Name: Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Erfahren Sie die chemische Fixierung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung. Dieses Protokoll zeigt die Vorbereitung von Siliziumnitrid-Fenstern und die Metallverteilungsanalyse in Zellpopulationen.

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Die Autoren danken Stefan Vogt für seine Unterstützung bei der Anpassung der repräsentativen Daten, die in diesem Artikel gezeigt werden, und für hilfreiche Diskussionen. Die Autoren danken auch Chris Jacobsen für seine Unterstützung von Q. J. 
Die Nutzung der Advanced Photon Source, Beamlines 2-ID-E und 8-BM-B, am Argonne National Laboratory wurde unterstützt vom U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, unter der Vertragsnummer DE-AC02-06CH11357.

1. Herstellung des Instruments, Substrate, Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Handhabung von Siliciumnitrid (Si 3 N 4) Fenster. <ol><li> Öffnen der Kapsel leicht durch Zusammendrücken eines Endes, die das Fenster in solcher Weise, dass das Fenster sich nicht einklemmen, während sich das andere Ende der Kapsel mit der anderen Hand. </li><li> Überprüfen Sie ein Paar umgekehrt zu spitzen Pinzette unter Stereomikroskop stellen Sie sicher, gibt es keine Haft, Lücken oder Kurven an der Spitze. Andernfalls können die Fenster durch die Pinzette oder gebrochen werden wegfliegen von ihnen während der nachfolgenden Schritte. </li><li> Entfernen Sie das Fenster aus der Kapsel durch vorsichtiges Greifen der Rahmen des Fensters mit einer Pinzette unter leichtem Zusammendrücken der Kapsel in der Nähe des offenen Endes Anlegen von Druck in einer Richtung, so daß die Kapsel breiter zu machen, wo die Ränder des Fensters müssen kommen. </li></ol></li><li> Fenster Vorwäsche (optional). <ol><li> Wenn gewünscht, Vorwäsche Fenster durch leichtes Eintauchenin destilliertes Wasser für 5 Sekunden, gefolgt von 2 min waschen in 70% Ethanol und 2 min waschen in 100% Ethanol. </li></ol></li><li> Das Anbringen und Sterilisieren Fenster auf der Kulturschale. <ol><li> Um die Fenster angebracht werden kann, stellen Sie das Fenster mit der flachen Seite nach oben auf den Boden der Kulturschale, legen Sie ein Stück Klebeband auf einer sauberen Glasobjektträger. Schneiden Sie etwa ein Viertel Zoll-Streifen aus den langen Seite des Bandes. Nehmen Sie ein Stück Klebeband an der kurzen Seite (auf ⅛ &quot;durch ¾&quot;) mit einer sauberen Rasierklinge. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Scheibe der Band an den Rand des Gitters oder Fenster gelten. Verwenden Sie genug, um sicher zu halten ist, ohne dabei die Fensteröffnung selbst. Manipulation der halten Band mit einer Pinzette, setzen Sie das Fenster nach unten auf den Boden der Kulturschale. Verwenden Sie die Spitze der Pinzette auf Band auf den Boden der Kulturschale fest haften. </li><li> Übernehmen Sie ein anderes Band Streifen zu dem anderen Rand und halten diese auf den Boden fest mit der Spitze der Pinzette. </li><li> Nachdem alle FensterKlebeband, sterilisieren Fenster in Kulturschalen mit ultraviolettem (UV) Strahlung. Erreichen dies, indem Sie das Gericht unter der UV-Lampe in einer Steril etwa 1 Stunde. </li><li> (Optional) Wenn Fenster mit Poly-Lysin vorbeschichtet werden sollen, müssen so folgende Fenster Sterilisation. Bestreichen Sie die Fenster mit 10 ul sterilem 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung für 1 h in einem 37 ° C Inkubator und dann spülen Sie die verbleibende Lösung mit dem Kulturmedium. </li></ol></li><li> Bereiten Puffer für letzten Waschen vor XFM. <ol><li> Bereiten entweder ein Tris-Glucose oder Piperazin- N, saccharose N &#39;-bis (ethansulfonsäure) (PIPES) Puffer frei von Spurenmetallen mit Osmolalität und pH äquivalent Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) ohne Calcium und Magnesium. Verwenden Sie eine dieser Puffer Zellen spülen, nachdem die Zellen chemisch fixiert. <ol><li> Um die Tris-Glucoselösung (10 mM Tris, 260 mM Glucose, 9 mM Essigsäure) machen hinzuzufügen 1,4 g Glucose, 36 mg Tris-Base und16 ul Essigsäure und 20 ml Reinstwasser. Dann endgültige Lautstärke auf 30 ml mit Reinstwasser. Keine pH Einstellung erforderlich ist. Lagern Sie bei RT bis zu einer Woche. </li><li> Um die Rohre-Saccharose (20 mM PIPES, 200 mM Saccharose) hinzufügen 0,18 g PIPES und 2,0 g Saccharose in 20 ml Reinstwasser und der pH-Wert auf 7,4 mit kleinen Mengen von konzentrierter Essigsäure. Dann endgültige Lautstärke auf 30 ml mit Reinstwasser. Lagern Sie bei RT bis zu einer Woche. HINWEIS: Der Grund, zu vermeiden, mit PBS in der letzten Spülung ist, dass die Konzentration von Phosphat, Chlorid und Kalium in PBS so hoch, daß sie mit XFM stören, wenn sie nicht vollständig vor dem Trocknen an der Luft entfernt werden. </li></ol></li></ol></li><li> Bereiten Puffer für Zell Beschichtung. <ol><li> Bereiten Sie oder nehmen Sie alle Medien, wie RPMI-Medium 1640, 1x Trypsin-EDTA-Lösung, D-PBS, und andere Reagenzien, wie für die jeweilige adhärenten Zelllinie benötigt, wie sie normalerweise für die Passage der adhärenten o Zellen durchgeführt werdenf Interesse, und wärmen Sie sie auf 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Überzug von Zellen <ol><li> Zu dem sterilisierten Kulturschale gegeben, die Fenster in der Haube mit laminarer Strömung, sanft hinzuzufügen Medien (10 ml für eine 100 mm-Kulturschale), entlang der Seite der Kulturschale in einem Winkel geneigt ist. Vermeiden Sie unnötige Oberflächenspannung oder Fallenmedien direkt auf Oberfläche des Siliziumnitrid-Fenster. Als Medium wird hinzugefügt, langsam entlasten den Neigungswinkel zu beschichten das Gitter und Fenster mit Medien. </li><li> Bereiten Sie die adhärenten Zelllinie von Interesse angemessen, Trypsinierung oder Abkratzen der Zellen aus der Platten wie gewohnt für Passagieren des Zelllinie. Führen Sie alle Zellzählung oder andere Vorbereitung notwendig, bevor die Zellen an der frischen Platte. </li><li> Hinzufügen von Zellen in die Kulturschale mit Fenstern mit einer Zelldichte, die benötigt wird, um normalerweise zu erreichen 50% -70% Konfluenz innerhalb 24-72 Stunden, und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid. </li&gt; <li> Wachstum der Zellen zu beobachten gelegentlich unter Verwendung eines invertierten Lichtmikroskops, bis die gewünschte Zelldichte (in der Regel 50% bis 70% Konfluenz) erreicht wird. </li></ol> 3. Fixierung von Zellen <ol><li> Ansetzen 4% Paraformaldehyd in D-PBS durch Verdünnen eines gekauft Lager (wie 25% Paraformaldehyd) und Einstellen des pH auf 7,4 mit Essigsäure (Zugabe von überschüssigem Natriumhydroxid zu der Probe zu vermeiden). </li><li> Wenn Zellen erzeugt worden sind, wie gewünscht, und alle Vitalfarbstoffe (wie Hoechst) zur Anwendung, und abgebildet wird, entfernen Sie die Medien durch leichtes Ansaugen, Kippen der Schale in einem Winkel von 45 ° mit einer Hand, und Absaugen von Hand Pipette mit der anderen . Hinweis: Alternativ zum Pipettieren verbrauchte Medien, ist eine Alternative zu dem Fenster abholen, tauchen Sie das Fenster in Mikrozentrifugenröhrchen mit D-PBS zweimal und dann legen Sie sie in ein neues Kulturgefäß mit Fixiermittel-Lösungen für 20 Minuten, gefolgt von 2-mal PBS waschen die Rest Fixiermittel zu entfernen. Wenn dies gewählt wird, gehen direkt zu Schritt 3.5. </li><li> Spülen Sie die Schale vorsichtig mit D-PBS und sofort zu ersetzen, die entfernte Flüssigkeit durch vorsichtiges Hinzufügen der frischen 4% PFA / PBS, während das Gericht in einem Winkel von 45 ° in Richtung der Seite der Schale halten, Pipettieren, und langsam entspannen den Neigungswinkel zu ermöglichen die Fixierungslösung, um die Fenster zu decken. Halten der Zellen mit dem Fixiermittel für 20 min bei RT überzogen. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit durch leichtes Ansaugen, wieder wie oben, Kippen der Schale leicht und Absaugen von Hand. </li><li> Bringen Sie die Flüssigkeit entfernt durch leichtes Hinzufügen von einigen der Leitungen / Saccharose-Lösung unter Verwendung der in Schritt 3.3 beschrieben Kipp- und Pipettierverfahren. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5. </li><li> Vorbereitung der Materialien für das Trocknen. <ol><li> Sammeln fusselfreien Tücher wie Kimwipes, und ziehen Sie eine aus der Box, so ist es praktisch, sehr schnell und einfach. </li><li> Bereiten Sie eine saubere, nicht-Ebene stelle das Fenster, um zu trocknen. Set aus einer Kautschukgittermatte der Art, in der Elektronenmikroskopie eingesetzt, die Rippen hat, sokann das Fenster an einem Ende gestützt werden, während es trocknet. Das Fenster aus immer auf die Trockenoberfläche geklebt zu halten, während er trocknet und Drain verbleibende Puffer zu der Kante der Probe. </li></ol></li><li> Sorgfältig tweeze das Band, um das Fenster, um das Fenster aus der Flüssigkeit halten angebracht. Rufen Sie Fenster, die aus der Band kommen, indem eine kleine Menge von Leitungen / Saccharose zu erhalten, um zu schwimmen und dann abholen mit den Reverse-Pinzette. </li><li> Vorsichtig (ohne Berührung der Fenster selbst) und gründlich beschmieren überschüssige Leitungen / Saccharose aus dem Rand des Fensters mit einem Kimwipe. Auch beschmieren die Rückseite eingekerbten Bereich mit einem abgerundeten Falte eines Kimwipe. ANMERKUNG: Das Ziel ist es, so wenig Kristallisation von Salzen oder Puffern auf der Oberfläche des Fensters wie möglich haben. </li><li> Stellen Sie das Fenster auf die Gittermatte. Stellen Sie sicher, dass das Fenster nicht auf dem Gittermatte flach, aber aufgestützt auf einer Kante (über die Kämme der Gittermatte) und berühren so wenig des Rastersmat wie möglich. Lassen Sie das Fenster trocken. </li></ol> 4. Proben Montage und Imaging <ol><li> Sobald die Probe getrocknet, überprüfen Sie die Anwesenheit von Zellen an den Fenstern mit einem Lichtmikroskop. Führen Sie diese Prüfung, bevor die Vorbereitung der Proben für den Transport in einem Synchrotron. </li><li> Verpacken Sie die Fenster für den Transport zum Synchrotron-Beamline-Hosting-Experiments. Sanft Anbringung der Fenster mit Klebeband auf beiden Seiten auf einem Glasobjektträger, dann bringt die Glasträger mit Klebeband an der Unterseite eines Kunststoff-Petrischale. Kleben Sie die Petrischale geschlossen. HINWEIS: Vor diesem Zeitpunkt können diese Schritte in einer beliebigen typischen Labor durchgeführt werden. Die folgenden Schritte am besten an einem Synchrotron-Beamline erfolgen. </li><li> Entfernen Sie das Klebeband vom Fenster vorsichtig mit einer Pinzette. Verwenden Sie Nagellack, in einer dünnen gleichmäßige Beschichtung auf dem Rand des Fensters, um die Fenster zu einem Aluminiumhalter durch die Beamline Mitarbeiter an der Synchrotron vorgesehen sichern. </li><li> Legen Sie die Aluminiumhalter ineine kinematische montieren, und dann legen Sie sie in die richtige Position in der Röntgenmikroskop. Montieren Sie die Probe auf einer Konsole den Anschluss an Motortische, innerhalb der Probenkammer an der Beamline. </li><li> Nach dem Verlassen der Probe Röntgenmikroskop Instrument Bereich (einen Stall von Blei gefüllten Wänden), Einrichtung der Scan. Verwendung Strahlrohr spezifische Software, wählen die entsprechende Fläche der Probe zu scannen, während der Anzeige der Position des Röntgenstrahls auf der Probe unter Verwendung einer Kamera mit einer Videofadenkreuz und ausgestattet vororientierte mit nachgeschaltetem Szintillator Kamera. </li><li> Wählen Sie die geeignete Auflösung für die Probe, auf der Grundlage einer Schätzung der Größe des kleinsten interessierenden Merkmals. Zur Abbildung einzelner Säugetierzellen (~ 20-40 &amp; mgr; m in der Größe), verwenden Sie eine Auflösung von 0,25 bis 0,5 &amp; mgr; m. Zum Abbilden Bereiche von Geweben und Unterscheidung von Zellschichten voneinander Verwenden einer Auflösung von 2-20 um. </li><li> Wählen Sie die passende Verweilzeit für die Probe, auf der Grundlage einer Schätzung der Menge des metal von Interesse vorhanden. Für einen schnellen Überblick Scan, oder wenn große Mengen an Metallen vorhanden sind, verwenden fly Scans mit Verweilzeiten von 30 bis 300 ms pro Pixel. Wenn wenig Material vorhanden ist, oder Metalle der niedrigen relativen Häufigkeit zu messen, verwenden Schritt Scans mit Haltezeiten von 1-2 Sekunden pro Pixel. </li><li> Programmieren Sie die Scans in die Strahllinie spezifische Software. Erwerben Sie ein Raster-Scan-Bild. Arbeiten Sie zusammen mit den Beamline Mitarbeiter, um die Daten mit einer Software, die die charakteristischen Energiespitzen für jedes Element zu identifizieren analysieren. </li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Röntgenfluoreszenz-Bildgebung ist in vielen Bereichen, einschließlich der Geowissenschaften, Materialwissenschaften und der chemischen Biologie 26-34 nützlich. Fortschritte in der Synchrotron-Röntgenstrahlen und ihre Fokussierung haben sehr hoher Intensität Strahlen erzeugt. Fokussierten Röntgenstrahlen ausreichend ist, um die endogenen Metallen in Zellen existieren nun erregt, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Silizium-Driftdetektortechnologie gemessen werden kann. Und das Studium der chemische...

Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht sowohl für die Identität und Menge der in einer Probe vorhandenen Elemente räumlich aufgelöst werden. Einfallenden Röntgenstrahlen, einer größer gewählt als die Elektronenbindungsenergie der schwerste Element von Interesse zu sein, Energie, die Überwindung der Bindungsenergie von Elektronen der inneren Schale an den Kern 1. Dadurch entsteht ein &quot;Loch&quot; in der Elektronenhülle. Als höherenergetischen Elektronen fallen in diese Löcher werden die Röntgenfluoreszenzstrahlung emittiert, dessen Wellenlänge abhängig von der Energie Trennung dieser Orbitale. Da der Energieabstand der Orbitale ist charakteristisch für ein gegebenes Element weist die Röntgenfluoreszenzemission ebenfalls charakteristischen Wellenlängen, abhängig von dem Element. Es ist diese Emission bei einer charakteristischen Wellenlänge, welche die Identifikation der vorhandenen Elemente ermöglicht. Die Kalibrierung der Fluoreszenzintensität ermöglicht die Quantifizierung der vorhandenen Elemente. Röntgenfluoreszenz microscopy (XFM) zunehmend genutzt, zum Teil auf die Entwicklung von sehr brillanten Röntgensynchrotronquellen, wie sie bei Spring-8 in Japan, der Europäischen Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Frankreich und der Advanced Photon Source ( APS) in den USA 2. Diese Quellen liefern eine sehr hohe Intensität von Röntgenstrahlen. Zur gleichen Zeit, Verbesserung der Röntgenoptik, wie Zonenplatte Technologie, erlaubt die Fokussierung dieser Strahlen auf Sub-Mikrometer-Spots, wenn auch eher ineffizient 3. Mit sehr hoher Intensität Strahlen, auch eine relativ kleine Menge an Licht, das konzentriert sein kann, ist ausreichend, um die endogenen Metallen in Zellen anzuregen, wodurch Signal, das mit den derzeit verfügbaren Detektortechnologie gemessen werden kann. So studieren die chemische Biologie der Metalle in der Zelle ist eine Anwendung insbesondere die Verwendung von vielen der jüngsten Entwicklungen in dieser Technik 4-10 macht. Es gibt viele wichtige Faktoren, die in Betracht gezogen werden, während AppLiegen XFM, um die Elementverteilung und Quantifizierung von kultivierten Säugerzellen oder anderen biologischen Proben zu untersuchen. Erstens muss die Probe intakt gehalten werden soll, sowohl strukturell als auch in bezug auf die elementare Zusammensetzung, damit die Messung aussagekräftig zu sein. Zweitens muss die Probe auch in irgendeiner Weise gespeichert, dass sie hart zur Strahlungsschäden, die durch einen fokussierten Röntgenstrahl verursacht werden kann, ist. Eine Möglichkeit, dass eine Probe nur eines dieser Kriterien auf einmal zu erfüllen ist es, sich schnell zu einem glasartigen, amorphen Eis 11,12 eingefroren werden. Schockgefrieren wird oft durch verschiedene Kryokonservierung Techniken wie Tauch Einfrieren oder Hochdruckgefrier 13-16 erreicht. Es ist allgemein anerkannt, dass die Kryokonservierung bewahrt Gesamtzellarchitektur und chemischen Zusammensetzungen in biologischen Proben so nahe nativen Zustand möglich. Chemische Fixierung, auf der anderen Seite, aufgrund der langsamen und selektive Durchdringung von Fixiermittel in Zellen und Geweben als well als nachträgliche Veränderungen in der Membrandurchlässigkeit, können verschiedene zelluläre Ionen besonders die diffundierbare Ionen wie Cl, Ca und K, um ausgelaugt werden, verloren oder verlegt werden, so machen Untersuchung dieser Elemente suboptimal 17-19 ermöglichen. Trotz der klaren Vorteile der Kryo-Fixierung über chemische Fixierung im Allgemeinen, für adhärente Säugetierzellen hat insbesondere die Kryokonservierung verschiedenen Einschränkungen 20-23. Der offensichtlichste ist, dass nicht jede Forschungslabor hat leichten Zugang zu Kryokonservierung Instrumente. Für aktuelle Hochdruckgefriergeräte oder sogar stürzen Gefriergeräte sind teuer und gehören, nur eine Teilmenge der Kryo Einrichtungen, die weit von dem Zellen inkubiert werden kann. Der Vorteil der Kryokonservierung könnte zum Nachteil des Reise Stress auf die Zellen gegeben gehandelt werden. Während also die Kryokonservierung ist sicherlich die härteste Weg, um Proben für die Röntgenfluoreszenzanalyse zu erhalten, ist es sicherlich nicht die zugänglich für alle Forscher, unter allen Umständen;es ist auch nicht immer erforderlich - wenn die Metalle von Interesse sind eng fixierbar Makromoleküle gebunden sind, und die Auflösung, mit der die Probe abgebildet wird größer als die Beschädigung der ultraMikroStruktur, die während der Trocknung auftreten könnte, ist. Eingedenk der Vorbehalte 24 kann chemische Fixierung und Trocknung eine geeignete Wahl sein. Andere Faktoren, die zu einer erfolgreichen Röntgenfluoreszenz-Bildgebung Test einbezogen korrekte Analyse. Röntgen-Fluoreszenz-Bildgebung ist grundsätzlich Röntgenfluoreszenzemissionsspektroskopie kombiniert mit Rasterabtastformat die räumliche Auflösung zu liefern. Die gesammelten Röntgenfluoreszenzemissionsspektren enthalten eine Kombination von überlappenden Emissionsspitzen, den Hintergrund und die elastischen und inelastischen Streuungspeaks des einfallenden Strahls. Software, die die Entfaltungs dieser Beiträge und der Anpassung der Emissionsspitzen ermöglicht, hat zu diesem Bereich 25 schon eine kritische Entwicklung. Auch die Entwicklung und kommerzielle distribution Dünnschicht Standards bekannter Zusammensetzung verwendet, um die Fluoreszenzintensität relativ zur Materialmenge zu kalibrieren, wurde auch sehr wichtig. Dieses Protokoll stellt eine Beschreibung der Herstellung der haftenden Zellen durch chemische Fixierung und Lufttrocknung. Ein wichtiger Schritt in diesem Prozess ist das Wachstum der Zellen auf den Siliziumnitrid-Fenster, die oft nicht gut an, so dass sanfte Spülung in einer bestimmten Art und Weise der Schlüssel zum Erfolg.

<table><tbody><tr><td>Siliziumnitrid-Fenster</td><td>Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Vereinigtes Königreich</td><td>SiRN-5.0-200-2.0-200. Ordnen Sie nach Größe. Membrangröße: 1,5 mm x 1,5 mm. Dicke: 200&nbsp; Nm. Rahmengröße: 5&nbsp; mm x 5 mm. Dicke des Rahmens: 200 μm.</td><td>Alternative Quelle: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.</td></tr><tr><td>Reverse Tpinez</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gebührenfrei: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>78520-5X</td><td>EMS 5X, NC &ndash; Ultrafeine Pinzette</td></tr><tr><td>Gummigittermatte</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences, Postfach 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, gebührenfrei: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>71170</td><td>Runde Gittermatte</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>338826</td><td>konzentrierte Essigsäure</td></tr><tr><td>PIPES Puffer</td> <td>in SpurenmetallqualitätSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>P6757</td><td>fester PIPES Puffer</td></tr><tr><td>Formaldehyd-Stammlösung</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Gebührenfrei: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>RT 17113</td><td>10 x 10 ml Ampullen mit 20% wässrigem Paraformaldehyd</td></tr></tbody></table>

vorbereitung adhärenter zellen für die röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische fixierung

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Die Röntgenfluoreszenzbildgebung ermöglicht es uns, die räumliche Verteilung und Konzentration mehrerer Elemente gleichzeitig über große oder kleine Probenbereiche zerstörungsfrei zu messen. Es wurde in vielen Bereichen der Wissenschaft angewendet, darunter in den Materialwissenschaften, in den Geowissenschaften, in der Erforschung von Werken des kulturellen Erbes und in der chemischen Biologie. Im Falle der chemischen Biologie ermöglicht die Visualisierung der Metallverteilungen innerhalb von Zellen beispielsweise, sowohl natürlich vorkommende Metallionen in den Zellen als auch exogen eingeführte Metalle wie Medikamente und Nanopartikel zu untersuchen. Aufgrund der vollständig hydratisierten Natur fast aller biologischen Proben stellt die Kryofixierung mit anschließender Bildgebung unter kryogener Temperatur die ideale derzeit verfügbare Bildgebungsmodalität dar. Unter den Umständen, unter denen eine solche Kombination nicht leicht zugänglich oder praktikabel ist, bleibt die chemische Fixierung auf Aldehydbasis nützlich und manchmal unvermeidlich. Dieser Artikel beschreibt so detailliert wie möglich die Präparation von adhärenten Säugetierzellen durch chemische Fixierung für die Röntgenfluoreszenzbildgebung.

Die Fähigkeit der Röntgenfluoreszenzabbildung, um Informationen über biologische Proben bereitzustellen ist abhängig wobei diese Proben in einer Weise, dass sie robust gegenüber Strahlungsschäden auf der Zeitskala des Experiments sind, hergestellt, und doch ihre chemischen und strukturellen Merkmale gut erhalten. Bei der Betrachtung des Ergebnisses einer Probe, die hergestellt wurde wie oben beschrieben und abgebildet wird, ist es möglich zu sehen, dass es eine Variation in der vorhandenen Elemente - was anzeigt, daß Fi...

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung der Menge und Verteilung von Metallen in einer Probe mittels Synchrotron-Röntgenfluoreszenz. Wir konzentrieren uns auf adhärente Zellen und beschreiben die chemische Fixierungsmethode zur Vorbereitung dieser Probe. Anschließend beschreiben wir, wie die Probe mit Synchrotron-Röntgenstrahlen eingefasst und abgebildet wird.

Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Verteilung von Metallen in einer Zellpopulation abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst sterile Siliziumnitrid-Fenster hergestellt und anschließend Zellen auf diesen Fenstern kultiviert werden. Danach werden die Zellen fixiert, in einen verträglichen Puffer gespült und getrocknet. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen an der Messstelle abzubilden. Letztendlich wird die Röntgenfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Verteilung von Metallen in der Zelle darzustellen. In der Regel haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da die Fenster sehr empfindlich sind.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das Kultivieren von Zellen auf den Fenstern mit minimaler Zellaggregation sowie die Spülschritte schwierig sind, weil die Zellen nicht gut an den Röntgenfluoreszenz-Substraten haften. Die erste Aufgabe besteht darin, das Fenster zu isolieren. Zuerst überprüfen Sie mithilfe eines Stereomikroskops, ob ein Paar umgekehrt spitzer Pinzette gerade ausgerichtet und sauber ist.Öffnen Sie als Nächstes leicht die Kapsel, die das Fenster enthält. Drücken Sie ein Ende, das das Fenster enthält, während Sie das andere Ende drehen. Drücken Sie nicht auf das Fenster selbst.Dann greifen Sie vorsichtig mit der Pinzette den Rahmen, während Sie die Kapsel nahe dem geöffneten Ende sanft zusammendrücken. Üben Sie Druck aus, um die Kapsel an der Stelle zu verbreitern, an der die Fensterränder austreten sollen, und entfernen Sie das Fenster. Bereiten Sie nun etwas Klebeband vor.Bringen Sie ein Stück Klebeband auf einem sauberen Objektträger an und schneiden Sie einen viertel Zoll breiten Streifen vom langen Rand des Objektträgers ab. Anschließend platzieren Sie ein Stück Klebeband an der kurzen Seite und entfernen den Abschnitt des Klebebands mit einer Pinzette. Befestigen Sie das Klebeband an der Fensterkante mit ausreichend Druck, um es haften zu lassen, und achten Sie darauf, die Fensteröffnung nicht mit dem Klebeband zu bedecken.Setzen Sie mit der Pinzette das Deckglas in den Boden einer Kulturschale ein und drücken Sie das Klebeband fest auf die Schale. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die andere Seite des Deckglases mit Klebeband zu befestigen. Die Schale sollte anschließend eine Stunde lang einer UV-Bestrahlung zur Sterilisation ausgesetzt werden.Dieses Protokoll erfordert, dass die Zellen auf Schalen mit angebrachtem Fenster bis zu einer Konfluenz von 50 bis 70 % gezüchtet werden. Eventuelle lebende Färbungen werden aufgebracht und die Zellen vor der Fixierung abgebildet. Entfernen Sie das Medium durch vorsichtiges Absaugen, wobei die Schale in einem Winkel von 45 Grad gekippt wird.Anschließend die Schale vorsichtig mit DPBS spülen. Die entfernte Flüssigkeit sofort ersetzen, indem frische 4% P-F-A-P-B-S vorsichtig in einem Winkel von 45 Grad und entlang der Seite der Schale zugegeben wird. Den Winkel langsam verringern, um sicherzustellen, dass die Fixierungslösung die Deckgläser vollständig bedeckt.Belassen Sie das Fixierungsmittel 20 Minuten lang nach der Fixierung auf den Zellen. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch vorsichtiges Absaugen. Ersetzen Sie die Flüssigkeit unter Verwendung derselben schonenden Technik vorsichtig durch Puffer.Zuckerkreis. Die Technik zum Entfernen und Ersetzen der Flüssigkeit ist entscheidend, da die Zellen schlecht an den Substraten haften. Hier ist es vielen Anfängern passiert, dass ihre Experimente fehlschlugen.Danach vorsichtig die Rohrzuckerlösung austauschen, um jegliche Reste des Fixiers zu entfernen. Nun das Fenster entfernen, indem das Klebeband mit einer Pinzette angefasst wird. Falls die Fenster sich vom Klebeband lösen, das Fenster mit zusätzlicher Lösung an die Oberfläche schwimmen lassen und mit der umgekehrten Pinzette entfernen.Berühren Sie das Fenster nun nicht mehr und verteilen Sie die Lösung vollständig vom Rand her mit einem Tupfer. Tupfen Sie auch den vertieften Bereich mit einer abgerundeten Gewebefalte ab. Ziel ist es, so wenig Kristallisation von Salz oder Puffer wie möglich auf dem Fenster zu erhalten.Zuletzt platzieren Sie das Fenster vorsichtig auf der Gittermatte, die an einer Kante gegen die Erhöhung in der Matte angelehnt ist. Das Fenster sollte die Matte so wenig wie möglich berühren. Sobald die Probe getrocknet ist, überprüfen Sie mithilfe eines Lichtmikroskops das Vorhandensein von Zellen auf den Fenstern.Nachdem bestätigt wurde, dass sich die Zellen auf den Fenstern befinden, verpacken Sie die Fenster für den Transport zur Synchrotron-Strahllinie. Befestigen Sie die Fenster vorsichtig an zwei Kanten mit Klebeband auf einem Objektträger. Anschließend befestigen Sie den Objektträger mit Klebeband auf einer Kunststoff-Petri-Schale und verschließen Sie die Petri-Schale mit Klebeband.Bis zu diesem Punkt können die Schritte in jedem typischen Labor durchgeführt werden; die folgenden Schritte sollten am besten an einer Synchrotron-Strahllinie durchgeführt werden. Das Öffnen des Fensters beginnt damit, das Klebeband vorsichtig mit einer Pinzette zu entfernen. Anschließend wird das Fenster in einen Aluminiumhalter überführt, der von den Kooperationspartnern an der Synchrotron-Strahllinie bereitgestellt wurde.Befestigen Sie das Fenster mit einem dünnen, gleichmäßigen Streifen Nagellack entlang seiner Kante. Setzen Sie nun den Aluminiumhalter in eine kinematische Halterung ein. Befestigen Sie die Halterung an einer Klammer, die mit dem motorisierten Probentisch verbunden ist und sich innerhalb der Probenkammer und im Strahlengang des Röntgenmikroskops befindet.Nach dem Verlassen der Leitung zum Röntgenmikroskop-Instrumentenbereich die Messung mit der strahllinien-spezifischen Software einrichten. Den geeigneten Bereich der Probe zum Scannen auswählen, während die Position des Röntgenstrahls auf der Probe beobachtet wird. Mithilfe einer Kamera, die mit einem videobasierten Fadenkreuz ausgestattet ist und zuvor mit einer stromabwärts angeordneten Szintillatorkamera justiert wurde, finden sich weitere Details im textbasierten Protokoll.Mithilfe dieser Techniken ist es in den Röntgenbildern einer Probe möglich, Unterschiede in den vorhandenen Elementen zu erkennen, was darauf hinweist, dass die Fixierung diese Aspekte der Zellen erhält, wie beispielsweise bei dieser menschlichen HSY five Y-Zelle. Wenn jedoch Puffer während des Trocknens vorhanden bleibt, führt dies zu umfangreicher Kristallbildung, die die Zellen strukturell beschädigt und die Aufnahme der Röntgenfluoreszenzspektren stört. Dies ist bei einer schlecht aufbereiteten RET B 1 0 3-Zelle zu sehen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man adhärente Zellen durch chemische Fixierung für die Röntgenfluoreszenzbildgebung vorbereitet. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Formaldehyd und biologischen Materialien äußerst gefährlich sein kann, und beachten Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie den Einsatz geeigneter PSA und die Einhaltung der institutionellen Richtlinien, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Quelle: Schumacher, D., et al. Fluoreszenz-Lebendzellbildgebung des vollständigen vegetativen Zellzyklus des langsam wachsenden sozialen Bakteriums Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert die Vorbereitung und Bildgebung von Myxococcus xanthus, einem langsam wachsenden Bodenbakterium. Die Kultur wird in einem Medium angebaut, auf einen Deckdeckel mit fluoreszierenden Mikrosphären aufgetragen und mit einem vorgewärmten Agarose-Pad überlagert, um die Hydratation und...

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Automatisierte Bildgebung und Analyse zur Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Makropinosomen

Hier stellen wir eine Pipeline für das 3D-korrelative fokussierte Ionenstrahlfräsen vor, um die Präparation zellulärer Proben für die Kryo-Elektronentomographie zu steuern. Die 3D-Position von fluoreszenzmarkierten Proteinen von Interesse wird zunächst durch Kryo-Fluoreszenzmikroskopie bestimmt und dann gezielt gemahlen. Das Protokoll eignet sich für Säugetier-, Hefe- und Bakterienzellen.

Probenvorbereitung durch 3D-korrelatives fokussiertes Ionenstrahlfräsen für die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie

Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.

Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird

Hier präsentieren wir ein vielseitiges äquibiaxiales Streckgerät, das pneumatisch betätigt wird und mit der hochauflösenden Mikroskopie kompatibel ist.

Äquibiaxiales Stretching-Gerät für die konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen mit hoher Vergrößerung

Ein einfaches Protokoll, um die neutrale Lipidgehalt der Algenzellen zu bestimmen, mit einer Nil-Rot-Färbung Verfahren beschrieben. Diese zeitsparende Technik bietet eine Alternative zu herkömmlichen gravimetrischen basierten Lipid Quantifizierung Protokolle. Es ist für die spezielle Anwendung der Überwachung Bioprozess Leistung ausgelegt.

Eine einfache und schnelle Protokoll zur Messung neutralen Lipiden in Algenzellen mit Fluoreszenz

Erfahren Sie die chemische Fixierung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung. Dieses Protokoll zeigt die Vorbereitung von Siliziumnitrid-Fenstern und die Metallverteilungsanalyse in Zellpopulationen.

Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

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