Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Verteilung von Metallen in einer Zellpopulation abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst sterile Siliziumnitrid-Fenster hergestellt und anschließend Zellen auf diesen Fenstern kultiviert werden. Danach werden die Zellen fixiert, in einen verträglichen Puffer gespült und getrocknet.

Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen an der Messstelle abzubilden. Letztendlich wird die Röntgenfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Verteilung von Metallen in der Zelle darzustellen. In der Regel haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten, da die Fenster sehr empfindlich sind.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das Kultivieren von Zellen auf den Fenstern mit minimaler Zellaggregation sowie die Spülschritte schwierig sind, weil die Zellen nicht gut an den Röntgenfluoreszenz-Substraten haften. Die erste Aufgabe besteht darin, das Fenster zu isolieren. Zuerst überprüfen Sie mithilfe eines Stereomikroskops, ob ein Paar umgekehrt spitzer Pinzette gerade ausgerichtet und sauber ist.

Öffnen Sie als Nächstes leicht die Kapsel, die das Fenster enthält. Drücken Sie ein Ende, das das Fenster enthält, während Sie das andere Ende drehen. Drücken Sie nicht auf das Fenster selbst.

Dann greifen Sie vorsichtig mit der Pinzette den Rahmen, während Sie die Kapsel nahe dem geöffneten Ende sanft zusammendrücken. Üben Sie Druck aus, um die Kapsel an der Stelle zu verbreitern, an der die Fensterränder austreten sollen, und entfernen Sie das Fenster. Bereiten Sie nun etwas Klebeband vor.

Bringen Sie ein Stück Klebeband auf einem sauberen Objektträger an und schneiden Sie einen viertel Zoll breiten Streifen vom langen Rand des Objektträgers ab. Anschließend platzieren Sie ein Stück Klebeband an der kurzen Seite und entfernen den Abschnitt des Klebebands mit einer Pinzette. Befestigen Sie das Klebeband an der Fensterkante mit ausreichend Druck, um es haften zu lassen, und achten Sie darauf, die Fensteröffnung nicht mit dem Klebeband zu bedecken.

Setzen Sie mit der Pinzette das Deckglas in den Boden einer Kulturschale ein und drücken Sie das Klebeband fest auf die Schale. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die andere Seite des Deckglases mit Klebeband zu befestigen. Die Schale sollte anschließend eine Stunde lang einer UV-Bestrahlung zur Sterilisation ausgesetzt werden.

Dieses Protokoll erfordert, dass die Zellen auf Schalen mit angebrachtem Fenster bis zu einer Konfluenz von 50 bis 70 % gezüchtet werden. Eventuelle lebende Färbungen werden aufgebracht und die Zellen vor der Fixierung abgebildet. Entfernen Sie das Medium durch vorsichtiges Absaugen, wobei die Schale in einem Winkel von 45 Grad gekippt wird.

Anschließend die Schale vorsichtig mit DPBS spülen. Die entfernte Flüssigkeit sofort ersetzen, indem frische 4% P-F-A-P-B-S vorsichtig in einem Winkel von 45 Grad und entlang der Seite der Schale zugegeben wird. Den Winkel langsam verringern, um sicherzustellen, dass die Fixierungslösung die Deckgläser vollständig bedeckt.

Belassen Sie das Fixierungsmittel 20 Minuten lang nach der Fixierung auf den Zellen. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch vorsichtiges Absaugen. Ersetzen Sie die Flüssigkeit unter Verwendung derselben schonenden Technik vorsichtig durch Puffer.

Zuckerkreis. Die Technik zum Entfernen und Ersetzen der Flüssigkeit ist entscheidend, da die Zellen schlecht an den Substraten haften. Hier ist es vielen Anfängern passiert, dass ihre Experimente fehlschlugen.

Danach vorsichtig die Rohrzuckerlösung austauschen, um jegliche Reste des Fixiers zu entfernen. Nun das Fenster entfernen, indem das Klebeband mit einer Pinzette angefasst wird. Falls die Fenster sich vom Klebeband lösen, das Fenster mit zusätzlicher Lösung an die Oberfläche schwimmen lassen und mit der umgekehrten Pinzette entfernen.

Berühren Sie das Fenster nun nicht mehr und verteilen Sie die Lösung vollständig vom Rand her mit einem Tupfer. Tupfen Sie auch den vertieften Bereich mit einer abgerundeten Gewebefalte ab. Ziel ist es, so wenig Kristallisation von Salz oder Puffer wie möglich auf dem Fenster zu erhalten.

Zuletzt platzieren Sie das Fenster vorsichtig auf der Gittermatte, die an einer Kante gegen die Erhöhung in der Matte angelehnt ist. Das Fenster sollte die Matte so wenig wie möglich berühren. Sobald die Probe getrocknet ist, überprüfen Sie mithilfe eines Lichtmikroskops das Vorhandensein von Zellen auf den Fenstern.

Nachdem bestätigt wurde, dass sich die Zellen auf den Fenstern befinden, verpacken Sie die Fenster für den Transport zur Synchrotron-Strahllinie. Befestigen Sie die Fenster vorsichtig an zwei Kanten mit Klebeband auf einem Objektträger. Anschließend befestigen Sie den Objektträger mit Klebeband auf einer Kunststoff-Petri-Schale und verschließen Sie die Petri-Schale mit Klebeband.

Bis zu diesem Punkt können die Schritte in jedem typischen Labor durchgeführt werden; die folgenden Schritte sollten am besten an einer Synchrotron-Strahllinie durchgeführt werden. Das Öffnen des Fensters beginnt damit, das Klebeband vorsichtig mit einer Pinzette zu entfernen. Anschließend wird das Fenster in einen Aluminiumhalter überführt, der von den Kooperationspartnern an der Synchrotron-Strahllinie bereitgestellt wurde.

Befestigen Sie das Fenster mit einem dünnen, gleichmäßigen Streifen Nagellack entlang seiner Kante. Setzen Sie nun den Aluminiumhalter in eine kinematische Halterung ein. Befestigen Sie die Halterung an einer Klammer, die mit dem motorisierten Probentisch verbunden ist und sich innerhalb der Probenkammer und im Strahlengang des Röntgenmikroskops befindet.

Nach dem Verlassen der Leitung zum Röntgenmikroskop-Instrumentenbereich die Messung mit der strahllinien-spezifischen Software einrichten. Den geeigneten Bereich der Probe zum Scannen auswählen, während die Position des Röntgenstrahls auf der Probe beobachtet wird. Mithilfe einer Kamera, die mit einem videobasierten Fadenkreuz ausgestattet ist und zuvor mit einer stromabwärts angeordneten Szintillatorkamera justiert wurde, finden sich weitere Details im textbasierten Protokoll.

Mithilfe dieser Techniken ist es in den Röntgenbildern einer Probe möglich, Unterschiede in den vorhandenen Elementen zu erkennen, was darauf hinweist, dass die Fixierung diese Aspekte der Zellen erhält, wie beispielsweise bei dieser menschlichen HSY five Y-Zelle. Wenn jedoch Puffer während des Trocknens vorhanden bleibt, führt dies zu umfangreicher Kristallbildung, die die Zellen strukturell beschädigt und die Aufnahme der Röntgenfluoreszenzspektren stört. Dies ist bei einer schlecht aufbereiteten RET B 1 0 3-Zelle zu sehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man adhärente Zellen durch chemische Fixierung für die Röntgenfluoreszenzbildgebung vorbereitet. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Formaldehyd und biologischen Materialien äußerst gefährlich sein kann, und beachten Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie den Einsatz geeigneter PSA und die Einhaltung der institutionellen Richtlinien, während Sie dieses Verfahren durchführen.