Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen ^- Kanäle und Transporter

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Transportaktivität von rekonstituierten Chloridkanälen oder Transportern quantitativ zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zuerst der reine gereinigte Transporter in Liposomen mit einer niedrigen Dichte rekonstituiert wird, so dass jedes Liposom entweder null oder eine Kopie des aktiven Komplexes enthält, nachdem die externen Chloridionen entfernt wurden, so dass ein nach außen gerichteter Ionengradient entsteht, werden die Liposomen in die Aufzeichnungskammer gegeben, wo die Chloridkonzentration mit einer chloridempfindlichen Elektrode überwacht wird. Als nächstes wird das Chlorid flx aus den Liposomen durch Zugabe von Val Mycin, einem Kaliumionophor, initiiert, das das Membranpotential ausgleicht.

Sobald das Signal den stationären Zustand erreicht, wird das Experiment durch Zugabe von Detergens beendet, um die Liposomen aufzulösen. Letztendlich ist es durch Messung der Rate des Chloridausflusses aus Protea-Liposomen, die mit einem gereinigten Kanal oder Transporter rekonstituiert wurden, möglich, die unitäre Transportrate und die Stöchiometrie des aktiven Proteinkomplexes quantitativ zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Ansätzen, wie z. B. fluoreszenzbasierten Flussmessungen, besteht darin, dass es mit dieser Technik möglich ist, Schlüsselparameter des rekonstituierten Transporters, wie z. B. die unitäre Umsatzrate und die Geometrie des Komplexes, quantitativ zu bestimmen.

Neben der quantitativen Messung dieser Schlüsselparameter kann diese Methode verwendet werden, um schnell und präzise die Wirkung der Mutation kleiner Moleküle zu bestimmen und Untereinheiten im rekonstituierten Transferprotein zu überwachen. Der Aufnahmeaufbau besteht aus zwei Kammern, einer Chloridelektrode, einem pH-Meter mit analogem oder digitalem elektrischem Ausgang, einem Digitizer und einem Computer mit entsprechender Erfassungssoftware. Schließen Sie die Chloridelektrode an das pH-Messgerät an und verbinden Sie dann den Ausgang des pH-Messgeräts mit dem Digitalisierer, der mit dem Computer verbunden ist.

Platzieren Sie die Referenzelektrode in der einen Kammer und den Codierdraht in der anderen. Stellen Sie dann die Kammern mit dem Rührstab in die Aufnahmekammer auf eine Rührplatte. Stellen Sie sicher, dass der Rührstab die Elektrode nicht berührt.

Verbinden Sie die Kammern mit einer Agarbrücke: In der Nacht vor den Experimenten quellen Sie ein Gramm cidex G 50-Kügelchen in 15 Millilitern externem Puffer unter leichtem Schütteln für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur auf, bevor Sie es verwenden. Für jedes Experiment werden etwa drei Milliliter gequollene Kügelchen benötigt, während die Liposomen bei Raumtemperatur auftauen. Gießen Sie etwa drei Milliliter gequollene G 50 Kügelchen in jede Säule.

Lassen Sie sie durch Schwerkraft trocknen. Durchfluss bei Raumtemperatur. Dies dauert in der Regel ein bis zwei Minuten.

Bereiten Sie anschließend ulare Vesikel vor, indem Sie die Protea-Liposomen 11 Mal durch einen Mini-Extruder extrudieren, wobei ein 0,4-Mikron-Teflon-Cutoff verwendet wird. Legen Sie dann die Säule für 20 bis 30 Sekunden in eine Kunststoffzentrifuge mit Rundbodenrohr bei 1400 G in eine klinische Zentrifuge, um überschüssige Lösung zu entfernen. Nachdem Sie den Durchfluss geschützt haben, legen Sie die Säule in ein 13 x 100 Millimeter großes Glasröhrchen und geben Sie 100 Mikroliter der extrudierten Vesikel in die Säule.

Drehen Sie die Säule eine Minute lang bei 500 G.In einer klinischen Zentrifuge, sammeln Sie etwa 200 Mikroliter des Durchflusses, die in die Aufnahmekammer gegeben werden. Um eine Ausflussmessung durchzuführen, geben Sie zwei Milliliter 100 Millimolar Kaliumchlorid in die Referenzkammer und 1,8 Milliliter des externen Puffers in die Aufzeichnungskammer. Starten Sie das Akquisitionsprogramm.

Lassen Sie die Grundlinie sich ausgleichen. Dies kann einige Minuten dauern. Sobald das Signal eine stabile Grundlinie erreicht hat, beginnen Sie mit der Aufnahme.

Fügen Sie 15 Mikroliter einer hellbraunen molaren Kaliumchloridlösung hinzu, um das System zu kalibrieren. Fügen Sie dann Liposomen hinzu. Ein kleiner Sprung kann aufgrund der unvollständigen Entfernung von externem Chlorid aus den Protea-Liposomen sichtbar sein.

Warten Sie, bis sich die Basislinie stabilisiert hat. Fügen Sie als Nächstes CIN hinzu, um flx zu initiieren. Lassen Sie den FLX seinen Zeitverlauf nehmen, bis er ein Plateau erreicht.

Fügen Sie zu diesem Zeitpunkt 40 Mikroliter 1,5 molares Beta-Octa-Glukozid hinzu, das im externen Puffer hergestellt wurde, um alle Liposomen aufzulösen. Warten Sie dann 10 bis 15 Sekunden. Beenden Sie die Aufzeichnung und fahren Sie mit der Datenanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

Wenn Liposomen mit hohem internen Chloridgehalt in niedriges Chlorid getaucht werden, wodurch ein 300-facher Chloridgradient entsteht, wird kein Nettoionenfluss beobachtet. Dies liegt daran, dass die proteinfreien Liposomen eine geringe intrinsische Permeabilität für Ionen aufweisen. Es wurde kein makroskopisches FLX von Prot-Liposomen beobachtet, die mit dem protonengekoppelten Chloridtransporter C-L-C-E-C rekonstituiert wurden.

Da die geringe Menge an Chlorid, die aus dem Vesco austritt, eine positive Nettoladung im Liposom aufbaut, ermöglicht die Zugabe von CIN Kaliumionen, sich durch die Membran zu bewegen, das elektrische Potential zu entlasten und Chlorid flx zu initiieren. Die Reaktion wird beendet und die Gesamtmenge der in den Vesikeln enthaltenen Chloridionen wird gemessen, um die Eigenschaften der einzelnen rekonstituierten Proteine zu bestimmen. Die Rohdaten des Ausflusszeitverlaufs werden zunächst von Millivolt in eine Chloridkonzentration umgerechnet und dann normiert, der Zeitverlauf wird dann angepasst.

Es wurde festgestellt, dass die Zeitkonstante des Efflux 41 Sekunden beträgt und der Anteil der Liposomen, die keine aktiven Kopien von C-L-C-E-C eins enthalten, Punkt 31 beträgt, was bedeutet, dass etwa ein Drittel der Liposomen keine aktiven Proteine aus diesen Werten enthält, und den Chloridgehalt von Vesikeln zu messen, die mindestens eine Kopie von C-L-C-E-C enthalten, Es ist möglich, eine einheitliche Transportrate von C-L-C-E-C zu bestimmen, die ungefähr 2.500 Chloridionen pro Sekunde entspricht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Notwendigkeit eines Umschlags eines Transportunternehmens bestimmen können. Diese Experimente können bei sorgfältiger Durchführung in 10 bis 15 Minuten durchgeführt werden.

Es ist wichtig, die Qualität der Liposomen sorgfältig zu beurteilen, da Leckagen die Schätzungen der Umsatzrate negativ beeinflussen.