Funktionale Bewertung der biologischen Neurotoxine in Networked Cultures für Stammzell abgeleitete Zentralnervensystem Neuronen

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Effekt von Clostridialen Neurotoxinen auf die synaptische Übertragung in vernetzten Kulturen von Neuronen, die aus embryonalen Stammzellen von Mäusen stammen, präzise zu messen. Dies wird erreicht, indem embryonale Stammzellen zunächst an eine suspensionskultivierte, feederzellfreie Kultur angepasst und die angepassten Zellen im pluripotenten Zustand gehalten werden. Der zweite Schritt besteht darin, die in Suspension angepassten Stammzellen mithilfe einer Variante der vier-schrittigen Differenzierungstechnik in Neuronen oder ESNs zu differenzieren.

Anschließend werden ESNs mit einer Reihe von Medien behandelt, um die Reifung zu synaptisch aktiven, vernetzten Neuronen zu fördern. Im letzten Schritt werden die ESNs mit clostridiellen Neurotoxinen oder anderen Neurotoxinen behandelt und die Auswirkungen auf die monosynaptische Aktivität mittels Ganzzell-Patch-Clamp-Elektrophysiologie gemessen. Letztendlich werden Änderungen in der spontanen Erzeugung monosynaptischer Aktivität aus elektrophysiologischen Aufzeichnungen quantifiziert, die auf Alter und Chargen abgeglichene Kontrollneuronen normiert sind, und zwischen verschiedenen Bedingungen wie Dosen, Zeitpunkten oder pharmakologischen Behandlungen verglichen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass ESNs das erste zellbasierte Modell sind, das die funktionellen Pathologien nachbildet, die für die klinischen Manifestationen von Botulismus und Tetanus verantwortlich sind. Die Idee zu dieser Methode kam uns erstmals, als wir feststellten, dass ESNs aufgrund der Spaltung von SNARE-Proteinen gegenüber allen clostridiellen Neurotoxinen äußerst empfindlich sind und zudem eine spontane synaptische Aktivität im emergenten Netzwerkverhalten zeigen. Die Demonstration des Verfahrens wird Frau Megan Lyman, eine Technikerin aus meinem Labor, durchführen. Beginnen Sie damit, eine Suspensionkultur ohne Futterzellen zu überführen, die an die Suspension angepasst ist.

Überführen Sie die ESC-Aggregate in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und lassen Sie die Aggregate zu einem kompakten Pellet sedimentieren. Sobald sich die Aggregate abgesetzt haben, pipettieren Sie das Überstandsmittel vorsichtig ab, ohne das Zellpellet zu stören. Geben Sie anschließend fünf Milliliter PBS zu, um die Zellen zu waschen, und zentrifugieren Sie für 2,5 Minuten bei 100 × g.

Den PBS vorsichtig abpipettieren und dann 500 µL Trypsin hinzufügen. Den Tubus mehrmals vorsichtig umdrehen, um das Zellpellet sanft aufzulösen. Anschließend den Tubus in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen und drei Minuten lang inkubieren. Nach Ablauf der Inkubationszeit den Tubus zurück in die Zellkulturwerkbank bringen und 500 µL ESC-Medium hinzufügen, um das Trypsin zu verdünnen.

Anschließend wird die CEL-Suspension fünf bis zehnmal mit der P-1000-Pipette aufgezogen, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Ein Aliquot der Zellen wird mit einem Hämozytometer gezählt und der Rest der Zell-Suspension bei 200 × g für drei Minuten zentrifugiert. Nach dem Absaugen des Überstandes werden die Zellen in ESC-Medium auf eine Endkonzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter resuspendiert.

Überführen Sie anschließend 150 µL der Suspension in 10 mL ESC-Medium in einer 10 cm großen Bakterienschale und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. E ESCs werden routinemäßig mit diesem Protokoll weitergepasst. Alle 48 Stunden beginnt während eines routinemäßigen Zellpassages die Differenzierung der ESCs in Neuronen.

Lösen Sie die ESCs wie zuvor auf, nehmen Sie jedoch eine zusätzliche Platte für die neuronale Differenzierung hinzu. Überführen Sie 350 Mikroliter der Zellsuspension in eine 10 cm große Low-Attachment-Schale, die 25 Milliliter Differenzierungsmedium enthält. Stellen Sie die Schale auf einen Rüttler, der auf 30 bis 45 U/min eingestellt ist, und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang in einem Zellkulturgehäuse bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Nach 48 Stunden überführen Sie die differenzierenden Zellaggregate mithilfe einer 25-Milliliter-Pipette in einen 50-Milliliter-Konikalzylinder. Geben Sie unmittelbar danach 25 Milliliter frisches Differenzierungsmedium in die Petrischale.

Lassen Sie die Aggregate zwei bis fünf Minuten lang absetzen, wodurch sich ein sichtbarer Pellet von ein bis zwei Millimetern Tiefe bildet. Aspirieren Sie vorsichtig das Medium, wobei einzelne Zellen oder kleine Aggregate in Suspension unbeachtet bleiben, und überführen Sie die Zellagglomerate mit einer P-1000-Pipette zurück in die Petrischale. Stellen Sie die Schale erneut in den Rotationsschüttler im Inkubator.

Nach weiteren 48 Stunden den Mediumwechsel erneut durchführen. Dieses Mal mit 30 Milliliter Differenzierungsmedium, das mit sechs Mikromolar All-trans-Retinsäure ergänzt wurde. Das gebildete Pellet wird nach der Inkubation der Zellen nun zwei bis vier Millimeter tief sein.

Wie zuvor die Mediumwechselprozedur mit Retinsäurezugabe ein letztes Mal wiederholen. Am folgenden Tag wird das Pellet an dieser Stelle vier bis acht Millimeter tief sein. Die Beschichtungsoberflächen am Nachmittag des Plattierungstages wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben vorbereiten oder jeweils fünf Milliliter vorbeschichtetes MPC-Trypsin-Medium und 0,1 % Sojabohnen-Trypsininhibitor bei 37 Grad Celsius bereitstellen.

Verwenden Sie dann eine 25-Milliliter-Pipette, um die differenzierenden Aggregate von der Kulturplatte in ein 50-Milliliter-Konischgefäß zu überführen. Lassen Sie die Aggregate drei bis fünf Minuten lang absetzen und saugen Sie anschließend vorsichtig das Medium ab, ohne den Pellet zu stören. Waschen Sie danach den Pellet mit fünf bis 10 Milliliter PBS, nachdem sich die Aggregate abgesetzt haben.

Den PBS abpipettieren und die Waschung wiederholen. Nach der zweiten PBS-Waschung fünf Milliliter MPC-Differenzierungsmedium zum Pellet geben und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Vorsichtiges Anschlagen des Reaktionsgefäßes zwei bis drei Mal während der Inkubation. Danach fünf Milliliter 0,1 % Sojabohnen-Tripsin-Inhibitor zu den Zellen geben und durch Umstülpen schnell mischen. Anschließend die Zellen vorsichtig 10 bis 15 Mal mit einer 10-Milliliter-Pipette auf- und abpipettieren, bis eine relativ homogene Zellsuspension entsteht.

Filtern Sie die Zellsuspension langsam durch einen 40- oder 70-Mikron-Zellsieb, der auf einem 50-Milliliter-Konischrohr platziert ist. Sobald die gesamte Suspension filtriert ist, geben Sie ein Milliliter N2-Medium auf den Filter, um die verbleibenden Zellen durch den Sieb zu waschen. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konischrohr und zentrifugieren Sie sechs Minuten bei 200 × g. Nach dem Absaugen des Mediums, ohne den Pellet zu stören, resuspendieren Sie den Pellet in zwei Milliliter N2-Medium und ergänzen anschließend N2-Medium auf ein Gesamtvolumen von 10 Milliliter.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 200 × g. Aspirieren Sie das Medium und wiederholen Sie den Pelletwaschschritt erneut. Resuspendieren Sie den Pellet in 10 Milliliter N2-Medium.

Entnehmen Sie eine Aliquotprobe der Zellen und zählen Sie diese mit einem Hämozytometer, anschließend wiederholen Sie die Zentrifugation nach Reese. Suspendieren Sie die Zellen in N2-Medium auf eine Endkonzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter und säen Sie sie mit einer Dichte von 150.000 bis 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter aus. Indic wird am DIV minus eins hergestellt und im Zellkulturinkubator bei 37 °C platziert.

ESNs gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll pflegen. Zunächst Botulinum-Neurotoxin-Serotyp A in ESN-Kulturmedium auf das 100-fache der gewünschten Endkonzentration verdünnen und auf 37 Grad Celsius erwärmen. Anschließend ein geeignetes Volumen des Toxins zu den ESN-Kulturen ab DIV 21 hinzufügen.

Erhitzen Sie die Kulturschale und kehren Sie sie zum gewünschten Zeitpunkt in den Inkubator zurück. Aspirieren Sie das ESN-Kulturmedium punktgenau und waschen Sie zweimal mit extrazellulärem Aufzeichnungspuffer oder ERB. Geben Sie anschließend vier Milliliter ERB, ergänzt mit fünf Mikromolar Tetrodotoxin zur Blockade von Aktionspotentialen und 10 Mikromolar Bicucullin zur Antagonisierung der GABAA-Rezeptoraktivität, hinzu.

Überführen Sie die Schale anschließend auf die Elektrophysiologie-Apparatur. Für die gemessene Hemmung der synaptischen Übertragung oder den Mist-Assay sind weder eine Perfusions- noch eine Temperaturkontrolle erforderlich. Ziehen Sie nach der Verwendung eines Mikropipettenzuggeräts Borosilikat-Pipetten mit einem Widerstand von fünf bis 10 Megaohm und füllen Sie eine Pipette rückwärts mit intrazellulärem Aufzeichnungspuffer.

Dann tauchen Sie die Pipette vorsichtig in das Silikonreagenz ein. Befestigen Sie die Aufnahmepipette sicher am Elektrodenhalter und verbinden Sie eine mit Luft gefüllte Spritze mit dem Schlauch, der zum Elektrodenhalter führt. Geben Sie über die Spritze einen gleichmäßigen positiven Druck ab, während Sie die Aufnahmepipette in das ERB absenken.

Nachdem die Aufnahmepipette vorsichtig auf dem SOR des zu messenden Neurons abgesetzt wurde, positiven Druck erzeugen, indem die Dichtung am Spritzenkolben durchbrochen wird. Die Spritze wieder anschließen und durch sanftes Einatmen kontinuierlichen Unterdruck aufbringen, um eine Gigaohm-Dichtung zu bilden.

Wenn der Gigaohm-Siegel gebildet ist, verringern Sie die Haltespannung auf minus 70 Millivolt. Anschließend wenden Sie vorsichtig kurze Impulse negativen Drucks mit der Spritze an, um in die Ganzzell-Konfiguration zu gelangen. Überwachen Sie 30 Sekunden lang Kapazitätsspitzen, um zu bestätigen, dass die Aufzeichnung stabil ist.

Kompensieren Sie die Kapazitäts-Spikes in der HEA-Software und wechseln Sie in den Strom-Klemm-Modus, um das Ruhe-Membranpotenzial ohne Korrektur der Flüssigkeitskontakt-Potentiale zu überwachen und aufzuzeichnen. Das Ruhe-Membranpotenzial kann zwischen minus 67 und minus 82 Millivolt liegen. Stellen Sie die Verstärkung auf zwei Millivolt pro Pikoampere ein.

Wechseln Sie in den Spannungs-Klemm-Modus und nehmen Sie kontinuierlich für drei bis fünf Minuten bei minus 70 Millivolt auf, um miniaturisierte exzitatorische postsynaptische Ströme zu detektieren. Analysieren Sie drei bis fünf Minuten der aufgezeichneten Daten, um mEPSCs unter Verwendung der Standardeinstellungen für AMPA-Rezeptor-EPCs in Mini-Analysis zu erkennen, sammeln und speichern Sie Informationen zu den detektierten Ereignissen. Nachdem Sie die mEPSC-Frequenzen für acht bis zwölf Kontrollen und acht bis zwölf mit Botulinum-Neurotoxin behandelte Proben für jede Expositionsbedingung gesammelt haben.

Analysieren Sie die Häufigkeit im Vergleich zu alters- und chargengematchten Kontrollen und bestimmen Sie dann die statistische Signifikanz der prozentualen Hemmung synaptischer Aktivität mithilfe geeigneter statistischer Tests von Tag sieben bis Tag 49. ESNs exprimieren neurotrope Kompartimente und bilden synaptische Kontaktstellen. Taxonomische dendritische Grenzflächen. ESNs unterliegen einer Hemmung der synaptischen Aktivität, wenn sie Botulinum-Neurotoxin-Serotypen A, TG und Tetanus-Toxin ausgesetzt sind.

Diese repräsentativen Spuren von ESNs wurden 20 Stunden nach der Zugabe von Botulinum-Neurotoxin-Serotypen, A TG-Tetanus-Neurotoxin oder Fahrzeuglösung gesammelt. Jedes Neurotoxin verringerte die synaptische Aktivität im Vergleich zu Kontrollen um über 95 %. Die folgenden vier Bilder zeigen die Empfindlichkeit der Verwendung von Mist zur Messung monosynaptischer Aktivität in mit Botulinum-Neurotoxin-Serotyp A behandelten ESNs.

Diese erste Abbildung zeigt repräsentative Spuren fehlender Messungen synaptischer Aktivität 20 Stunden nach der Zugabe von Botulinum-Neurotoxin-Serotyp A ins Bad. Die Spannungs-Klemm-Spurabschnitte zeigten eine Abnahme der M-E-P-S-C-Frequenz nach Exposition gegenüber Botulinum-Neurotoxin-Serotyp A. Diese Abbildung zeigt die Quantifizierung der M-E-P-S-C-Frequenz und bestätigt eine dosisabhängige Abnahme der M-E-P-S-C-Frequenz. Die mediane Hemmkonzentration wurde durch eine Kleinste-Quadrate-Anpassung einer nichtlinearen Regression mit vierparametrigem variablen Anstieg ermittelt. Beachten Sie, dass die Nachweisgrenze mittels MIST in SNS mindestens 0,005 Pikomolar beträgt.

Dieses Balkendiagramm zeigt die Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung des SNAP25-Spaltungsgrades, gemessen mittels Western Blot. Beachten Sie die verringerte Empfindlichkeit der SNARE-Proteinspaltung als Messgröße für die Intoxikation. Im Vergleich zu Mist zeigt ein einzelner Sternchen einen P-Wert von weniger als 0,05 an.

Ein dreifacher Stern zeigt einen P-Wert von weniger als 0,001 an. Diese Ergebnisse zeigen, dass vernetzte Populationen von aus Stammzellen abgeleiteten Neuronen ein physiologisch relevantes, zellbasiertes Modell für die Vergiftung mit clostridiellen Neurotoxinen bieten. Die Verwendung von SNS wird voraussichtlich die Tierbelastung und den Tierverlust erheblich reduzieren, da sie als geeigneter Ersatz für den Maustöttest dient und zusätzlich den Vorteil einer verbesserten Geschwindigkeit, Spezifität und Empfindlichkeit bietet.

Diese Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Neurotoxikologie die Möglichkeit, Screening-Verfahren mit moderater Durchsatzleistung basierend auf der Aktivität neuronaler Netzwerke einzusetzen, um die Suche nach Therapeutika und den Nachweis von clostridiellen Neurotoxinen zu erleichtern.