Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu zeigen, wie synaptische Verbindungen zwischen morphologisch identifizierten Neuronen sowohl funktionell als auch strukturell charakterisiert sind. Dies wird durch die Gewinnung von akuten Hirnschnitten erreicht, die für die Untersuchung einer bestimmten synaptischen Verbindung optimiert sind. Patch Clamping wird dann verwendet, um auf synaptisch gekoppelte Neuronen zu testen.

Dazu wird ein einzelnes prospektives postsynaptisches Neuron geflickt und dann mit einer zweiten Pipette umliegende Neuronen stimuliert, um das Vorhandensein einer synaptischen Verbindung zu etablieren. Wenn keine Reaktion zu sehen ist, wird die Stimulationselektrode bewegt. Sobald eine Verbindung gefunden ist, wird das präsynaptische Neuron im Großhandelsmodus neu zugeordnet.

Nach elektrophysiologischen Ableitungen dieser Neuronen und gleichzeitigen Biotinfüllungen wird die Scheibe fixiert, für Biotin aufbereitet und computergestützte 3D-Rekonstruktionen der Neuronen durchgeführt. Letztendlich zielt unsere Methode auf eine korrelierte quantitative Struktur- und Funktionsanalyse neuronaler Mikroschaltkreise ab. Der Hauptvorteil von gepaarten Aufzeichnungen von synaptisch gekoppelten Neuronen besteht darin, dass wir eine korrelierte strukturelle und funktionelle Analyse sowohl von prä- als auch von postsynaptischen Neuronen in neuronalen Mikroschaltkreisen durchführen können.

Auch in jüngerer Zeit sind eingeführte Techniken wie die optische Stimulation von Neuronen bisher nicht in der Lage, dies mit so viel Detail zu erreichen. Diese Methode ermöglicht es, die Wechselwirkungen von Erregung und Hemmung morphologisch identifizierter Neuronentypen zu untersuchen und zu untersuchen, wie die Aktivität moduliert wird. Die Verfahren für die Aufnahme von Haustieren wird von Guan demonstriert.

Er, der Postdoc in meinem Labor ist. Nachdem Sie die Scheiben der Zielregion vorbereitet haben, lassen Sie sie während dieser Zeit inkubieren, ziehen Sie die Patch-Pipetten, die einen langen und schlanken Schaft haben sollten. Nachdem Sie eine Gehirnscheibe mit einer Platinharfe in einer Experimentierkammer befestigt haben, füllen Sie eine Aufnahmepipette mit interner Lösung.

Setzen Sie die Pipette in den Vorverstärker und pflastern Sie ein mutmaßliches postsynaptisches Neuron im Ganzzellmodus mit einer Suchpflasterpipette mit einem Widerstand von acht bis 10 Megaohm, gefüllt mit einer internen Lösung, in der Kaliumsalze durch Natriumsalze ersetzt werden. Wenden Sie einen sanften Sog an der suchenden Pipette an, um ein potenzielles präsynaptisches Neuron in einer losen Zelle zu patchen. Angehängte Konfiguration.

Halten Sie das Membranpotential unter der losen Dichtung im Stromzangenmodus auf minus 30 bis minus 60 Millivolt. Legen Sie dann große Stromimpulse von 0,2 bis zwei Nanoampere an, um ein Aktionspotential in der potentiellen präsynaptischen Zelle hervorzurufen. Beobachten Sie dieses Aktionspotential als kleines Ährchen auf dem Spannungsgang.

Stellen Sie die Stimulationsfrequenz auf 0,1 Hertz ein, um einen Nachlauf der postsynaptischen Reaktion zu verhindern. Wenn das postsynaptische Neuron nicht auf die Stimulation des getesteten potentiell präsynaptischen Neuronenpflasters reagiert, wird ein neues potentiell präsynaptisches Neuron im Loose-Seal-Modus erstellt. Testen Sie auf diese Weise bis zu 30 potenziell präsynaptische Neuronen.

Verwenden Sie weiterhin dieselbe Suchfeldelektrode, solange eine Dichtung mit einem Widerstand von mehr als 30 Megaohm hergestellt werden kann. Wenn die Stimulation im Loose-Seal-Modus zu einem EPSP oder IPSP mit einer Latenz von weniger als fünf Millisekunden im postsynaptischen Neuron führt, entfernen Sie die suchende Pipette aus dem präsynaptischen Neuron mit einer mit Biotin gefüllten Aufzeichnungspflasterelektrode, die eine reguläre interne Lösung mit einem Widerstand von vier bis acht Megaohm enthält. Patchen Sie das präsynaptische Neuron und zeichnen Sie es im Ganzzellstrom-Clamp-Modus auf.

Auslösen von Aktionspotentialen durch Strominjektion in die präsynaptischen Neuronen und Aufzeichnen der postsynaptischen Antwort. Speichern Sie die Daten auf einem Computer für eine spätere Offline-Analyse. Während der gesamten Aufzeichnung diffundiert Biotin in das Neuron, um eine angemessene Färbung zu erhalten.

Lassen Sie das Biotin je nach Größe des Neurons mindestens 15 bis 30 Minuten lang diffundieren. Bei neuronalen Mikroschaltkreisen mit einem hohen Konnektivitätsverhältnis wird keine Suchelektrode verwendet. Beginnen Sie lieber damit, ein präsynaptisches Neuron im Ganzzellmodus direkt zu patchen.

Dann sollten mit einer Patch-Elektrode, die mit einer regulären internen Lösung gefüllt ist, ein potentielles postsynaptisches Neuron ebenfalls im Ganzzellmodus pflastern, beide Zellen unter Stromklemmkontrolle stehen. Ermitteln Sie ein Aktionspotential in der präsynaptischen Zelle und überwachen Sie das prospektive postsynaptische Neuron auf ein postsynaptisches Potential. Wenn das Neuron keine Reaktion auf die präsynaptische Stimulation zeigt, verwenden Sie eine neue Elektrode, um ein neues Neuron im Ganzzellmodus erneut zu flicken.

Wenn eine Verbindung gefunden wird, fahren Sie mit der Aufzeichnung fort, wie zuvor gezeigt, ohne die Patch-Pipette zu wechseln. Nach dem Fixieren und Montieren der Scheiben, wie im Textprotokoll beschrieben, untersuchen Sie die Biotin-markierten Neuronen unter einem Lichtmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die axonalen Stäbe und dendritischen Dornen deutlich sichtbar sind.

Mit einem kommerziellen Neuron-Tracing-System können Sie die Neuronen oder synaptisch gekoppelten Neuronenpaare manuell verfolgen. Achten Sie darauf, auch kleine axonale oder dendritische Kollateralen einzubeziehen. Verwenden Sie die Spuren, um neuronale 3D-Rekonstruktionen zu erhalten, korrigieren Sie die neuronalen Rekonstruktionen auf Schrumpfung in allen drei Raumdimensionen im entsprechenden Abschnitt des Nachzeichnerprogramms.

Die Schwindungskorrekturfaktoren für das Einbettungsmedium betragen ca. 1,1 für die x- und y-Richtung und ca. 2,1 für die z-Richtung. Ein reziprok gekoppeltes Zellpaar, bestehend aus einem stacheligen Stern und einem schnellen Spiking in ein Neuron. In der kortikalen Schicht wurden vier mit Biotin gefüllt.

Während der Aufzeichnung zeigen die grünen Punkte mutmaßliche exzitatorische synaptische Kontakte zwischen dem präsynaptischen Spiny-Neuron und dem postsynaptischen Inter-Neuron an. Die blauen Punkte deuten auf mutmaßliche reziproke inhibitorische synaptische Kontakte hin. Hier sind Hochleistungsbilder der synaptischen Kontakte zu sehen.

Die grünen offenen Kreise zeigen erregende Kontakte und die blauen offenen Kreise zeigen hemmende Kontakte. Eine neuroluzide Rekonstruktion dieses reziprok verbundenen Zellpaares ist hier zu sehen. Das Axon zwischen den Neuronen ist blau dargestellt und sein Soma und Dendrit sind rot dargestellt.

Das Axon der stacheligen Neuronen ist grün dargestellt und sein Soma und Dite sind weiß. Der Einschub zeigt die somato dendritischen Kompartimente der prä- und postsynaptischen Neuronen. Zusammen mit den mutmaßlichen synaptischen Kontakten wurden die Zylinderkonturen in den lichtmikroskopischen Aufnahmen des akuten Hirnschnitts mit geringer Leistung identifiziert.

Hier ist eine repräsentative synaptische Verbindung mit einem sehr geringen Konnektivitätsverhältnis dargestellt. Ein präsynaptisches Aktionspotential in einer Parametallzelle der sechsten Schicht evozierte ein monossynaptisches exzitatorisches postsynaptisches Potential in einem Parametall-Neuron der vierten Schicht. Die hier gezeigte Latenzzeit von mehr als drei Millisekunden dieser translaminaren Verbindung ist viel länger als die etwa eine Millisekunde Latenz, die bei lokalen intralaminaren Verbindungen beobachtet wird.

Zwei Aktionspotentiale bei 10 Hertz, die in der Parametallzelle der sechsten Schicht ausgelöst wurden, lösten postsynaptische Potentiale in dem hier gezeigten Star-Parametall-Neuron der vierten Schicht aus. Beachten Sie die kurzfristige Erleichterung. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Slashing-Bedingung für eine gegebene synaptische Verbindung optimiert werden muss und dass das Setup während der Aufnahme absolut stabil sein muss, damit das optimale Aufnahmeverständnis gewährleistet ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die elektrophysiologischen Messungen und die morphologischen Rekonstruktionen verwendet werden, um ein Gesamtbild der strukturellen und funktionellen Eigenschaften neuronaler Mikroschaltkreise im Neokortex zu erhalten.