Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten
December 6th, 2014
Dieses Protokoll beschreibt die schnelle nicht-enzymatische Dissoziation von frischen menschlichen Gewebefragmenten zur qualitativen und quantitativen Beurteilung von CD45+ Zellen (Lymphozyten/Leukozyten), die in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben vorhanden sind. Zusätzlich kann der aus dem primären Gewebehomogenat gewonnene Überstand gesammelt und für weitere Analysen oder Experimente gelagert werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, menschliche Gewebefragmente schnell und ohne enzymatischen Verdau in eine Einzelzellsuspension zu homogenisieren, um die qualitative und quantitative Analyse und die Isolierung spezifischer Lymphozyten-Subpopulationen zu ermöglichen. Dazu werden die Gewebefragmente zunächst mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke zerlegt. Als nächstes wird die Gewebeaufschlämmung in ein mechanisch dissoziiertes Röhrchen überführt, wo die Fragmente weiter zu einer Einzelzellsuspension homogenisiert werden.
Die Zellen werden dann durch Zentrifugation für die nachgelagerte Analyse gesammelt. Letztendlich kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die infiltrierenden Lymphozyten, Subpopulationen Asiaten, zu analysieren. Mein Labor hat diese Technik entwickelt, weil wir nach einer Möglichkeit gesucht haben, tumorinfiltrierende Lymphozyten abzubilden, ohne ihren nativen Zustand dramatisch zu beeinflussen.
Wir wollten etwas, mit dem wir die Zellen schnell isolieren und so analysieren können, wie sie bei der Operation waren. Diese Technik wurde in unserem Labor bei mehr als 300 Brusttumoren und normalem Gewebe angewendet, ist einfach anzuwenden und kann täglich angewendet werden. Es kann verwendet werden, um prognostische Marker, das Ansprechen auf die Behandlung und das klinische Langzeitergebnis zu untersuchen.
Diese Technik wird heute John Nicola Loic vorführen. Ein Techniker in meinem Labor Beginnen Sie mit dem Wiegen der Gewebeprobe und messen Sie dann die Länge, Breite und Höhe des Gewebes. Dann geben Sie das Gewebefragment in eine kleine Petrischale, die einen Milliliter des entsprechenden, chemisch definierten serumfreien hämatopoetischen Zellmediums enthält, und zerkleinern Sie die Proben mit einem sterilen Skalpell in kleine ein bis zwei Quadratmillimeter große Stücke.
Übertragen Sie anschließend den Schaleninhalt in ein mechanisches Dissoziationsröhrchen C und spülen Sie die Schale und das Skalpell mit zwei Millilitern Medium aus. Geben Sie die Wäsche in das C-Röhrchen und führen Sie dann das mechanische Dissoziationsprogramm a 0,01 zweimal hintereinander durch, um die Gewebefragmente sanft in eine Einzelzellsuspension zu homogenisieren. Nach dem zweiten Zyklus wird das Homogenat durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.
Verwenden Sie dann denselben Schädling wie Ihre Pipette vom Waschen der Petrischale, um die im C-Rohr verbleibende Flüssigkeit in das Zellsieb zu überführen. Verwenden Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Mikropipette, um die gefilterte Flüssigkeit in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen, und spülen Sie das C-Röhrchen mit weiteren drei Millilitern Medium aus. Übertragen Sie diese Wäsche durch das Zellsieb in das 50-Milliliter-Röhrchen.
Bewegen Sie dann das nicht homogenisierte Gewebe vorsichtig mit einer sauberen Ein-Milliliter-Spitze um das Sieb herum, um die maximale Menge an im Gewebe eingeschlossener Restflüssigkeit in das 50-Milliliter-Röhrchen zu drücken. Stellen Sie nun das Zellsieb kopfüber auf das ursprüngliche C-Rohr und spülen Sie das Sieb mit drei weiteren Millilitern Medium aus, so dass das nicht homogenisierte Gewebe wieder in das C-Rohr tropft. Homogenisieren Sie das Gewebe für zwei weitere Zyklen, wie gerade gezeigt, und gießen Sie dann dieses zweite Homogenat durch das Zellsieb.
Spülen Sie das C-Rohr erneut mit weiteren drei Millilitern Medium. Filtrieren Sie dann den Überstand durch das Sieb und drücken Sie die Restflüssigkeit wie eben gezeigt aus dem Gewebe. Zu diesem Zeitpunkt sollte ein Volumen von etwa 2,5 Millilitern Einzelzellsuspension in dem 15-Milliliter-Röhrchen vorhanden sein, und ungefähr neun Milliliter sollten in dem 50-Milliliter-Röhrchen beobachtet werden.
Um den Gewebeüberstand von der ersten Zentrifuge der Zellen zu trennen, werden beide Röhrchen 15 Minuten lang bei 600 g und Raumtemperatur homogenisiert, der Überstand aus dem 15-Milliliter-Röhrchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt, bei vier Grad Celsius platziert und der Überstand aus dem 50-Milliliter-Röhrchen verworfen. Klopfen Sie dann vorsichtig auf jedes Röhrchen auf eine harte Oberfläche, um jedes der Zellpellets aufzubrechen. Resuspendieren Sie das lose Zellpellet in der 50-Milliliter-Tube mit 500 Mikrolitern Medium und übertragen Sie die Zellen in die 15-Milliliter-Tube, um das zweite Pellet zu resuspendieren.
Spülen Sie dann das 50-Milliliter-Röhrchen mit weiteren 500 Mikrolitern Medium und übertragen Sie die Wäsche auf das 15-Milliliter-Röhrchen, um eine maximale Zellrückgewinnung zu erzielen. Nach dem Zählen der Anzahl der lebensfähigen Zellen wird die Zellsuspension durch Trianblau-Ausschlusspellet aufgeschlüsselt. Zum Schluss schleudern Sie den reservierten Gewebeüberstand herunter.
Übertragen Sie dann den Überstand vorsichtig in mindestens ein sauberes Rohr, ohne das Pellet zu berühren oder zu stören, und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige nachgelagerte Analysen. In diesen Diagrammen sind repräsentative Durchflusszytometrie-Punktdiagramme von dissoziierten Tumorzellhomogenaten dargestellt, gefolgt von der Markierung mit spezifischen Antikörpern gegen Leukozyten und Epithelzellmarker. Dieses Protokoll verändert die Lebensfähigkeit der CD 45-positiven Zellen nicht wesentlich.
Es kommt jedoch zu einem erheblichen Verlust an lebensfähigen EPAM-positiven Zellen. Trotzdem können lebensfähige EPAM-positive und CD 45-positive Untergruppen auf der Grundlage ihrer Größe und Struktur in große epitheliale Tumorzellen, kleine Epithelzellen oder große und kleine CD 45-positive Zellen unterteilt werden. Repräsentative Durchflusszytometrie-Punktdiagramme der wichtigsten tumorinfiltrierenden Untergruppen sind hier dargestellt, wobei die Lymphozyten auf die Lebensfähigkeit der CD 45-positiven Zellen ausgerichtet sind.
Schließlich kann die Zytokinexpression oder die Gesamtimmunglobuline im Brustkrebsüberstand mit dem Überstand aus normalem Brustgewebe verglichen werden, was zeigt, wie in diesem repräsentativen Experiment gezeigt, einen Anstieg beider Arten von Proteinen, die mit dem Tumorgewebe assoziiert sind. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, schnell und sauber zu arbeiten und bei jedem Schritt des Verfahrens die maximale Menge an Material zurückzugewinnen, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für zu erhalten Ihre Endpunktanalyse.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur schnellen nicht-enzymatischen Dissoziation frischer menschlicher Gewebefragmente, die eine qualitative und quantitative Beurteilung von CD45+ Zellen, einschließlich Lymphozyten und Leukozyten, ermöglicht. Die Technik bewahrt den nativen Zustand der Zellen und erleichtert weitere Analysen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Das Verständnis der Immunzellzusammensetzung in menschlichen Geweben ist für verschiedene Forschungsanwendungen entscheidend.
- Traditionelle enzymatische Methoden können den nativen Zustand von Zellen verändern.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine nicht-invasive Alternative für die Gewebedissoziation zu bieten.
- Die Durchflusszytometrie wird zur Analyse spezifischer Lymphozytensubpopulationen eingesetzt.
Zweck der Studie
- Eine schnelle Methode zur Homogenisierung menschlichen Gewebes in eine Einzelzellsuspension zu entwickeln.
- Qualitative und quantitative Analyse von Lymphozytenpopulationen zu ermöglichen.
- Den nativen Zustand von tumorinfiltrierenden Lymphozyten für Bildgebung zu bewahren.
Verwendete Methoden
- Frische menschliche Gewebefragmente werden mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke geschnitten.
- Die Gewebesuspension wird in ein mechanisches Dissoziationsröhrchen für weitere Homogenisierung überführt.
- Zellen werden durch Zentrifugation für die nachgeschaltete Analyse gesammelt.
- Durchflusszytometrie wird zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten und ihrer Subpopulationen eingesetzt.
Hauptergebnisse
- Die Methode generiert erfolgreich eine Einzelzellsuspension aus menschlichen Gewebefragmenten.
- Qualitative und quantitative Beurteilungen von CD45+ Zellen können effektiv durchgeführt werden.
- Die Technik ermöglicht die Erhaltung des nativen Zustands von Lymphozyten.
- Die Durchflusszytometrie-Ergebnisse zeigen die Machbarkeit der Analyse spezifischer Lymphozytensubpopulationen.
Schlussfolgerungen
- Diese nicht-enzymatische Dissoziationsmethode ist effektiv für die Analyse von menschlichen Gewebelymphozyten.
- Das Protokoll kann auf verschiedene normale und maligne Gewebe angewendet werden.
- Zukünftige Studien können diese Technik nutzen, um tiefere Einblicke in die Immunzelldynamik zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Rapid, non-enzymatic dissociation of fresh human tissues enables high-fidelity analysis of tumor-infiltrating lymphocytes, supporting immune-oncology discovery and translational research. This protocol preserves cell surface markers and viability, providing reliable quantitative and qualitative data for target validation and mechanistic de-risking. The approach enhances predictive confidence at the interface of early discovery and translational biomarker development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of immune cell populations within tumor microenvironments.
- Preserves native cell states for accurate phenotypic and functional analysis.
- Supports mechanistic de-risking by maintaining surface receptor expression.
- Facilitates robust target validation through quantitative lymphocyte profiling.
Screening & Assay Development
- Generates high-viability single-cell suspensions suitable for flow cytometry and molecular assays.
- Standardizes sample preparation, improving reproducibility across experiments.
- Provides quantitative outputs for downstream immunological and molecular screening.
- Enables reliable evaluation of immune cell subpopulations for assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by analyzing cells proximate to their in vivo state.
- Supports translational biomarker discovery through comparative analysis of normal and malignant tissues.
- Facilitates continuity from tissue acquisition to preclinical immune profiling.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on immune contexture data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of tissue acquisition, immune profiling, and translational biomarker workflows, supporting early discovery through preclinical research.
- Discovery Biology: Provides high-integrity immune cell suspensions for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell preparations for immunophenotyping and molecular assays.
- Analytics: Enables robust measurement of lymphocyte subpopulations and soluble immune mediators.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by comparing immune profiles across tissue types.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol applicable to diverse tissue sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-oncology research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tissue processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing reliable immune profiling data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and immunological assays.
- Needs access to mechanical dissociation instruments and flow cytometry platforms.
- Demands cross-team standardization for consistent sample processing.
- Adaptable to various tissue types with attention to tissue-specific characteristics.
- Cell yield and viability may vary depending on tissue composition and handling speed.
