Name: Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie die elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung synaptischer Verbindungen in akuten Hirnschnitten mit Patch-Clamp-Techniken. Diese Methode ermöglicht die korrelierte Analyse neuronaler Mikroschaltkreise.

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Wir danken allen Mitgliedern der Gruppe 'Funktion neuronaler Mikroschaltkreise' am Institut für Neurowissenschaften und Medizin, INM-2, Forschungszentrum Jülich und der Gruppe 'Funktion kortikaler Mikroschaltkreise' in der Klinik für Psychiatrie, Psychotherapie und Psychosomatik, Medizinische Fakultät, JARA, RWTH Aachen für die fruchtbaren Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der DFG-Forschergruppe zur Fassrindenfunktion (BaCoFun) unterstützt.

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Gekoppelte Aufnahmen von synaptisch gekoppelt erregenden und / oder hemmenden Neuronen eine sehr vielseitige Vorgehensweise für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise. Nicht nur, dass diese Vorgehensweise erlauben es, synaptische Verbindungen zwischen Neuronen-Typen schätzen, sondern ermöglicht auch die Bestimmung der funktionellen Eigenschaften der Verbindung und der Morphologie der prä- und postsynaptischen Neuronen. Außerdem Agonisten und / oder Antagonisten kann leicht an Neuronen im Schnittpräparate angewendet we...

Neuronaler Schaltkreise zwischen zwei synaptisch gekoppelt Neuronen sind die Bausteine ​​von großer Netzwerke im Gehirn und sind die Grundeinheiten der synaptischen Informationsverarbeitung. Eine Voraussetzung für die Charakterisierung solcher neuronaler Schaltkreise ist, um die Morphologie und funktionellen Eigenschaften sowohl der prä- und postsynaptischen Neuronen Partner, die Art der synaptischen Verbindung (en) und dessen Aufbau und Funktionsmechanismus kennen. In vielen Studien synaptischer Verbindungen zumindest eines der Neuronen in einer Mikroschaltung ist nicht gut charakterisiert. Dies resultiert aus den relativ unspezifisch Stimulationsprotokolle oft in Studien synaptischer Verbindungen verwendet. Deshalb werden die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von präsynaptischen Neuron sind entweder gar nicht oder nur in einem ziemlich kleinen Ausmaß identifiziert (dh die Expression von Markerproteine ​​etc.). Gepaart Aufnahmen in Kombination mit intrazelluläre Färbung von Markern such als Biocytin, Neurobiotin oder Fluoreszenzfarbstoffe sind für die Untersuchung kleiner neuronaler Schaltkreise besser geeignet. Diese Technik erlaubt es vielen strukturellen und funktionellen Parameter eines morphologisch identifizierten synaptische Verbindung gleichzeitig zu untersuchen. So genannte &quot;einheitliche&quot; monosynaptische Verbindungen zwischen zwei Neuronen in beiden kortikalen und subkortikalen Hirnregionen 1-10 mit akuten Schnittpräparate untersucht. Zunächst wurden scharfe Mikroelektroden in diesen Experimenten verwendet; später wurde Patch-Clamp-Aufzeichnung, um Aufnahmen von synaptischer Signale mit einem niedrigeren Geräuschpegel und einer verbesserten zeitlichen Auflösung zu erhalten beschäftigt. Ein bedeutender technischer Fortschritt war die Verwendung von Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (IR-DIC) -Optik 11-14, eine mikroskopische Technik, deutlich verbessert die Sichtbarkeit und die Identifizierung von Neuronen im Gehirn Scheibe, so daß es möglich wurde to erhalten Aufnahmen visuell identifiziert synaptischen Verbindungen 15-17. In der Regel werden gepaart Aufnahmen bei akuten Scheibe Vorbereitungen abgeschlossen; nur wenige Publikationen sind Berichterstattung Aufnahmen von synaptisch verbundenen Neuronen in vivo 18-20. Der wichtigste Vorteil der gekoppelten Aufnahmen ist die Tatsache, dass eine funktionelle Charakterisierung kann mit einer morphologischen Analyse sowohl der Licht- und elektronenmikroskopischen Ebene kombiniert werden (siehe z. B., 7,16,21). Nach histochemische Verarbeitung wird das dendritische und axonale Morphologie des synaptisch verbundenen Neuronenpaar zurückzuführen. Anschließend ist es möglich, morphologische Merkmale, wie Länge, Raumdichte, Orientierung, Verzweigung usw. quantifizieren Diese Parameter können dann die Grundlage für eine objektive Klassifizierung eines bestimmten synaptischen Verbindung. Weiters ist im Gegensatz zu den meisten anderen Techniken zur Untersuchung neuronaler connecti verwendetvität, gepaart Aufnahmen ermöglichen auch die Identifizierung der synaptischen Kontakte für einheitliche synaptischen Verbindungen. Diese kann direkt unter Verwendung einer Kombination von Licht- und Elektronenmikroskopie 16,21-27 oder mit Kalzium-Imaging 28,29 von dendritischen Dornen erfolgen. Jedoch mit dem letzteren Ansatz nur exzitatorischen aber nicht hemmenden Verbindungen untersucht werden, wie es benötigt Calciumeinstrom über die postsynaptische Rezeptorkanäle. Zusätzlich zu einer genauen Analyse der synaptischen Übertragung in einem definierten neuronalen Mikro gepaart Aufnahmen auch die Untersuchung der synaptischen Plastizität Regeln 30,31 erlauben oder - in Kombination mit Agonist / Antagonist-Anwendung - die Modulation der synaptischen Übertragung von Neurotransmittern wie Acetylcholin 32 und Adenosin 33.

<table><tbody><tr><td>Verstärker</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triple</td><td>mit 2 - 3 Vorverstärkern</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td>Olympus BX51WI</td><td>mit 2 Kameraanschlüssen, einem 4X Objektiv und einem 40X Wasser-Immersionsobjektiv</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>Infrarot CCD Kamera</td></tr><tr><td>Workstation</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>mit einem motorisierten x-y-Tisch und einer motorisierten Fokusachse für das Mikroskop</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z Manipulatoren für 2 - 3 Vorverstärker</td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vibrations-Tisch</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida System</td><td>Mikrohellfeld</td><td></td><td>mit Neurolucida und Neuroexplorer Software</td></tr></tbody></table>

elektrophysiologische und morphologische charakterisierung neuronaler schaltkreise in akuten hirnschnitten mit paired-patch-clamp-aufnahmen

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Die Kombination von Patch-Clamp-Aufnahmen von zwei (oder mehr) synaptisch verbunden Neuronen (gepaart Aufnahmen) in akuten Hirnschnittpräparate mit gleichzeitiger intrazellulären Biocytin Füllung ermöglicht eine korrelierte Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Mit diesem Verfahren ist es möglich, durch ihre Morphologie und elektrophysiologische Antwort-Muster zu identifizieren und zu charakterisieren sowohl prä- und postsynaptischen Neuronen. Gepaart Aufnahmen erlauben die Untersuchung der Verbindungsmuster zwischen diesen Neuronen sowie die Eigenschaften von sowohl chemischen und elektrischen synaptischen Übertragung. Hier geben wir eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung der erforderlich ist, um zuverlässige gepaart Aufnahmen zusammen mit einer optimalen Erholung des Neurons Morphologie zu erhalten Verfahren. Wir beschreiben, wie Paare von Neuronen über chemische Synapsen oder Gap Junctions verbunden sind in Hirnschnittpräparate identifiziert. Wir werden darlegen, wie Nervenzellen wieder aufgebaut, um ihre 3D-Morphologie des dendrit erhaltenic und axonalen Domain und wie synaptische Kontakte identifiziert und lokalisiert. Wir diskutieren auch die Vorbehalte und Einschränkungen des gekoppelten Aufnahmetechnik, insbesondere solche mit dendritischen und axonalen Verkürzungen bei der Herstellung von Hirnschnitten verbunden, da diese stark beeinflussen Konnektivität Schätzungen. Jedoch wegen der Vielseitigkeit der gepaarten Aufzeichnungs Ansatz wird ein wertvolles Werkzeug bei der Charakterisierung verschiedener Aspekte der synaptischen Übertragung an identifizierten neuronaler Schaltkreise im Gehirn sein.

Gepaart Aufnahmen sind das Mittel der Wahl für eine eingehende Charakterisierung von morphologisch identifiziert uni- oder bidirektional synaptischen Verbindungen sowie Gap Junction (elektrische) Anschlüsse (Abbildung 1). Ein Beispiel für ein gekoppeltes Aufzeichnungsschicht 4 in der somatosensorischen Kortex Lauf ist in 1A gezeigt. Sowohl unidirektionale exzitatorische und inhibitorische synaptische Verbindungen (1B, C) ​​charakterisiert werden. Weiterhin gepaart Aufna...

Patch-Clamp-Aufzeichnungen und gleichzeitige intrazelluläre Biocytin-Füllung von synaptisch gekoppelten Neuronen in akuten Hirnschnitten ermöglichen eine korrelierte Analyse ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Ziel dieses Protokolls ist es, die wesentlichen technischen Schritte der elektrophysiologischen Aufzeichnung von neuronalen Mikroschaltkreisen und deren anschließende morphologische Analyse zu beschreiben.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu zeigen, wie synaptische Verbindungen zwischen morphologisch identifizierten Neuronen sowohl funktionell als auch strukturell charakterisiert sind. Dies wird durch die Gewinnung von akuten Hirnschnitten erreicht, die für die Untersuchung einer bestimmten synaptischen Verbindung optimiert sind. Patch Clamping wird dann verwendet, um auf synaptisch gekoppelte Neuronen zu testen.Dazu wird ein einzelnes prospektives postsynaptisches Neuron geflickt und dann mit einer zweiten Pipette umliegende Neuronen stimuliert, um das Vorhandensein einer synaptischen Verbindung zu etablieren. Wenn keine Reaktion zu sehen ist, wird die Stimulationselektrode bewegt. Sobald eine Verbindung gefunden ist, wird das präsynaptische Neuron im Großhandelsmodus neu zugeordnet.Nach elektrophysiologischen Ableitungen dieser Neuronen und gleichzeitigen Biotinfüllungen wird die Scheibe fixiert, für Biotin aufbereitet und computergestützte 3D-Rekonstruktionen der Neuronen durchgeführt. Letztendlich zielt unsere Methode auf eine korrelierte quantitative Struktur- und Funktionsanalyse neuronaler Mikroschaltkreise ab. Der Hauptvorteil von gepaarten Aufzeichnun

electrophysiological-morphological-characterization-neuronal

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein vielschichtiger Ansatz zur Untersuchung funktionelle Veränderungen im Hippocampus Schaltung erläutert. Elektrophysiologischen Verfahren werden zusammen mit der Schädigung Protokoll Verhaltenstests und regionalen Dissektionsverfahren beschrieben. Die Kombination dieser Techniken können in ähnlicher Weise für andere Hirnregionen und wissenschaftlichen Fragen angewendet werden.

Untersuchungen über Veränderungen der hippokampalen Schaltung Funktion Nach Mild Traumatic Brain Injury

Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen...

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Kartierung synaptischer Verbindungen durch Sichern eines Gehirnschnitts, Positionieren von Pipetten, um Ganzzellkonfigurationen zu erreichen, und Stimulierung präsynaptischer Neuronen, um postsynaptische Reaktionen aufzuzeichnen, wodurch die neuronale Konnektivität aufgeklärt wird.

Gepaarte Patch-Clamp-Aufzeichnung der neuronalen Verbindungen in akuten Hirnschnitten

Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

Closed-Loop-Protokolle werden in der modernen Elektrophysiologie immer weiter verbreitet. Wir stellen eine einfache, vielseitige und kostengünstige Möglichkeit vor, komplexe elektrophysiologische Protokolle in kortikalen Pyramidenneuronen in vitro mit einem Desktop-Computer und einer digitalen Erfassungsplatine durchzuführen.

Echtzeit-Elektrophysiologie: Mit Closed-loop Protokolle Probe neuronaler Dynamik und darüber hinaus

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Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

Dieses Protokoll beschreibt grundlegende Verfahrensschritte für die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen durchführen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung des elektrischen Verhaltens von Neuronen, und wenn in Hirnschnitten durchgeführt wird, ermöglicht die Bewertung verschiedener neuronaler Funktionen von Neuronen, die in relativ gut erhalten Gehirn Schaltungen noch integriert sind.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Die Slice-Patch-Clamp-Technik ist eine wirksame Methode zur Analyse von lernen-induzierte Veränderungen der inhärenten Eigenschaften und Plastizität der erregenden oder hemmenden Synapsen.

Slice-Patch-Clamp-Technik für die Analyse von Learning-induzierte Plastizität

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Anwendung von automatisierten Bild-geführten Patch-Clamp für die Studie von Neuronen in Gehirn-Scheiben

Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.

Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa

Lernen Sie die elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung synaptischer Verbindungen in akuten Hirnschnitten mit Patch-Clamp-Techniken. Diese Methode ermöglicht die korrelierte Analyse neuronaler Mikroschaltkreise.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen (Video) | JoVE Journal

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

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