Name: Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Lernen Sie eine nicht-enzymatische Methode zur schnellen Dissoziation frischer menschlicher Gewebe für die Analyse infiltrierender Lymphozyten. Dieses Protokoll ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung von CD45+ Zellen mittels Durchflusszytometrie.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt fromthe belgischen Fonds für wissenschaftliche Forschung (FNRS), Les Amis de l&#39;Institut Bordet, FNRS Arbeit Télévie, Plan Krebs Belgien, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson und Fonds Barsy.

HINWEIS: Alle Proben wurden unter Verwendung eines Protokolls von der Medizinischen Ethik-Kommission des Instituts Jules Bordet mit schriftlicher Einwilligung von jedem Patienten erhalten genehmigt erworben. 1. Herstellung des Gewebehomogenats <ol><li> Sezieren resezierten Gewebe (malignen und normalen Gewebe aus dem OP-Saal resezierten) sind in der Pathologie-Labor durch geschultes Personal zur sofortigen Abholung. Tumor, NANT (aufgenommen am weitesten Abstand von der Tumor wie möglich) und Normalgewebefragmente werden routinemäßig auf 1 bearbeitet - 3 h chirurgische Exzision in einem BSL2 Labor unter Verwendung von Standardverfahren der biologischen Sicherheit für menschliche Gewebe. Ein Ablaufdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Wiegen Sie alle Gewebestücke (normal, NANT und Tumor) und messen Sie die Länge, Breite und Höhe (Länge x Breite x Höhe). Dies ist ein wichtiger Schritt für die anschließende Normalisierung des Zellpopulationen, extrahierte RNA usw. NEINTE: Der Bereich der Stichprobengröße ist 100 bis 10.000 mm 3 ohne Fett, wenn möglich. </li><li> Impressum der Tumorfragment auf einem Objektträger für H &amp; E Färbung, um zu überprüfen, dass das Gewebe ist eigentlich ein Teil des Tumors. <ol><li> Tun Sie dies, indem Sie einen Glasobjektträger auf den Tumor-Fragment und mit leichtem Druck mit den Fingern für ein paar Sekunden. </li><li> Befestigen Sie die Folie mit Isopropanol für 2 Minuten, gefolgt von einem Waschschritt in Wasser. Gegenfärbung des Gewebes für 30 Sekunden mit Mayers Hämatoxylin. </li><li> In sechs Bäder Wasser Waschen Sie den Objektträger. Fleck in Phloxin B 2% für 15 Sekunden. </li><li> In einem Bad aus Wasser, gefolgt von vier Bäder Isopropanol und Finish mit einem Bad aus Wasser waschen. </li><li> Inkubiere in Isopropanol für 1 min und Drain. Klar in zwei Bäder Xylol. </li><li> Montieren Sie mit Xylol basiert Eindeckmedium. Untersuchen der Tumorzellzahl (Abbildung 2). HINWEIS: Vor allem, Tumorzellen haften an der aufgedruckten Rutsche - das Stroma, lymphatischen oder Ad-ipose Zellen selten bleiben, so dass Zwischenräume zwischen den Tumorzellen (Abbildung 2). </li></ol></li><li> Mit einer sterilen - Legen Sie die Gewebefragment in einer kleinen Kulturschale mit 1 ml der chemisch definierten, serumfreien hämatopoetischen Zellmedium bei Raumtemperatur in kleine Stücke (2 mm 2 bis 1) (im Folgenden als Medium bezeichnet), und in Würfel schneiden Skalpell. </li><li> Bringen Sie alles, was (Gewebefragmente + Medium) zu einer mechanischen Dissoziator C Rohr. </li><li> Mit 2 ml Medium mit einer Pasteurpipette gründlich die Petrischale und Skalpell und addieren sie zum C Rohr (Volumen des Mediums für die Dissoziation = 3 ml). </li><li> Verwenden Sie die mechanische Dissoziator Programm A.01 für C Rohre (die schonendste Programm), um die Gewebefragmente in eine Einzelzellsuspension zu homogenisieren. Stellen Sie das C-Rohr in der Vorrichtung und zweimal das Programm in Folge (ein Zyklus = 25 sec). HINWEIS: Diese Homogenisierung Verfahren hergestellt wurde und für den menschlichen Brustgewebe, andere tum validiertoder oder Gewebetypen müssen vielleicht ein anderes Programm verwenden und sollten zuerst getestet werden. </li><li> Entfernen Sie das C-Rohr aus dem Gerät und dekantiert die Homogenat direkt in ein 40 um Zellsieb auf einem 50-ml-Tube sitzt. Mit der gleichen Pasteur-Pipette, wie in Schritt 1.6, übertragen jede in der C-Rohr in die Zelle Sieb zurückbleibende Flüssigkeit. </li><li> Übertragen Sie die gefilterte Flüssigkeit in einen 15-ml-Röhrchen mit einem 1 ml Mikropipettenspitze. Vorübergehend halten die Zellsieb und seine 50-ml-Tube. </li><li> Mit weiteren 3 ml Medium spülen C Röhrchen sammeln und diese wieder mit dem gleichen Pasteur-Pipette, wie in Schritt 1.6, auf die Zellsieb noch auf dem 50-ml-Tube sitzt. Drücken Sie eine maximale Menge der Restflüssigkeit in der nicht homogenisierten Gewebe eingeklemmt in die 50-ml-Röhrchen durch leichtes Verschieben der ganzen Sieb mit einem sauberen Pasteurpipette oder 1 ml-Spitze, die dann weggeworfen wird, um zu vermeiden, eine Verunreinigung des Eluats. </li><li> Legen Sie die Zellsieb kopfüber auf ter Original C Rohr und spülen Sie mit 3 ml Medium, so dass die nicht homogenisierten Gewebe fällt zurück in die C-Rohr. </li><li> Re-Homogenisierung, wie in Schritt 1.7 für zwei Zyklen des A.01 Programms. </li><li> Gießen Sie diese zweite Homogenat durch die Zelle Sieb auf dem 50-ml-Tube sitzt, spülen Sie das C-Rohr wieder mit 3 ml Medium (wie in Schritt 1.10) und Transfer mit dem Pasteur-Pipette an die Zelle Sieb auf dem 50-ml-Tube sitzt wieder drückte maximal Flüssigkeitsmenge aus dem Rest Bindegewebes im Zellsieb gefangen. </li><li> Zu diesem Zeitpunkt ist ein Volumen von ~ 2,5 ml in 15 ml-Röhrchen und ~ 9 ml in 50-ml-Röhrchen. </li></ol> 2. Trennung der Gewebeüberstand und Zellen <ol><li> Zentrifugieren Homogenate in 15 ml und 50 ml-Röhrchen für 15 min bei 600 × g bei Raumtemperatur. </li><li> Dekantiert man die SN aus dem 15-ml-Röhrchen in ein sauberes Röhrchen und vorübergehend bei 4 ° C zu lagern. Dieser Überstand = Primärtumor, NANT oder normale tiUSGABE SN (Endvolumen 2,5 ml) wird anschließend geklärt und aliquotiert vor der Lagerung bei -80 ° C für zukünftige Analysen (siehe unten). </li><li> Überstand verwerfen aus dem 50-ml-Tube. </li><li> Vorsichtig resuspendieren beiden Zellpellets in einem Endvolumen von 1 ml Medium. Kurz gesagt, zuerst sanft brechen die Zellpellets in beiden Röhren (durch Tippen auf das Rohr auf eine harte Oberfläche). Resuspendieren Sie das lose Zellpellet in den 50 ml mit 500 ul Medium und übertragen diese Zellsuspension in die 15-ml-Tube, um die zweite Pellet resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit der zweiten 500 ul Medium für maximale Rückgewinnung von Zellen. </li><li> Transfer 10 ul der Zellsuspension in ein kleines Röhrchen, mischen mit 10 ul Trypanblau (Verdünnung 1: 1) und die Anzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers. HINWEIS: An diesem Punkt eine Fraktion der Zellsuspension können auch mittels Durchflusscytometrie analysiert, um die Zellgröße, Granularität zu bewerten und, falls gewünscht eine begrenzte Anzahl von Subpopulation Marker für weitere precise Abschätzung der Zellverteilung in dem Homogenat vor der umfassenden Analyse oder Experimente. Alle Analysen mittels Durchflusszytometrie integrieren CD45 Kennzeichnung für die Normalisierung der Subpopulationen. </li><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Die Zellen aus dem Tumor, NANT oder normales Gewebe sind nun bereit für die weitere Reinigung oder Analyse. Diese zusätzlichen Schritte sind am besten, wenn am selben Tag wie die Chirurgie durchgeführt. HINWEIS: Für Durchflusszytometrieanalyse aber nicht zell Sortieren der Rest Erythrozyten sollten nach der Antikörper-Markierung nach Zugabe von 0,4 ml von roten Blutzellen Lysepuffer zu dem Zellpellet sofort Vortexen für 1 sec und Inkubieren von mindestens 10 min bei Raum lysierenden Temperatur (lichtgeschützt) vor der Analyse. </li></ol> 3. Klärung der Gewebeüberstand <ol><li> Zentrifugieren 1,5-ml-Röhrchen mit Gewebe SN bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig ter Überstand ohne sie zu berühren oder das Pellet aufzurühren. Transfer in ein sauberes Röhrchen (oder Röhren) in Abhängigkeit von der Anzahl und Volumen der Aliquote gewünscht. </li><li> Lagern Sie den Überstand bei -80 ° C für eine spätere Verwendung. </li></ol> 4. Patient Blut <ol><li> Sammeln einer Blutprobe von jedem Patienten als Kontrolle durch Venenpunktion in heparinisierte Röhrchen am Tag vor der Operation. Zentrifugieren des Bluts bei 400 · g für 10 min bei 20 ºC mit der Bremse aus, um das Plasma und Buffy-Coat erhalten. </li><li> Entfernen Sie das Plasma und klären sie durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 min bei 20 ºC. Aliquot und speichern Plasma bei -80 ° C für zukünftige Verwendung. Verdünnen Sie die Buffy-Coat in Medium </li><li> Trenne die mononukleäre Zellen unter Verwendung von Standard-Ficoll-Hypaque-Gradienten-Zentrifugation vor der unmittelbaren Analyse Subpopulation Isolierung, DNA / RNA / Protein-Extraktion oder Kryokonservierung. </li></ol> 5. Durchflusszytometrie <ol><li> Etikett Zellen nach der Herstellungr Angaben bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Lyse der roten Blutzellen in Zellsuspensionen aus Gewebefragmenten nach der Antikörper-Markierung nach Zugabe von 0,4 ml der Zell-Lyse-Puffer zu dem Zellpellet. </li><li> Vortex sofort für 1 Sekunde und Inkubation von mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Führen Sie die markierten Zellen in einem Durchflusszytometer für die Datenerfassung ohne Waschen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Verfahren für die schnelle Herstellung von normalen und malignen Brust Gewebehomogenaten ohne enzymatische Verdauung für nachfolgende Zellsortierung, Extraktion, Kryokonservierung und / oder phänotypische Analyse von CD45 + Subpopulationen. Das Ziel dieser experimentellen Ansatz ist es, Bilder der TIL, die ihre in vivo Zustand genau wieder und vergleichen sie mit normalen Geweben mit minimaler Manipulation der Gewebe frisch aus dem OP-Saal zu produzieren. Bis h...

Die Mikroumgebung des Tumors besteht aus verschiedenen Zelltypen, wobei zahlreiche Studien zeigen, dass sie jeweils unterschiedliche und wichtige Rollen bei der Tumorentstehung spielen1,2. Dazu gehören unter anderem infiltrierende Immunzellen, Stromazellen, Endothelzellen und Tumorzellen3. Ex-vivo-Studien an tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL; CD45+-Zellen oder Leukozyten, bei denen es sich bei Brusttumoren überwiegend um Lymphozyten handelt) aus frischen menschlichen Gewebeproben wird durch ihre geringe Häufigkeit, die oft für die Forschung verfügbaren kleinen Probengrößen und den möglichen Verlust der Lebensfähigkeit während der Extraktion erschwert. Da Immunzellen, die in Tumore eindringen, in der Regel als Passagiere und nicht als ständige Bewohner anwesend sind, lassen sie sich im Allgemeinen leichter aus der Gewebematrix lösen.
Die Dissoziation von Tumorgewebe unter Beibehaltung der zellulären Integrität ist eine technische Herausforderung und wurde traditionell mit einer Kombination aus mechanischen und enzymatischen Schritten durchgeführt, um Einzelzellsuspensionen4-8 herzustellen. Dieser Ansatz ist mit langen Inkubationszeiten verbunden und ist mit einer signifikanten Verringerung der Zellviabilität sowie dem Verlust von Zelloberflächenrezeptoren durch enzymatische Spaltung verbunden. Qualitativ hochwertige durchflusszytometrische Studien zur Charakterisierung von TIL in der Tumormikroumgebung sowie saubere Aufreinigungen von CD45+-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie oder Antikörper-beschichtete Kügelchen sind aus enzymverdautem Tumorgewebe schwieriger zu erreichen. Darüber hinaus ist der Überstand (SN) aus dem resultierenden Tumorhomogenat aufgrund des Potenzials für den Proteinabbau in den enzymatischen Digesten nicht für eine weitere Analyse einschließlich der Quantifizierung von sezernierten Proteinen (Zytokine, Chemokine, Immunglobuline oder Tumorantigene) oder eine experimentelle Behandlung normaler Zellen zugänglich.
Auf unserer Suche nach einer Methode zur Herstellung von einzelligen Homogenaten aus Brustgewebe [einschließlich Tumorgewebe, nicht-benachbartem Nicht-Tumor (NANT) und normalem (aus Brustverkleinerungen) Brustgewebe] ohne enzymatischen Verdau, haben wir eine Vielzahl von mechanischen Homogenisierungstechniken getestet. Homogenate, die mit einem mechanischen Dissoziator hergestellt wurden, erhöhten die Zellviabilität (2-fach) und die Gesamtzellrückgewinnung (2-fach) bei gleichzeitiger Beibehaltung der Oberflächenrezeptorexpression. Der enzymatische Verdau des verbleibenden unlöslichen Materials führte nicht zu weiteren CD45+-Zellen, was darauf hindeutet, dass sie alle im ursprünglichen Homogenat freigesetzt wurden. Dieser schnelle und einfache Ansatz ermöglicht somit sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Bewertung der CD45+-Subpopulationen, die in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben vorkommen. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass das SN aus dem ursprünglichen Homogenat (primäres Gewebe-SN) gesammelt und für weitere Analysen oder Experimente gelagert werden kann.

<table><tbody><tr><td>GentleMacs Dissoziator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>BD Medimachine ist etwas gleichwertig</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>oder andere Standard Tischzentrifuge</td></tr><tr><td>Zentrifuge Zentrifuge 5417 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>oder andere Standard Mikrozentrifuge</td></tr><tr><td>Esco Klasse II A2 Biosicherheitswerkbank</td><td>ESCO Global</td><td></td><td>oder andere Standard BSL2 Haube</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon eclipse TS100</td><td></td><td>oder ein anderes Mikroskop, das für ein Hämazytometer</td></tr><tr><td>kompatibel ist; rker Kammer</td><td>Marienfield&nbsp;</td><td>640210</td><td>oder anderes Standard-Hämazytometer</td></tr><tr><td>Navios Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>oder anderes Durchflusszytometer (8-10 Farben empfohlen)</td></tr><tr><td>GentleMacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-344</td><td>BD Medimachine verwendet Filcon</td></tr><tr><td>Zellkulturschale</td><td>Sarstedt</td><td>72,710</td><td>oder andere nicht-pyrogene Kunststoffartikel</td></tr><tr><td>Einweg-Skalpell</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td>oder steriles Einweg-Skalpell</td></tr><tr><td>BD Cell Strainer 40 & micro; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>734-0002</td><td>oder andere nichtpyrogene Kunststoffe</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 15 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352097</td><td>oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren</td></tr><tr><td>BD FACS Tube 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352008</td><td>oder andere nichtpyrogene Kunststoffwaren</td></tr><tr><td>Sterile Pasteur Pipette 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td>oder andere pyrogene Kunststoffe</td></tr><tr><td>Mikrofuge Röhrchen 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>7805-00</td><td>oder andere nicht-pyrogene Kunststoffe</td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td>serumfreies Medium empfohlen</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>Standard physiologisches PBS</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>VWR</td><td>17942E</td><td>oder ein anderer lebenswichtiger Fleck</td></tr><tr><td>VersaLyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A09777</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>anti-CD3 Vio Blue</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-363</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>345769</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>anti-CD4 APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-232</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>anti-CD8 ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>737659</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>anti-CD8 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>345774</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>anti-CD19 APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-643</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr><tr><td>Anti-CD45 VioGreen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-906</td><td>für Durchflusszytometrie-Experimente</td></tr></tbody></table>

eine einfache und schnelle protokoll zum nicht enzymatisch dissociate frische menschlichen geweben zur analyse der infiltrierenden lymphozyten

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Die Fähigkeit von Tumorzellen, das Immunsystem, gekennzeichnet durch Tumorflucht sowohl angeborenen und erworbenen Immunreaktionen entziehen wird nun als ein wichtiges Merkmal von Krebs angenommen. Unsere Forschung zu Brustkrebs konzentriert sich auf die aktive Rolle, die Tumor-infiltrierenden Lymphozyten in der Tumorprogression und der Behandlungserfolg spielen. Auf dieses Ziel, eine Methodik für die schnelle Isolierung von intakten lymphatischen Zellen von normalen und abnormalen Geweben haben wir in dem Bemühen, zu bewerten nahe ihrem nativen Zustand. Homogenate mit einem mechanischen Dissoziator zeigen sowohl erhöhte Lebensfähigkeit und Zellgewinnung unter Beibehaltung Oberflächenrezeptorexpression im Vergleich zum Enzym verdaute Gewebe vorbereitet. Außerdem hatte enzymatische Verdauung der verbleibenden unlöslichen Materials zusätzliche CD45 + Zellen anzeigt, dass qualitative und quantitative Messungen im Primär Homogenat wahrscheinlich wirklich infiltrieren Subpopulationen im Gewebe fragm reflektieren nicht wiederherstellenEintr. Die lymphoiden Zellen in diesen Homogenaten man einfach mit immunologischen (Phänotyp, Proliferation usw.) oder Molekular (DNA, RNA und / oder Protein), gekennzeichnet nähert. CD45 + Zellen können auch für die Reinigung Subpopulation, in vitro Expansion oder Kryokonservierung verwendet werden. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die Primärgewebe Stand aus den Homogenaten kann verwendet werden, um in normalen und malignen Geweben zu charakterisieren und zu vergleichen, Cytokine, Chemokine, Immunglobuline und Antigenen werden. Diese Protokoll-Funktionen sehr gut für den menschlichen Brustgewebe und sollte für eine breite Vielzahl von normalen und abnormalen Geweben.

Enzymatische Verdauung von Gewebefragmenten entweder im Handel erhältlich Gewebedissoziation Lösungen oder verschiedene Labor Mischungen Kollagenase, DNase und / oder Hyaluronidase-Inhibitoren sind, schneiden eine Vielzahl von Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen. Unsere Studien, zunächst auf CD4 + T-Zellen infiltrieren Brusttumoren fokussiert wurden schnell mit einem großen technischen Problem wegen Spaltung Oberfläche CD4-Rezeptoren unter Verwendung von Standardprotokollen enzymatische Verdauung 4-...

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle nicht-enzymatische Dissoziation von frischen menschlichen Gewebefragmenten zur qualitativen und quantitativen Beurteilung von CD45+ Zellen (Lymphozyten/Leukozyten), die in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben vorhanden sind. Zusätzlich kann der aus dem primären Gewebehomogenat gewonnene Überstand gesammelt und für weitere Analysen oder Experimente gelagert werden.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, menschliche Gewebefragmente schnell in eine Einzelzell-Suspension zu homogenisieren, ohne enzymatische Verdauung, um qualitative und quantitative Analysen sowie die Isolierung spezifischer Lymphozyten-Subpopulationen durchzuführen. Dies wird zunächst erreicht, indem die Gewebefragmente mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke zerkleinert werden. Anschließend wird das Gewebepulpe in ein mechanisches Dissoziationssystem überführt, in dem die Fragmente weiter zu einer Einzelzell-Suspension homogenisiert werden.Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation für die nachgeschaltete Analyse gesammelt. Letztendlich kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die infiltrierenden Lymphozyten sowie Unterpopulationen von Asiaten zu analysieren. Mein Labor hat diese Technik entwickelt, weil wir nach einer Methode suchten, mit der wir tumorinfiltrierende Lymphozyten abbilden konnten, ohne ihren nativen Zustand erheblich zu verändern.Wir wollten eine Methode, mit der wir die Zellen schnell isolieren und analysieren konnten, wie sie direkt während der Operation vorlagen. Diese Technik wurde in unserem Labor bereits an mehr als 300 Brusttumoren und normalem Gewebe angewandt, ist einfach zu handhaben und kann routinemäßig täglich eingesetzt werden. Sie kann verwendet werden, um prognostische Marker, die Therapieantwort sowie langfristige klinische Ergebnisse zu untersuchen.Heute wird diese Technik John Nicola Loic demonstrieren, ein Techniker in meinem Labor. Wiegen Sie zunächst die Gewebeprobe und messen Sie anschließend Länge, Breite und Höhe des Gewebes. Überführen Sie dann das Gewebefragment in eine kleine Petrischale, die ein Milliliter des geeigneten, chemisch definierten, serumfreien hämatopoetischen Zellmediums enthält, und zerkleinern Sie die Probe mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke von ein bis zwei Quadratmillimetern.Überführen Sie anschließend den Inhalt der Schale in ein mechanisches Dissoziationsröhrchen (C-Tube) und spülen Sie die Schale und das Skalpell mit zwei Milliliter Medium aus. Geben Sie die Abwaschung zum C-Tube hinzu und führen Sie danach zweimal nacheinander das mechanische Dissoziationsprogramm 0,01 durch, um die Gewebefragmente vorsichtig in eine Einzelzell-Suspension zu homogenisieren. Nach dem zweiten Durchlauf gießen Sie das Homogenat durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konischrohr ab. Verwenden Sie dann denselben Kolben Ihrer Pipette, mit dem Sie die Petrischale gespült haben, um die im C-Röhrchen verbliebene Flüssigkeit in den Zellfilter zu überführen. Anschließend überführen Sie mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette die filtrierte Flüssigkeit in ein 15-Milliliter-Konischglas und spülen das C-Röhrchen mit zusätzlichen drei Millilitern Medium. Leiten Sie diese Spülflüssigkeit durch den Zellfilter in das 50-Milliliter-Gefäß.Bewegen Sie dann das nicht homogenisierte Gewebe vorsichtig mit einer sauberen Ein-Milliliter-Spitze auf dem Sieb, um die maximale Menge an restlichem, im Gewebe eingeschlossenem Flüssigkeit in das 50-Milliliter-Röhrchen zu pressen. Stellen Sie nun den Zellsieb umgedreht auf das ursprüngliche C-Röhrchen und spülen Sie den Sieb mit drei weiteren Millilitern Medium, sodass das nicht homogenisierte Gewebe zurück in das C-Röhrchen fällt. Homogenisieren Sie das Gewebe erneut für zwei weitere Zyklen, wie gerade gezeigt, und gießen Sie danach dieses zweite Homogenat durch den Zellsieb.Spülen Sie das C-Röhrchen erneut mit weiteren drei Millilitern Medium. Filtern Sie anschließend das Überstand durch das Sieb und pressen Sie die restliche Flüssigkeit aus dem Gewebe, wie zuvor gezeigt. Zu diesem Zeitpunkt sollte im 15-Milliliter-Röhrchen ein Volumen von etwa 2,5 Millilitern Einzelzell-Suspension vorliegen und im 50-Milliliter-Röhrchen sollten etwa neun Milliliter beobachtet werden.Um das Gewebesupernatant von den Zellen zu trennen, zentrifugieren Sie zunächst beide Homogenattuben 15 Minuten bei 600 Gs und Raumtemperatur, dekantieren Sie das Supernatant aus der 15-Milliliter-Tube in eine 1,5-Milliliter-Tube, stellen Sie diese bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie das Supernatant aus der 50-Milliliter-Tube. Schlagen Sie dann vorsichtig jede Tube auf eine harte Oberfläche, um die Zellpellets aufzulösen. Resuspendieren Sie das lose Zellpellet in der 50-Milliliter-Tube mit 500 Mikrolitern Medium und überführen Sie die Zellen in die 15-Milliliter-Tube, um das zweite Pellet zu resuspendieren.Anschließend spülen Sie den 50-Milliliter-Probengefäß mit weiteren 500 Mikrolitern Medium und überführen die Abwaschung in das 15-Milliliter-Probengefäß, um eine maximale Zellausbeute zu erzielen. Nach der Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss zentrifugieren Sie die Zellsuspension. Zentrifugieren Sie abschließend das aufbewahrte Gewebesupernatant.Überführen Sie anschließend vorsichtig das Überstandmedium in mindestens ein sauberes Reaktionsgefäß, ohne den Pellet zu berühren oder aufzulösen, und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für spätere downstream-Analysen. In diesen Diagrammen sind repräsentative Dotplots der Strömungszytometrie von dissoziierten Tumorzellhomogenaten dargestellt, die nachfolgend mit spezifischen Antikörpern gegen Leukozyten- und epitheliale Zellmarker markiert wurden, wie gezeigt. Dieses Protokoll verändert die Vitalität der CD 45-positiven Zellen nicht signifikant.Allerdings kommt es zu einem erheblichen Verlust an lebensfähigen EPAM-positiven Zellen. Dennoch können lebensfähige EPAM-positive und CD45-positive Teilpopulationen basierend auf ihrer Größe und Struktur in große epitheliale Tumorzellen, kleine epitheliale Zellen oder große und kleine CD45-positive Zellen unterteilt werden. Hier sind repräsentative Dotplots der Durchflusszytometrie der wichtigsten tumorinfiltrierenden Teilpopulationen dargestellt, wobei die Lymphozyten anhand der Lebensfähigkeit der CD45-positiven Zellen ausgewählt wurden.Schließlich kann die Expression von Zytokinen oder die Menge an Gesamtimmunglobulinen im Überstand von Brustkrebsgewebe mit dem Überstand von normalem Brustgewebe verglichen werden, wobei – wie in diesem repräsentativen Experiment gezeigt – Zunahmen beider Proteintypen im Zusammenhang mit dem Tumorgewebe nachgewiesen werden können. Obwohl das Verfahren einfach ist, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, schnell und sauber zu arbeiten und bei jedem Arbeitsschritt die maximale Menge an Material zu gewinnen, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für die abschließende Analyse zu erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt die nicht-enzymatische Dissoziation von frischem menschlichem Gewebe, um lebensfähige Zellen zu erhalten. Die Technik wird für die qualitative und quantitative Analyse von CD45-positiven Zellen (Lymphozyten/Leukozyten) verwendet, die in verschiedenen normalen und bösartigen menschlichen Geweben vorhanden sind.

Mechanische Dissoziation: Eine Methode, um lebensfähige Zellen aus einem Gewebe zu gewinnen

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

Die Isolierung von Lymphknotenstromazellen ist ein mehrstufiges Verfahren, das enzymatische Verdauung und mechanische Disaggregation umfasst, um fibroblastische retikuläre Zellen, lymphatische und Blutendothelzellen zu erhalten. Bei dem beschriebenen Verfahren wird ein kurzer Verdau mit einer automatisierten mechanischen Disaggregation kombiniert, um den Oberflächenmarkerabbau lebensfähiger Lymphknotenstromazellen zu minimieren.

Isolierung von murinen Lymphknoten Stromazellen

Wir beschreiben ein Protokoll zur effizienten Isolierung von hautresidenten T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien. Dieses Protokoll liefert eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Lymphozyten in der menschlichen Haut für die durchflusszytometrische Analyse und die Ex-vivo-Kultur.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Das Ziel des Protokolls ist es, lymphatische Endothelzellen menschlicher Lymphmissbildung zystenartige Gefäße und Vorhaut mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Anschließende Zellkultur und Expansion dieser Zellen ermöglicht eine neue Stufe der experimentellen Raffinesse für genetische, Proteomik, funktionale und Zelldifferenzierung Studien.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Dieses Protokoll beschreibt die enzymatische Verdauung von Maushaut in nährstoffreichem Medium, gefolgt von einer Gradiententrennung, um Leukozyten zu isolieren.  Die so abgeleiteten Zellen können für vielfältige nachgelagerte Anwendungen eingesetzt werden. Dies ist eine effektive, wirtschaftliche und verbesserte Alternative zu Gewebedissoziationsmaschinen und härteren Trypsin- und Dispase-basierten Gewebeverdauungsprotokollen.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Experimentelle Verfahren für die spätere Gewinnung von lymphatischen Gewebe, lymphatischen Dendritische Zelle Aktivierung testen werden nach der Behandlung eine immunstimulierende Nanomaterials beschrieben.

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

In diesem Protokoll werden Lymphozyten in die obere Kammer eines Transmigrationssystems gelegt, die durch eine poröse Membran von der unteren Kammer getrennt sind. Chemokin wird der unteren Kammer hinzugefügt, was eine aktive Migration entlang eines Chemokingradienten induziert. Nach 48 h werden Lymphozyten in beiden Kammern gezählt, um die Transmigration zu quantitieren.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Dies ist eine Methode, um uteruslymphoide Zellen sowohl von schwangeren als auch von nicht schwangeren Mäusen zu isolieren. Diese Methode kann für mehrere nachgelagerte Anwendungen wie FACS-Phänotypisierung, Zellsortierung, funktionelle Assays, RNA-seq und Proteomik verwendet werden. Das Protokoll hier zeigt, wie man angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 1 durch Durchflusszytometrie phänotypisiert.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

Lernen Sie eine nicht-enzymatische Methode zur schnellen Dissoziation frischer menschlicher Gewebe für die Analyse infiltrierender Lymphozyten. Dieses Protokoll ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung von CD45+ Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten (Video) | JoVE Journal

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

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