Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, menschliche Gewebefragmente schnell und ohne enzymatischen Verdau in eine Einzelzellsuspension zu homogenisieren, um die qualitative und quantitative Analyse und die Isolierung spezifischer Lymphozyten-Subpopulationen zu ermöglichen. Dazu werden die Gewebefragmente zunächst mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke zerlegt. Als nächstes wird die Gewebeaufschlämmung in ein mechanisch dissoziiertes Röhrchen überführt, wo die Fragmente weiter zu einer Einzelzellsuspension homogenisiert werden.

Die Zellen werden dann durch Zentrifugation für die nachgelagerte Analyse gesammelt. Letztendlich kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die infiltrierenden Lymphozyten, Subpopulationen Asiaten, zu analysieren. Mein Labor hat diese Technik entwickelt, weil wir nach einer Möglichkeit gesucht haben, tumorinfiltrierende Lymphozyten abzubilden, ohne ihren nativen Zustand dramatisch zu beeinflussen.

Wir wollten etwas, mit dem wir die Zellen schnell isolieren und so analysieren können, wie sie bei der Operation waren. Diese Technik wurde in unserem Labor bei mehr als 300 Brusttumoren und normalem Gewebe angewendet, ist einfach anzuwenden und kann täglich angewendet werden. Es kann verwendet werden, um prognostische Marker, das Ansprechen auf die Behandlung und das klinische Langzeitergebnis zu untersuchen.

Diese Technik wird heute John Nicola Loic vorführen. Ein Techniker in meinem Labor Beginnen Sie mit dem Wiegen der Gewebeprobe und messen Sie dann die Länge, Breite und Höhe des Gewebes. Dann geben Sie das Gewebefragment in eine kleine Petrischale, die einen Milliliter des entsprechenden, chemisch definierten serumfreien hämatopoetischen Zellmediums enthält, und zerkleinern Sie die Proben mit einem sterilen Skalpell in kleine ein bis zwei Quadratmillimeter große Stücke.

Übertragen Sie anschließend den Schaleninhalt in ein mechanisches Dissoziationsröhrchen C und spülen Sie die Schale und das Skalpell mit zwei Millilitern Medium aus. Geben Sie die Wäsche in das C-Röhrchen und führen Sie dann das mechanische Dissoziationsprogramm a 0,01 zweimal hintereinander durch, um die Gewebefragmente sanft in eine Einzelzellsuspension zu homogenisieren. Nach dem zweiten Zyklus wird das Homogenat durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen umgefüllt.

Verwenden Sie dann denselben Schädling wie Ihre Pipette vom Waschen der Petrischale, um die im C-Rohr verbleibende Flüssigkeit in das Zellsieb zu überführen. Verwenden Sie anschließend eine Ein-Milliliter-Mikropipette, um die gefilterte Flüssigkeit in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen, und spülen Sie das C-Röhrchen mit weiteren drei Millilitern Medium aus. Übertragen Sie diese Wäsche durch das Zellsieb in das 50-Milliliter-Röhrchen.

Bewegen Sie dann das nicht homogenisierte Gewebe vorsichtig mit einer sauberen Ein-Milliliter-Spitze um das Sieb herum, um die maximale Menge an im Gewebe eingeschlossener Restflüssigkeit in das 50-Milliliter-Röhrchen zu drücken. Stellen Sie nun das Zellsieb kopfüber auf das ursprüngliche C-Rohr und spülen Sie das Sieb mit drei weiteren Millilitern Medium aus, so dass das nicht homogenisierte Gewebe wieder in das C-Rohr tropft. Homogenisieren Sie das Gewebe für zwei weitere Zyklen, wie gerade gezeigt, und gießen Sie dann dieses zweite Homogenat durch das Zellsieb.

Spülen Sie das C-Rohr erneut mit weiteren drei Millilitern Medium. Filtrieren Sie dann den Überstand durch das Sieb und drücken Sie die Restflüssigkeit wie eben gezeigt aus dem Gewebe. Zu diesem Zeitpunkt sollte ein Volumen von etwa 2,5 Millilitern Einzelzellsuspension in dem 15-Milliliter-Röhrchen vorhanden sein, und ungefähr neun Milliliter sollten in dem 50-Milliliter-Röhrchen beobachtet werden.

Um den Gewebeüberstand von der ersten Zentrifuge der Zellen zu trennen, werden beide Röhrchen 15 Minuten lang bei 600 g und Raumtemperatur homogenisiert, der Überstand aus dem 15-Milliliter-Röhrchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt, bei vier Grad Celsius platziert und der Überstand aus dem 50-Milliliter-Röhrchen verworfen. Klopfen Sie dann vorsichtig auf jedes Röhrchen auf eine harte Oberfläche, um jedes der Zellpellets aufzubrechen. Resuspendieren Sie das lose Zellpellet in der 50-Milliliter-Tube mit 500 Mikrolitern Medium und übertragen Sie die Zellen in die 15-Milliliter-Tube, um das zweite Pellet zu resuspendieren.

Spülen Sie dann das 50-Milliliter-Röhrchen mit weiteren 500 Mikrolitern Medium und übertragen Sie die Wäsche auf das 15-Milliliter-Röhrchen, um eine maximale Zellrückgewinnung zu erzielen. Nach dem Zählen der Anzahl der lebensfähigen Zellen wird die Zellsuspension durch Trianblau-Ausschlusspellet aufgeschlüsselt. Zum Schluss schleudern Sie den reservierten Gewebeüberstand herunter.

Übertragen Sie dann den Überstand vorsichtig in mindestens ein sauberes Rohr, ohne das Pellet zu berühren oder zu stören, und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige nachgelagerte Analysen. In diesen Diagrammen sind repräsentative Durchflusszytometrie-Punktdiagramme von dissoziierten Tumorzellhomogenaten dargestellt, gefolgt von der Markierung mit spezifischen Antikörpern gegen Leukozyten und Epithelzellmarker. Dieses Protokoll verändert die Lebensfähigkeit der CD 45-positiven Zellen nicht wesentlich.

Es kommt jedoch zu einem erheblichen Verlust an lebensfähigen EPAM-positiven Zellen. Trotzdem können lebensfähige EPAM-positive und CD 45-positive Untergruppen auf der Grundlage ihrer Größe und Struktur in große epitheliale Tumorzellen, kleine Epithelzellen oder große und kleine CD 45-positive Zellen unterteilt werden. Repräsentative Durchflusszytometrie-Punktdiagramme der wichtigsten tumorinfiltrierenden Untergruppen sind hier dargestellt, wobei die Lymphozyten auf die Lebensfähigkeit der CD 45-positiven Zellen ausgerichtet sind.

Schließlich kann die Zytokinexpression oder die Gesamtimmunglobuline im Brustkrebsüberstand mit dem Überstand aus normalem Brustgewebe verglichen werden, was zeigt, wie in diesem repräsentativen Experiment gezeigt, einen Anstieg beider Arten von Proteinen, die mit dem Tumorgewebe assoziiert sind. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, schnell und sauber zu arbeiten und bei jedem Schritt des Verfahrens die maximale Menge an Material zurückzugewinnen, um eine ausreichende Anzahl von Zellen für zu erhalten Ihre Endpunktanalyse.