Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Lebenszyklus des hochpathogenen Ebola-Virus unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe zwei zu modellieren. Dies wird erreicht, indem virusähnliche Partikel hergestellt werden, die dieselbe Proteinzusammensetzung wie Ebola-Viruspartikel aufweisen, jedoch ein Mini-Genom anstelle des viralen Genoms tragen. Ein Mini-Genom ist eine verkleinerte Version des viralen Genoms, bei der virale Gene entfernt und durch ein Reportergen wie Luciferase ersetzt wurden.

Wichtig ist, dass das für dieses Experiment verwendete Mini-Genom weiterhin eine Reihe viraler Gene trägt, die für die viralen Proteine VP40, GP-1,2 und VP24 kodieren. Virenähnliche Partikel werden erzeugt, indem ein Mini-Genom in 293T-Zellen, sogenannten Produzentenzellen, zusammen mit den viralen Proteinen NP, VP35, VP30 und L exprimiert wird, die gemeinsam auch als RNP-Proteine bezeichnet werden.

Das Mini-Genom wird anschließend von den viralen Proteinen repliziert und in mRNAs transkribiert. Die mRNAs kodieren für den Luciferase-Reporter sowie die zusätzlichen viralen Proteine VP40, GP-eins zwei und VP24. Gemeinsam führen diese drei Proteine zur Bildung virusähnlicher Partikel, die als transkriptions- und replikationskompetente virusähnliche Partikel oder TRVLPs bezeichnet werden, da die Nukleokapside in ihnen in der Lage sind, Genomreplikation und Transkription durchzuführen. Da TLPs das Glykoprotein GP-eins zwei des Ebola-Virus tragen, können sie Zielzellen infizieren.

Diese Zielzellen wurden zuvor mit Expressionsplasmiden für np, VP35, VP30 und L transfiziert. Gemeinsam erkennen diese RNP-Proteine das Mini-Genom, das mithilfe der TRVLPs in die Zielzellen eingebracht wurde. Das Mini-Genom wird daraufhin repliziert und transkribiert, was zu Reporteraktivität sowie zur Produktion neuer TRVLPs führt, die erneut zur Infektion neuer Zielzellen verwendet werden können.

Wichtig ist, dass das Mini-Genom nicht die genetische Information trägt, die für seine Replikation erforderlich ist. Daher können TRVLPs Zellen, die die vier RNP-Proteine nicht exprimieren, nicht produktiv infizieren. Dies macht das System sicher für die Verwendung unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe zwei.

Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, den gesamten Viruslebenszyklus zu modellieren, einschließlich der Genomreplikation, der Expression viraler Genprodukte, der Produktion von Viruspartikeln und der Infektion von Zielzellen über mehrere Injektionsfaktorzyklen unter Biosicherheitsstufe-2-Bedingungen. Das bedeutet, dass diese Arbeiten ohne ein Labor mit maximaler Sicherheitsstufe durchgeführt werden können, das andernfalls für Arbeiten mit lebenden Ebola-Viren erforderlich wäre. Diese Methode kann mit anderen Techniken kombiniert werden, wie beispielsweise der RNA-vermittelten Herunterregulation zellulärer Faktoren oder der Überexpression dieser Faktoren, um die Rolle dieser Faktoren in der Virusbiologie zu untersuchen. Außerdem können wir Mutationen in die Virusgene einbringen, um die Rolle dieser Virusgene und ihrer Genprodukte für die Virusbiologie zu untersuchen.

Teilen Sie die Zellen, indem Sie das Medium von 80 bis 90 % konfluenten 293T-Zellen entfernen, die Zellen zweimal mit PBS waschen und zwei Milliliter Trypsin zu den Zellen geben. Warten Sie, bis sich die Zellen abgerundet haben.

Dann lösen Sie sie durch Vorsichtiges Antippen des Kolbens und Zugabe von acht mL Medium mit 10 % FBS zu den Zellen. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts, verdünnen Sie die Zellen anschließend auf zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter und geben Sie je zwei mL in jedes Brunnen einer sechs-Brunnen-Platte. Stellen Sie die Zellen in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad mit 5 % CO2 zurück. Transfizieren Sie die Zellen nach 24 Stunden mit den für die Produktion von TRVLPs erforderlichen Plasmiden. Pipettieren Sie im Biosicherheitswerkbank (BSC) die DNA unter Verwendung von Filterpipettenspitzen in ein Reaktionsgefäß. Als negativen Kontrollansatz wird in einem Brunnen das Plasmid, das die virale Polymerase L kodiert, weggelassen; stattdessen kann ein Plasmid, das GFP kodiert, transfiziert werden, um die Transfektionseffizienz zu visualisieren. Geben Sie danach 100 Mikroliter Opti-MEM pro Brunnen zur DNA hinzu. Vortexen Sie das Reaktionsgefäß und zentrifugieren Sie es kurz.

Fügen Sie anschließend 7,5 µL TransIT LT-one-Transfektionsreagenz zur verdünnten DNA hinzu. Vortexen Sie das Gefäß vorsichtig und inkubieren Sie es 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach 15 Minuten mischen Sie das Transfektionsgemisch vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und geben dann 100 µL tropfenweise in jedes Brunnen einer 6-Loch-Platte.

Nachdem Sie die Transfektionskomplexe den Zellen hinzugefügt haben, schwenken Sie die Platte vorsichtig nach vorne und hinten sowie von Seite zu Seite. Drehen Sie die Platte nicht im Kreis, da dies zu einer ungleichmäßigen Transfektion führen würde. Danach bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück. 24 Stunden nach der Transfektion entfernen Sie das Überstandmedium von den Zellen. Geben Sie anschließend vier Milliliter Medium mit 5 % FBS zu den Zellen und stellen Sie sie erneut in den Inkubator.

24 Stunden nach der Transfektion der produzierenden Zellen 293T-Zellen wie zuvor beschrieben aufteilen. 24 Stunden nach der Aufteilung transfizieren Sie diese mit den Plasmiden, die die Ebola-Virus-RNP-Proteine sowie Tim-one, das als Adhäsionsfaktor für Ebola-Viren dient, kodieren. 72 Stunden nach der Transfektion der produzierenden Zellen und 24 Stunden nach der Transfektion der Zielzellen das Überstandmedium der produzierenden Zellen sammeln und in ein 15-Milliliter-Gefäß pipettieren.

Nachdem Sie das Überstand entfernt haben, beseitigen Sie jegliche restliche Flüssigkeit und geben 250 Mikroliter Glow-Lysispuffer zu den Zellen hinzu. Inkubieren Sie sie mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur. Danach bestimmen Sie die Luciferase-Aktivität, wie in Schritt drei dieses Videos beschrieben. In der Zwischenzeit zentrifugieren Sie den Überstand der Produktionzellen fünf Minuten bei 800 ×g und Raumtemperatur.

Entfernen Sie dann das Medium von den Zielzellen und geben Sie drei Milliliter des klaren Überstandes der P-Null-Zellen zu den Zielzellen hinzu. Führen Sie dies nacheinander je nach Zelle durch. Wenn Sie fertig sind, stellen Sie die Zielzellen zurück in den Inkubator. 24 Stunden nach der Infektion.

Entfernen Sie den Überstand von den Zielzellen. Geben Sie anschließend vier Milliliter Medium mit 5 % FBS zu den Zellen hinzu und stellen Sie sie in den Inkubator zurück. Um die Reporteraktivität in Produzenten- oder Zielzellen zu bestimmen, werden diese Zellen 72 Stunden nach der Transfektion im Fall der Produzentenzellen bzw. 72 Stunden nach der Infektion im Fall der Zielzellen geerntet.

Entfernen Sie dazu den Überstand von den Zellen und geben Sie 250 Mikroliter Glow-Lysispuffer zu den Zellen hinzu. Inkubieren Sie sie mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur. Falls gewünscht, kann der Überstand verwendet werden, um einen frischen Satz Zielzellen zu infizieren. In diesem Fall sammeln Sie den Überstand und infizieren die Zielzellen, wie in Schritt zwei dieses Videos beschrieben.

Inzwischen 40 µl pro Vertiefung Luciferase-Assay-Puffer auftauen und ein Hundertstel des Volumens Luciferase-Substrat zum Puffer hinzufügen. Den fertigen Luciferase-Reagenz sorgfältig verwirbeln und sicherstellen, dass er Raumtemperatur erreicht hat, bevor Sie fortfahren. Danach 40 µl des Reagenzes in eine weiße, undurchsichtige 96-Loch-Platte pipettieren. Um Probleme mit Crosstalk zu vermeiden, empfiehlt es sich, zwischen den Probenvertiefungen jeweils eine Vertiefung frei zu lassen. Nach Ablauf der 10-minütigen Inkubation die Zellen durch Pipettieren in den Lysepuffer lösen und das Zelllysat in ein Reagenzglas überführen. Die Lysate drei Minuten bei 10.000 g und Raumtemperatur zentrifugieren. Danach 40 µl der Lysate in die 96-Loch-Platte mit dem Luciferase-Reagenz pipettieren. Die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach diesen 10 Minuten die Luciferase-Aktivität mittels eines Luminometers messen. Die Integrationszeit für die Lumineszenzmessung sollte eine Sekunde betragen. Bei Verwendung eines Modulus-Mikroplatten-Luminometers sollten typische Lumineszenzsignale der positiven Kontrolle bei etwa 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁷ liegen, während das Signal der negativen Kontrolle mindestens zwei bis drei Größenordnungen niedriger sein sollte. In nachfolgenden Durchgängen sollte die Reporteraktivität in den positiven Kontrollen stabil bleiben, während die Reporteraktivität in den negativen Kontrollen auf Hintergrundwerte abfällt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ebolavirusreplikations- und transkriptionskompetente virusähnliche Partikel herzustellen, diese zur Infektion von Zielzellen zu verwenden und die Reporteraktivität in produzierenden und Zielzellen zu messen.

Wichtig ist, dass diese Methode mit anderen Techniken kombiniert werden kann, beispielsweise mit der RNA-vermittelten Herunterregulation zellulärer Faktoren, um die Rolle dieser Faktoren in der Virologie zu untersuchen. Außerdem können Mutationen in den viralen Komponenten eingeführt werden, die in dieser Methode verwendet werden, um die Funktion dieser Komponenten im Lebenszyklus des Ebola-Virus zu untersuchen. Weitere experimentelle Einzelheiten und spezifische Reagenzien sind in der der vorliegenden Videoaufnahme beiliegenden Publikation zu finden.