Name: Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von organotypischen Hippocampus-Schnittkulturen zur Untersuchung der postnatalen Neurogenese im Gyrus dentatus. Diese Methode ermöglicht die Markierung teilender Zellen und immunhistochemische Analyse.

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Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium unterstützt, das MOP JMW vom Canadian Institute of Health Research 119271 hat. Die Autoren danken Frau Yao Fang Tan für ihre hervorragende technische Unterstützung.

HINWEIS: Alle Tierverfahren gemäß den zum Tiergesundheit und Tier Richtlinien der Abteilung für Vergleichende Medizin an der Universität von Toronto. 1. Herstellung von Schnitten des Hippocampus <ol><li> Sterilisieren Sie die folgenden Instrumente mit dem Trocken Autoklaven bei 125 ° C: Skalpellgriff (# 3) (2), Standard-Muster Pinzetten, groß (1), Kleine Dissektor Scheren (abgewinkelt zu Seite) (1), Micro Löffel (Löffel und Flach Spachtel Enden) (1), Mikro-Spatel (abgerundet und aufgerundet verjüngten Enden) (2), Gourmet Pinsel (1), poliert Feuer Pasteur-Pipette (2), Gaze Plätze, 2 x 2 Zoll (5). </li><li> Wenn sterile, legen Sie die Instrumente in einen sterilen Behälter und halten bis zum Gebrauch überdachte. Unmittelbar vor der Dissektion, tauchen Instrumente in einer 70% igen Ethanollösung. </li><li> Bereiten Sie eine 6-Well-Kulturplatte mit Kultureinsatzes vor Beginn der Dissektion Verfahren durch Zugabe von 1 ml Kulturmedium / Vertiefung und Speichern der Platte in den Inkubator bei 35 ° C einnd 5% CO 2. </li></ol> 2. Ordnen Sie Dissection Werkzeuge in sterilen Laminarströmungshaube <ol><li> Sprühen Sie das Steril mit 70% Ethanol und entfernen sterilisiert Dissektionsinstrumente von Alkohol. Ermöglichen, dass die Instrumente zu trocknen, während auf eine sterile Petrischale ruhen, um den Kontakt zwischen dem Alkohol und dem sezierten Hirngewebe zu vermeiden. </li><li> Kaution 5-7 ml sterilisiertem eiskalten Sezieren Lösung in 2 große sterile Petrischalen. Ein Gericht wird zu kühlen und reinigen Sie den Kopf (dirty), die andere zum Kühlen und Spülen der ausgehöhlt Gehirn (clean). Platzieren eines sterilisierten Filterpapier in einer Petrischale Deckel zum Zerlegen das Gehirn. </li><li> Legen Sie eine kleine, sterilisierte Filterpapier in einem der kleinen Petrischale Deckel zum Präparieren Sie das Hippocampus. Kaution 3-5 ml sterilisiertem eiskalten Sezieren Lösung in 2 kleine, sterile Petrischalen. Ein Gericht wird den ausgehöhlt Hippocampus zu halten, wird man Abschnitte während der Abtrennung des Hippocampus Abschnitte haltenunter Dissektionsmikroskop. </li><li> Bereiten Sie das Gewebe Chopper durch Abkleben ein Stück Filterpapier sterilisiert an die Schneidphase und Montage einer sterilen Rasierklinge. Befeuchten Sie das Filterpapier mit sterilisierten Sezieren Lösung. </li><li> Sprühen Sie eine saubere Bio-Beutel mit Alkohol und legen Sie sie in eine laminare Strömung Sterilbank. </li></ol> 3. Hippocampus Dissection <ol><li> Sprühen Sie das P7 Sprague-Dawley Rattenjungen mit 70% Ethanol außerhalb der laminaren Strömung Sterilbank und schnell zu enthaupten, das Tier mit großen sterilen chirurgischen Schere in der Sterilbank. Lassen Sie den Kopf fallen in eiskaltes Sezieren Lösung in einem der Petrischalen. </li><li> In der Petrischale, spülen Sie das Blut und schnell überweisen Sie den Kopf zu sterilisierende Filterpapier, Bauchseite nach unten. </li><li> Verwendung des Skalpell entlang der Rückenfläche in der sagittalen Ebene schneiden die darunterliegende Schädel freizulegen. Schnitt durch die Haut, aber nicht die darunter liegenden Knochen, die weich und bei Ratten t leicht durchlässig istsein Alter. Beiseite dieses &quot;dirty&quot; Skalpell und nicht auf Hirngewebe zu verwenden nicht. </li><li> Mit den kleinen Dissektor Schere (abgewinkelt zu Seite) und Zangen, aufgeschnitten den Schädel entlang Pfeilnaht des Schädels zu Bregma, die anatomische Punkt auf dem Schädel, wo die Kranznaht senkrecht durch die Pfeilnaht durchschnitten. Verwenden einer Pinzette, um Schädel Klappen von der Mittellinie des Schädels auf und davon ziehen. </li><li> Setzen Sie den Mikrolöffel an der Unterseite des Gehirns, unter der Hirnstamm, zu heben, das Gehirn aus dem Schädel. Heben Sie das Gehirn, um die Sehnerven und Riechkolben auf die basale Oberfläche des Gehirns aus. Schneiden Sie diese Strukturen mit einer kleinen Schere vollständig zu lösen, die das Gehirn vor den Schädel. Entfernen Sie und übertragen Sie die intakten Gehirn auf die andere große Petrischale mit eiskaltem Sezieren Lösung. </li><li> Mit dem Mikrolöffel, übertragen das Gehirn auf eine kleine Petrischale Deckel, die steriles Filterpapier. Mit einer sterilen Pasteurpipette gründlich das Gehirn mit ein paar Tropfen disschneidenden Lösung, um Gewebe feucht zu halten. </li><li> Mit Hilfe eines &quot;sauberen&quot; Skalpell schneiden die beiden Halbkugeln auseinander. Übertragen Sie die linke Hemisphäre wieder in großen Petrischale mit Mikrolöffel und legen Hemisphäre pia Seite nach unten in eiskaltem Sezieren Lösung für die spätere Verwendung. </li><li> Sehen Sie sich die medialen Fläche des rechten Hemisphäre und Identifizierung der Randgewölbe, eine herausragende Band aus weißen Substanz entlang der medialen Rand des Hippocampus. Mit einem sterilen Skalpell, einen sagittalen Schnitt durch das Scheidengewölbe, aber darauf achten, denn nur 0,5 cm des Skalpells Spitze wird ausreichen, um den Fornix schneiden. </li><li> Mit 2 Mikro-Spatel, entfernen Sie die ersten Hippocampus vom rechten Hemisphäre, indem Sie den rechten-Spatel auf den Hirnstamm und Anheben des darüber liegenden Kortex mit der linken Spachtel. Heben Sie die Rinde, die Seitenventrikel und mediale Fläche des Hippocampus zu offenbaren. Eine weiße geschwungene Linie, die Fimbria, sollte jetzt sichtbar sein. </li><li> Richten Sie die Krümmung der Spatel mit der Curvatur der Fimbrien und vorsichtig auf die Spachtel unter der Fimbrien. Schieben Sie den Spatel nach links und fahren Sie entlang rostral-kaudale Achse und heben Spachtel in dorsale Richtung Hippocampus zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie den Hippocampus zu einem 2. kleinen Petrischale mit eiskaltem Sezieren Lösung. Wiederholen Sie den Vorgang auf der linken Hemisphäre, um den linken Hippocampus zu entfernen. </li><li> Mit einem Mikrospatel, sorgfältig die hippocampi Transfer zum Gewebe Chopper Bühne. Ordnen sie benachbart und parallel zueinander und senkrecht zu der Achse der oszillierenden Klinge. Verwenden Sie einen Pinsel, um das Gewebe zu positionieren und ein paar Tropfen des Präparationslösung auf der Oberseite des Hippocampus. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe in 400 &amp; mgr; m Scheiben ohne Pause zu einzelnen Scheiben zu entfernen (in der Regel werden sie nicht an der Klinge haften). Nach den ganzen Hippocampus geschnitten worden ist, verwenden Sie den Pinsel, um vorsichtig zu übertragen die Abschnitte zu einem 2. kleinen Petrischale mit Dissektion Lösung. </li><li> Unter Anzeigeissecting Mikroskop vorsichtig trennen die schwimmenden Scheiben mit amicro-Spachtel und Pinsel. </li><li> Entfernen Sie die vorbereiteten Kulturplatte mit Kultureinsatzes aus dem Inkubator und in eine Sterilbank. </li><li> Mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette, ziehen 4-5 Scheiben in die Pipette und Transfer Scheiben an die apikale Oberfläche der Kultureinsatzes Membran. Als nächstes stellen Sie die Position mit einem Pinsel und lassen Raum zwischen einzelnen Abschnitte und der Grenze des Kultureinsatzes. </li><li> Mit einer sterilen Pasteur-Pipette, entfernen Sie das überschüssige Sezieren Lösung von apikalen Oberfläche der Membran. HINWEIS: Beim Entfernen Lösung vermeiden Zeichnung Gewebeschnitte in die Pipette. Alternativ können Sie einen regelmäßigen Pipette (P200 oder P1000) mit sterilisierten Pipettenspitzen langsam entfernen Lösung. </li><li> Platzieren der Kulturplatte mit serumhaltigem Kulturmedium und den Hippocampus wieder in den Inkubator bei 35 ° C und 5% CO 2. HINWEIS: Wenn Experiment Anrufezur Erzeugung von Kulturen aus verschiedenen Tieren, gründlich zu reinigen die laminare Strömung Sterilbank zwischen Dissektionen. Zurück Instrumente Alkohollösung und ersetzen Sie alle Petrischalen, Filterpapiere und sterilen Rasierklingen vor der zweiten Sektion. </li></ol> 4. Fütterung und Pflege von organotypischen Slices <ol><li> Futterkulturen in einem sterilen laminaren Strömung Sterilbank. </li><li> Führen Sie die erste Fütterung der kultivierten Abschnitten 2 Tage nach der Präparation. Saugen Sie alte Kulturmedium unter Verwendung sterilisiert Glaspipette. </li><li> Sterile 5 ml serologische Pipette 1 ml frisches, steriles, Serum enthaltendem Medium zu den Vertiefungen hinzu. </li><li> Ersetzen Sie vorsichtig die Kultureinsatzes und kümmern uns um die Luftblasen, die unter Membranoberfläche gebildet haben können. </li><li> Nach der ersten Fütterung, jeden zweiten Tag geändert Medium. </li></ol> 5. Inkubation von Gewebeschnitten mit Thymidin-Analoga zu Newborn Neuronen Beschriften <ol><li> Um zu untersuchen,die Reifung und Integration von dentatus Körnerzellen im Hippocampus, brüten die organotypische Scheiben mit einer Thymidinanalogon wie Bromodeoxyuridine (BrdU) oder Chlorodeoxyuridine (CldU). Hier verwenden wir CldU aufgrund seiner höheren Löslichkeit in Salzlösung. </li><li> Nach 3DIV wird mit 1 ul 10 mg / ml Stammlösung CldU in Kochsalzlösung auf 1 ml Kulturmedium bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml. Wenn BrdU verwendet wird, korrigieren Sie die Konzentration für die Unterschiede im Molekulargewicht. Hinzufügen Medium mit CldU Kultur Vertiefungen inkubieren Gewebes mit CldU haltige Medium für 2 Stunden bei 35 ° C. </li><li> Nach 2 Stunden Inkubation bei 35 ° C, entfernen Sie die CldU haltigen Mediums und Ersetzen mit regulären Fütterungsmedium zur normalen Ernährungsplan (siehe oben) wieder aufzunehmen. </li></ol> 6. Gewebefixierung und Lagerung <ol><li> Stellen Sie einen Zeitplan für die Anwendung Behandlungen und Befestigungsgewebeproben vor Beginn der Kulturexperimenten (2B). </li> &lt;li&gt; Bei einem vorbestimmten Tag nach der Dissektion, bereiten Sie die folgenden in einem Laborabzug: a 10-50 ml Becherglas mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS); ein leeres Becherglas verworfen Kulturmedium; kleine Zange; und ein 1.000 ml-Pipette mit Einwegspitzen. </li><li> Entfernen Sie die Kulturplatte (n) aus Inkubationskammer und Transfer zu einem Abzug. Kippen Sie die einzelnen Well-Platte Einsätze mit einer Pinzette. Als nächstes mit einer Pipette Kulturmedium und in ein Becherglas zur Verfügung zu entfernen. Schwenk der Kulturplatte in einem Winkel, um sicherzustellen, dass alle Kulturmedium entfernt. </li><li> Beenden Entfernen Medium für eine Kulturplatte zu einer Zeit. Als Medium wurde entfernt, 1 ml von 4% PFA zu jeder Kultur gut und Siegel gut mit Parafilm zu plattieren. Wiederholen für so viele Kulturplatten als notwendig und Übertragungsplatten in den Kühlschrank bei 4 ° C für 24 Stunden. </li><li> Nach 24 Stunden, bereiten Sie die folgenden in einem Abzug: 10-50 ml Becherglas mit 0,1% Natriumazid in PBS; eine leereBecherglas verworfen PFA (folgen Sie Sicherheitsvorkehrungen, wenn das Verwerfen giftige Stoffe); kleine Zange; und 1000 ml-Pipette mit Einwegspitzen. </li><li> Gehen Sie wie unter 6.4 für das Hinzufügen von PFA umrissen, aber 1 ml PBS mit Natriumazid statt. Einmal vollständig übertragen, Dichtungs Mikrotiterplatten für die zukünftige Verwendung durch Umwickeln Kanten in Parafilm und Lagerung im Kühlschrank bei 4 ° C. </li></ol> 7. Schnitte Gewebe für die Immunhistochemie <ol><li> Führen Schneiden mit einem Vibratom Gewebe. Die folgende Reihe von Schritten zur Maximierung der Ausbeute an verwertbarem Gewebeschnitte von organotypischen Kulturen. HINWEIS: Unmittelbar im Anschluss an hippocampale Dissektion und beschichteten Scheiben, hat das Gewebe eine Dicke von etwa 400 um. Jedoch nach 2-3 Wochen in der Inkubationskammer werden Gewebeschnitte beginnen zu glätten, was in einem letzten Abschnitt Dicke von 150-300 &amp; mgr; m. </li><li> Bereiten Sie Folgendes vor dem Kapitel gezüchtete Gewebe: ein # 11 Skalpell blade und Griff, eine Glaspetrischale mit eiskaltem PBS, eine Mikrodissektion Zangen, und eine saubere Schnitt Vibratom Bühne, um Gewebe zu befestigen. </li><li> Verwenden ein Skalpell vorsichtig entlang des Umfangs des kreisförmigen Einsatz Membran geschnitten, so dass sie von den Kunststoffeinsatz Gehäuse gelöst werden. Lassen Sie genügend Raum zwischen der kultivierten Scheibe und dem Skalpell. </li><li> Übertragen Sie die freistehende Einsatz Membran auf eine Petrischale mit PBS. Nach dem Spülen in PBS verwenden Zange, um die Membran zu der Vibratom Montagetisch zu übertragen. </li><li> Als Nächstes verwenden Sie das Skalpell, um überschüssige Membran umgibt kultivierten Scheiben zu beseitigen und schneiden Sie überschüssiges Material um saubere Kanten zu schaffen. Dieser Schritt wird die Membran sicherzustellen ist flach und kann leicht an der Schnittfläche entsprechen. </li><li> Zeigen 1-2 Tropfen Kleber auf der Vibratom Schneid Bühne und verteilt in gleichmäßige Schicht mit einer 22 G-Nadel. Verbreiten Klebstoff in einer rechteckigen Form mit der langen Seite parallel zu der Schneidklinge der Vibratom. Führen Sie diesen Schrittschnell, um den Klebstoff vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um das zugeschnittene Membran, die Hippocampus-Schnitten an der Schneidphase zu übertragen und vorsichtig positionieren Sie die Membran auf Kleber und sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen. </li><li> Wie der Sekundenkleber trocknet, übertragen Sie die Vibratom Bühne mit dem Klebemembran zurück in die PBS, die Petrischale. Bereiten Sie die Vibratom Klinge und eine 48 Well-Platte mit Natriumazid, um Gewebeschnitte zu speichern. </li><li> Verwenden Sie die Vibratom bis 30 um Abschnitte der organotypischen Gewebe und in ein 48-Well-Platte, die Natriumazid enthalten, abgespeichert und dann immunhistochemischen Färbung zu erzeugen. </li><li> Siehe Protokolle zur immunhistochemischen Färbung 26,29 vorbestehenden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Nach CldU (oder BrdU) Verabreichung kann die Zeitleiste der Anwendung von pharmakologischen Mitteln ausgewählt werden, um neugeborene DGCs während bestimmter Entwicklungs Fenster Ziel. Zum Beispiel kann eine hypothetische Mittel während der zweiten Woche nach der CldU Injektion, die vorgeschlagen wird, mit dem Alter der unreifen Neuronen, die zu einem Entwicklungsstadium sind, wo GABA depolarisierende übereinstimmen angewendet werden. Zukünftige Studien unter Verwendung dieses Protokolls kann die pharmakologische Mittel...

Die adulte Neurogenese im Hippocampus von Säugetieren stellt ein bemerkenswertes Beispiel für die angeborene Fähigkeit des Gehirns zur Anpassungsfähigkeit und Plastizität dar. Dentatäre Körnerzellen (DGCs) werden aus einem erneuerbaren Pool neuraler Vorläuferzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus erzeugt, der eine der beiden derzeit gut charakterisierten neurogenen Regionen im Gehirn von Säugetieren ist und als besonders wichtig für das Lernen und das Gedächtnis gilt. Der Hippocampus ist Teil des limbischen Systems und befindet sich tief im Gehirn von Säugetieren, was ihn zu einem schwierigen Ziel für präzise pharmakologische Manipulationen macht. Darüber hinaus wurde eine aberrante Neurogenese mit Erkrankungen wie Epilepsie, Schizophrenie und Alzheimer in Verbindung gebracht, was das Interesse am Verständnis des Einflusses verschiedener pharmakologischer Wirkstoffe auf die Reifung und das Überleben neugeborener Neuronen geweckt hat. Die Unterscheidung zwischen postnataler und adulter Neurogenese ist verschwommen, und frühere Studien haben gezeigt, dass viele Merkmale der neuronalen Entwicklung in vivo in der frühen postnatalen Periode und im Erwachsenenalter ähnlich sind25. Hier legen wir den Schwerpunkt auf die postnatale Neurogenese und schlagen mögliche Anwendungen für die adulte Neurogenese vor.
Organotypische Schnittkulturen bieten eine effiziente in vitro Methode zur Untersuchung verschiedener physiologischer Eigenschaften des Hippocampus von Säugetieren. Der Wert von Schnittkulturen, die aus Nagetiergehirnen hergestellt wurden, lässt sich in drei Hauptqualitäten zusammenfassen: 1) Das Protokoll ist unkompliziert und erfordert leicht verfügbare Materialien; 2) Schnittkulturen ermöglichen pharmakologische Studien, die komplexe Variablen wie die tiefe anatomische Lage des Hippocampus eliminieren und die Blut-Hirn-Schranke umgehen1; und 3) die gut charakterisierte Struktur des Hippocampus und des trisynaptischen Schaltkreises bleibt erhalten2. Frühere Forscher haben die organotypische Hippocampuskultur verwendet, um die synaptische Entwicklung und Physiologie3,4, die Gliogenese5-7, die ischämische Hirnschädigung8,9, die Neuroprotektion und Neuroreparatur10-12 sowie die Epilepsie13-15 zu untersuchen. Die Schnittkulturen könnten auch ein nützliches Modellsystem darstellen, das die Überwachung der Zellentwicklung in Verbindung mit der Markierung von Zellen mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder anderen lebenswichtigen Markern ermöglicht.
Schnittkulturen wurden bereits früher verwendet, um die postnatale Neurogenese des Hippocampuszu untersuchen 16-19, aber ein wichtiger Faktor in der Mehrzahl dieser Studien ist die gut charakterisierte Degeneration, die aus der Explantation von Gewebe von adulten Tieren nach etwa 2 Wochen in vitro resultiert 20,21. Aus diesem Grund werden Schnittkulturen in der Regel von frühen postnatalen (P5-P10) Mäusen oder Rattenbabys hergestellt, wobei die verbesserte Lebensfähigkeit von frühem postnatalem Hirngewebe für die Kultivierung genutztwird 22. Während frühere Studien gezeigt haben, dass sich der frühe postnatale und der adulte Hippocampus in Bezug auf die synaptische Physiologie und die Expression spezifischer neuronaler Subtypen unterscheiden23,24, gibt es eine wesentliche Konservierung des choreografierten Entwicklungsprogramms, das neugeborene Körnerzellen während der Reifung durchlaufen25. Darüber hinaus deuten neuere Studien darauf hin, dass die physiologischen Eigenschaften von neugeborenen DGCs in Kultur denen unreifer Neuronen in der akuten Hippocampus-Schnittpräparation sehr ähnlich sind16.

<table><tbody><tr><td>5-Chlor-2'-Desoxyuridin (CldU)</td><td>MP Biomedicals</td><td>105478</td><td>Gefährliche, krebserregende</td></tr><tr><td>Zellkultureinsätze, 30 mm Durchmesser, 0,4 & Mikro; m Porengröße</td><td>Thermo scientific &nbsp;</td><td>Die 140660</td><td>Nuclon-Delta-Beschichtung auf diesen Einsätzen sorgt für eine bessere Gewebehaftung und verbessert die Schnittqualität.</td></tr><tr><td>Konische Zentrifugenröhrchen (steril)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Dissektorschere (zur Seite abgewinkelt)</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>Minimum an essentiellem Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11095; flüssig</td><td>Bei 4 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Eclipse Ni-U Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleber für Gewebe</td><td>Krazy Glue</td><td>KG585</td><td>Verwenden Sie eine minimale Menge an Klebstoff, um eine Haftung zu erreichen, da jegliches Gewebe, das dem Klebstoff ausgesetzt ist, für IHC unbrauchbar ist.</td></tr><tr><td>Hank' s Ausgewogene Salzlösung (HBSS) (500 ml)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Bei 4 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Pferdeserum Hitzeinaktiviert (500 ml)</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>50 ml Aliquote herstellen und bei -20 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clarke</td><td>TW 31KYPBX</td><td></td></tr><tr><td>Modifizierte Glaspipetten (Unterseite der Pasteurpipette entfernt und Kante mit Bunsenflamme geglättet)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale (100 mm x 15 mm) und (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Brand</td><td>FB0875712 und FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff #3</td><td>Fein Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>Sorfa Medical Plastic Co.</td><td>P8050</td><td></td></tr><tr><td>Standardmusterzange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Vakuumfilter</td><td>Thermo-Scientific</td><td>565-0020</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14054-13</td><td></td></tr><tr><td>Spritzengetriebene Filtereinheit</td><td>Millipore-Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Gewebehacker mit beweglichem Tisch</td><td>Stoelting& nbsp;</td><td>51425</td><td></td></tr><tr>Pinsel <td></td><td></td><td></td><td>mit feiner Spitze</td></tr></tbody></table>

organotypischen kulturen für studien der postnatale neurogenese

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese im Gehirn von Nagetieren mit dem organotypischen Kulturtechnik. Diese Methode behält die charakteristische topografische Morphologie des Hippocampus und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Mitteln für die Entwicklungs Gyrus dentatus des Hippocampus. Zusätzlich können Gewebekulturen für bis zu 4 Wochen aufrechterhalten werden, und somit erlauben, die Reifung von neugeborenen Körnerzellen zu untersuchen. Schnittkulturen ermöglichen eine effiziente pharmakologische Manipulation von hippocampalen Schnitten unter Ausschluss komplexen Variablen wie Unsicherheiten in den tiefen anatomischen Lage des Hippocampus sowie der Bluthirnschranke stehen. Aus diesen Gründen haben wir versucht, organotypischen Kulturen für postnatale Neurogenese Forschung gezielt zu optimieren.

Feststellen, ob organotypischen Kulturen wäre geeignet für adulte Neurogenese Forschung erforderlich, dass sie zwei Hauptkriterien erfüllen: 1), dass Scheiben halten charakteristischen morphologischen Merkmale der Hippocampus nach 10-21 Tagen in vitro (DIV), und 2) dass neugeborene DGCs quantifiziert werden mit Standard-immunhistochemischen Techniken, die üblicherweise in der adulten Neurogenese Forschung beschäftigt. In Bezug auf das erste Kriterium, 1A und 1B markieren Sie de...

Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung Hippocampus postnatale Neurogenese mit dem organotypischen Kulturtechnik. Dieses Verfahren ermöglicht die in vitro Manipulation von Neurogenese und ermöglicht die direkte Anwendung von pharmakologischen Wirkstoffen an die kultivierten Hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Schnittkulturen mit klarer hippocampaler Topographie herzustellen und die Neurogenese im Gyrus dentatus des Hippocampus zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zuerst hippocampale Schnitte in einer Kulturschale mit einer speziellen Membran kultiviert werden. Anschließend werden die sich teilenden Zellen mit einem mitotischen Marker markiert.Das markierte Gewebe wird anschließend in Schnitte zerlegt. Schließlich werden die Schnitte mithilfe standardmäßiger immunhistochemischer Verfahren gefärbt, um neugebildete Neuronen zu identifizieren. Letztendlich kommen Immunhistochemie und Zellzählung zum Einsatz, um die Zelldichte und Zelleigenschaften zu bestimmen.Im Allgemeinen kann es für Personen, die mit dieser Technik neu sind, herausfordernd sein, da sie viel Übung erfordert. Eine visuelle Demonstration ist entscheidend, da die Dissektionsschritte und der Vorgang des Übertragens des Gewebes von der Kulturplatte auf die Vibram-Stage schwer zu erlernen sein können. Die Durchführung der Prozedur wird Adam Moza, ein Doktorand in unserem Labor, demonstrieren, der mit einer sauberen Skalpellklinge die beiden Hemisphären eines isoliert

organotypic-slice-cultures-for-studies-of-postnatal-neurogenesis

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Organotypischen Kultur der E18 Gehirn von Ratten

Wir beschreiben eine Methode zur organotypischen Schnitten des Hippocampus, die leicht auf andere Hirnregionen angepasst werden vorbereiten können. Hirnschnitten sind auf porösen Membranen und Kulturmedien ist erlaubt, um eine Schnittstelle bilden gelegt. Diese Methode schont die grobe Architektur des Hippocampus für bis zu 2 Wochen in Kultur.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Eine Methode zur organotypischen Slices aus dem E12.5 murinen embryonalen Mittelhirns zu erzeugen, ist beschrieben. Die organotypischen Kulturen verwendet, um das Verhalten von dopaminergen Neuronen oder anderen ventralen Mittelhirn Nervenzellen zu beobachten.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

Um eine rasche Beurteilung der Funktion von Genen in der Entwicklung der Hirnrinde führen, beschreiben wir Verfahren, die...

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Herstellung von organotypischen Hippocampus-Schnittkulturen aus dem Gehirn eines Rattenwelpen. Es beschreibt die Schritte bei der Dissektion des Hippocampus, das Schneiden und die Kulturbedingungen, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit und das Wachstum der Zellen in den Hippocampus-Schnitten zu fördern und letztendlich organotypische Schnittkulturen zu erzeugen.

Präparation von organotypischen Schnittkulturen aus dem Hippocampus eines Rattenwelpen

Eine Technik zur Untersuchung von NG2-Zellen und Oligodendrozyten unter Verwendung eines Schnittkultursystems des Vorderhirns und des Kleinhirns wird beschrieben.  Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Dynamik der Proliferation und Differenzierung von Zellen innerhalb der Oligodendrozytenlinie, bei der die extrazelluläre Umgebung leicht manipuliert werden kann, während die Zytoarchitektur des Gewebes erhalten bleibt.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

Ein Protokoll zur Vorbereitung frei schwebender Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn wird vorgestellt. Das Protokoll ist eine Variation der weit verbreiteten Slice-Kultur-Methode mit Membraneinsätzen. Es ist einfach, kostengünstig und wird für die Durchführung von kurzfristigen Assays empfohlen, die darauf abzielen, Mechanismen der Neurodegeneration hinter altersbedingten Hirnerkrankungen zu entwirren.

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Organotypische Scheibenkulturen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um neuroentwicklungsfördernde oder degenerative/regenerative Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das den neuroentwicklungsbedingten Tod von Purkinje-Zellen in Maus-Kleinhirn-Scheibenkulturen modelliert. Diese Methode kann die Forschung in neuroprotektive Arzneimittel Entdeckung profitieren.

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Lernen Sie die Herstellung von organotypischen Hippocampus-Schnittkulturen zur Untersuchung der postnatalen Neurogenese im Gyrus dentatus. Diese Methode ermöglicht die Markierung teilender Zellen und immunhistochemische Analyse.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

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