerpolierten PE oder einer Pipette vier bis fünf Scheiben auf und legen Sie sie auf die apikale Oberfläche der Kultur. Membran einsetzen.

Verwenden Sie einen Pinsel, um den Abstand anzupassen, und lassen Sie Platz zwischen den einzelnen Abschnitten und dem Rand der Kultur. Sobald das Stück in Position ist, entfernen Sie die überschüssige Präparierlösung von der apikalen Oberfläche der Membran. Legen Sie die Kulturplatte mit dem Serum, das das Kulturmedium und die Hippocampusscheiben enthält, bei 35 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zurück in den Inkubator.

Füttern Sie die Kulturen zwei Tage nach der Dissektion in einer sterilen Laminar-Flow-Haube. Aspirieren Sie zuerst das alte Kulturmedium und geben Sie dann einen Milliliter frisches Serum mit Medium in die Vertiefungen. Setzen Sie den Kultureinsatz vorsichtig mit einer sterilisierten Glaspipette wieder auf und achten Sie darauf, alle Luftblasen zu entfernen, die sich möglicherweise unter der Membranoberfläche gebildet haben.

Wechseln Sie nach der ersten Fütterung das Medium alle zwei Tage. Um die Reifung und Integration von gezahnten Körnerzellen zu untersuchen, wechseln Sie das Fütterungsmedium auf eines mit einem Thymidin-Analogon und inkubieren Sie es zwei Stunden lang bei 35 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Inkubation das analoghaltige Medium und ersetzen Sie es durch normales Fütterungsmedium.

Um den normalen Fütterungsplan zum gewünschten Zeitpunkt fortzusetzen. Nehmen Sie die Kulturplatte heraus und entfernen Sie das Nährmedium. Fügen Sie als Nächstes jeder Kultur einen Milliliter 4%PFA hinzu.

Mit Paraform gut versiegeln und am nächsten Tag 24 Stunden bei vier Grad Celsius lagern. Entfernen Sie das Fixiermittel und fügen Sie einen Milliliter PBS mit Natriumazid-Dichtung hinzu und lagern Sie die Platten wie zuvor gezeigt. Wenn Sie zum Schneiden bereit sind, schneiden Sie mit einem Skalpell vorsichtig entlang des Umfangs des kreisförmigen Einsatzes und übertragen Sie die abgelöste Membran in eine Petrischale, die PBS enthält.

Nach dem Spülen wird die Membran mit einer Pinzette auf die Vibrationsmontagebühne übertragen. Verwenden Sie anschließend ein Skalpell, um die überschüssige Membran zu entfernen, die zwei bis drei Scheiben umgibt, die zum Schneiden sauberer Kanten ausgewählt wurden. Die Hilfe beim Trennen stellt sicher, dass die Membran flach ist und leicht an der Schnittfläche haften kann.

Geben Sie ein bis zwei Tropfen Klebstoff auf die Vibram-Schneidestufe und verteilen Sie ihn in einer gleichmäßigen Schicht. Verteilen Sie den Kleber mit einer 22-Gauge-Nadel schnell in einer rechteckigen Form mit einer langen Kante parallel zur Schneidklinge. Übertragen Sie die zugeschnittene Membran mit einer Pinzette auf den Kleber in der Schneidephase und stellen Sie sicher, dass beim Trocknen des Sekundenklebers keine Luftblasen entstehen.

Übertragen Sie die Vibram-Stufe zurück in die PBS-haltige Petrischale. Bereiten Sie die Vibram-Klinge und eine 48-Well-Platte mit Natriumazid vor, um die Gewebeschnitte aufzubewahren. Verwenden Sie das Vibrato, um 30-Mikrometer-Schnitte von organtypischem Schnittgewebe zu erzeugen.

Übertragen Sie die Schnitte zur Lagerung und anschließenden immunhistochemischen Färbung auf eine 48-Well-Platte, die PBS mit Natriumazid enthält. Führen Sie immunhistochemische Standardfärbeverfahren durch, indem Sie PBS nacheinander durch Lösungen ersetzen, die Primär- und Sekundärantikörper enthalten, und die Schnitte in diesen Lösungen für die gewünschte Zeit inkubieren. Diese Fluoreszenzmikroskop-Fotografien zeigen die erhaltene Morphologie des Hippocampus in Kultur.

Hier wurden organotypische Schnitte immunmarkiert für Chlor, Desoxy, Uridin und Calbindin. Hier ist eine mikrographische Probenaufnahme eines Scheibenimmuns zu sehen, das für CLDU und Doppelcottin markiert ist. Das linke Bild zeigt ein Neuron, das mit Doppelcottin beschriftet ist.

Das mittlere Bild zeigt einen mit Chlordesoxyuridin markierten Kern. Das rechte Bild zeigt beide Marker überlagert, um ein reifes Neuron zu veranschaulichen. Das linke Bild zeigt einen mit Chlordesoxyuridin markierten Kern.

Das mittlere Bild zeigt ein Neuron, das mit Kuhbindung markiert ist. Das Bild auf der rechten Seite zeigt beide Marker übereinandergelegt, um ein reifes Neuron nach diesem Verfahren zu veranschaulichen. Andere Techniken, wie z.B. die in vivo Immunhistochemie, können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu stellen, wie z.B.: Wie ist die neuronale Entwicklung in Kultur im Vergleich zur neuronalen Entwicklung in vivo, insbesondere im erwachsenen Gehirn?