Name: Sedimentationsgleichgewicht eines Klein Oligomer bildenden Membrane Protein: Wirkung von Histidin Protonierung auf pentamere Stabilität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Erfahren Sie, wie Sedimentationsgleichgewicht zur Untersuchung von Protein-Oligomeren verwendet wird. Diese Methode zeigt den Einfluss von pH-Wert auf die Stabilität pentamerer Membranproteine aus hRSV.

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Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss der National Research Foundation NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) und den Tier 1 Zuschuss RG 51/13 finanziert.

Dieses Protokoll wird auf die folgenden Ressourcen, die für weitere Informationen und spezielle Überlegungen 3, 25 bis 28 bezeichnet sind, beruht. 1 Dichteanpassung der Detergensmicellen mit 2 H 2 O Anmerkung: Die Dichte der Pufferlösung muss auf die Dichte der Detergensmicellen angepaßt werden. Gemeinsame Dichte einstellende Mittel schließen 2 H 2 O, H 2 18 O, 2 H 2 18 O, Glycerin und Saccharose 29. H 2 18 O hat die gleiche Dichte wie 2 H 2 O, und kann eine bessere Wahl sein, wenn Deuterierung von austauschbaren Protonen im Protein nicht erwünscht ist. In diesem Verfahren wird die Dichte von 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) Waschmittel in 50 mM Tris pH 7,3, 100 mM NaCl mit 2 H 2 O. abgestimmt werden Als Startwert die folgenden Konzentrationen von2 H 2 O verwendet werden: 10, 30 und 50% v / v. 1.1. Probenvorbereitung <ol><li> Die folgenden Stammlösungen und Filter durch einen 0,2 um Spritzenfilter sterilisieren: 50 ml 500 mM Tris pH 7,3 und 1 M NaCl (10X-Pufferlösung); 1 ml 250 mM C14SB (50X Reinigungslösung). </li><li> Bereiten 200 ul Probenlösung durch Mischen von 20 ul 10x-Puffer-Lösung, 4 ul 50X Waschmittellösung, 20 ul 2 H 2 O (99,9%), und 156 &amp; mgr; l deionisiertes H 2 O. Planen auch 200 ul Referenzlösung durch Mischen von 20 ul 10x-Puffer-Lösung, 20 &amp; mgr; 2 H 2 O (99,9%), und 160 &amp; mgr; l deionisiertes H 2 O. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.1.2 für die anderen 2 H 2 O-Konzentrationen, das heißt 30% bis 50%, Einstellen der 2 H 2 O und H 2 O beträgt entsprechend. </li></ol> 1.2. Versammlung der 6-Kanal-AUC-Zellen und Probenbeladung in die Zellen. Hinweis: Es gibt zwei Arten von AUC Zelle in Abhängigkeit von der Probenladeverfahren. Zellen ohne äußere Füllung hat vor dem Abdichten der Zelle geladen werden, während externe Befüllung Zellen geladen, nachdem die Zellen zu verschließen. Montage eines externen füllen AUC Zelle zuvor 3 beschrieben. In diesem Protokoll wird die Anordnung einer 6-Kanal-AUC Zelle ohne externe Füllung beschrieben. Der Hauptunterschied ist, dass es Schraubenringe auf beiden Seiten die getrennt angezogen werden müssen, und es braucht nicht Gehäusestecker (Fig. 1). Der Unterschied in der Montageschritte sind unten hervorgehoben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Abbildung 1: Explosionszeichnung eines 6-Kanal-AUC Zelle ohne äußere Füllung. Diese Zahl hat sich von Beckman Coulter An-50 Ti modifiziert und An-60 Ti Analytical Rotor, Zellen und Front Bedienungsanleitung. <ol><li> Bereiten Sie zwei Glasscheiben für jeden AUC Zelle mit Saphirfenster anstelle von Quarzfenster (Abb. 2). Legen Sie die Fensterdichtung in das Fenster Halter. Biegen Sie das Fenster Liner und legen Sie sie in das Fenster Halter, so dass der Zwischenraum gegenüber dem Fenster Halter Nut gebildet. Stellen Sie das Saphirfenster in das Fenster Liner, die Ausrichtung der Marke mit dem Fensterhalter Nut. Hinweis:. Das Quarzfenster komprimierbar und damit mehr Lichtbrechung bei hoher Geschwindigkeit 28, 30 daher für Interferenzmessungen über 30.000 Umdrehungen pro Minute, wie in dieser Dichte passenden Experiment zu erzeugen, werden Saphirfenstern verwendet. Ein Saphirfenster ist schwerer als Quarzfenster und hat eine &quot;X&quot; auf die Seite geätzt sind. </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Abbildung 2. Explosions of der Fensteranordnung. Diese Zahl hat sich von Beckman Coulter An-50 Ti und An-60 Ti Analytische Rotor, Zellen und Front Bedienungsanleitung geändert worden <ol><li> Setzen Sie den Zellengehäuse mit der Teilenummer auf den Kopf. Mit den Keilnuten mit dem Gehäuse Schlüssel ausgerichtet ist, schieben Sie in die Zelle Gehäuse zunächst ein 6-Sektor Herz mit abgeschrägten Seite nach unten, gefolgt von einer Fensteranordnung mit dem Fenster nach unten (Abb. 1, links). </li><li> Bestreichen Sie die Schraube Ring Gewinde und Schraubenringscheibe mit Spinkote. Legen Sie eine Schraube Ringscheibe auf der Fensteranordnung. Die Schraube Ring in das Fenster Gehäuse mit dem Wort &quot;OUT&quot; nach außen zeigt. Hand ziehen Sie die Schraube Ring mit der Zell Ausrichthilfe. </li><li> Mit dem Drehmomentschlüssel die Schraube Ring nur 60 inch-pounds. </li><li> Legen Sie die Zelle mit der Teilenummer aufrecht und bei 12-Uhr positioniert. Load 120 ul Bezugnahme in den linken Reihen und 110 ul-Probe in die richtigen Zeilen. Stellen Sie sicher, dass jede Probe und Referenz korrekt gepaart. Hinweis: Genaue Probenvolumen ist nicht kritisch, aber die Bezugs muss etwas mehr Volumen als die Probe (5-10 ul) haben, so dass die Probenmeniskus unterscheidbar sein. </li><li> Schieben Sie vorsichtig in das Zellengehäuse eine Fensteranordnung mit dem Fenster nach unten (Abb. 1, rechts). Darauf achten, dass die Zelle übermäßig zu stören und den Inhalt zu verschütten. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2. 3 und 1.2. 4 Festziehen der zweiten Schraubring zu 120 Zoll-Pfund. Kehren Sie die Zelle und ziehen Sie die erste Schraubring zu 120 Zoll-Pfund. </li><li> Laden Sie die Zellen in den Rotor, installieren Sie den Rotor in der Zentrifuge und installieren Sie den Monochromator nach den Anweisungen des Herstellers 28. Hinweis: Details zu diesem step können auch in dieser Referenz 3 gefunden werden. </li></ol> 1.3. Einrichten Interferenzmessung <ol><li> Starten Sie die Benutzerschnittstellensoftware für die AUC Instrument und führen Laseraufbau und radiale Kalibrierung für jede Zelle bei 3000 rpm, entsprechend den Anweisungen des Herstellers, die im folgenden kurz Schritt zusammengefasst werden. </li><li> 1.3.1.1 Nach ausreichender Unterdruck erreicht ist (&lt;100 Mikrometer), starten Sie die Zentrifuge bei 3000 Umdrehungen pro Minute. Vorschau des Interferenzmusters in der Benutzerschnittstellen-Software und stellen Sie die Laserparameter, um den höchsten Kontrast zu erhalten. </li><li> Erstellen Sie eine neue Datei einrichten (Datei | Neue Datei) die Angabe &quot;Equilibrium&quot; und &quot;Interference&quot; Messung. Richten Sie eine Sedimentationsgleichgewichtsmethode (&quot;Methode&quot; Taste), um bei 45.000 Umdrehungen pro Minute oder die höchste Geschwindigkeit für Proteinproben zu erwarten, je nachdem, was höher ist bei 20 ° C ausgeführt wird, mit Lauftemperatur und sammeln ein Scan alle 15 Minuten. Monitor Gleichgewicht Fortschritt durch Öffnen der Dateien in HeteroAnalysis und Auswählen von Funktionen &quot;Spiel&quot; nach mindestens 12 Stunden (etwa über Nacht, Abb. 3). Hinweis: eine ähnliche Funktion ist auch in SEDFIT (Optionen | Loading Optionen | Test Annäherung an das Gleichgewicht). </li></ol><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ergebnis aus HeteroAnalysis Spiel-Funktion. Die Spiel-Funktion kann verwendet werden, um das Gleichgewicht Fortschritte durch einen Vergleich RMSD zwischen aufeinander folgenden Scans und der letzten Untersuchung zu überwachen. Dieses Beispiel zeigt, nach Gleichgewichtseinstellung nach 8 h hat RMSDs asymptotisch zur X-Achse angegeben. 1.4. Datenanalyse <ol><li> Für jeden Satz von Proben, plotten die Steigung der radialen Verteilungsprofil gegen den 2 H 2 O-Konzentration. Hinweis: Die Verteilung wird eine sehr flache exponentielle dass ap seinAnsätze Linearität. X-Achsen-Abschnitt entspricht der pass 2 H 2 O-Konzentration. </li><li> Verfeinern, führen das Experiment in mehreren Wiederholungen. Oder wiederholen Sie den Versuch mit einem engeren Bereich von 2 H 2 O-Konzentration. </li></ol> 2. Sedimentationsgleichgewicht von SH in C14SB Mizellen 2.1. Führen Parameter <ol><li> Berechnen Puffer Dichte und Viskosität, Protein partielle spezifische Volumen und die Zentrifugiergeschwindigkeit mithilfe SEDNTERP. Um Puffer Dichte und Viskosität, wählen Sie Berechnen im Abschnitt &quot;Pufferdaten Wählen Sie&quot; berechnen und geben Sie die Pufferkomponenten entsprechend, einschließlich der D 2 O-Konzentration. </li><li> 2.1.1.1 Um im Abschnitt &quot;V-bar&quot; berechnen Protein teilweisen spezifischen Volumen, wählen Compute und geben Sie die Protein-Aminosäuresequenz. Geben Sie die höchste erwartete oligomere Größe in &quot;Make ein Oligomer von diesem Monomer: N =&quot;Feld, in diesem Fall N = 5. Berechnen Sie die Geschwindigkeit, indem Sie Werte in der RPM-Feld im Hauptfenster, bis σ ≈ 1; dies ist eine Faustregel, um eine gute exponentielle Form der radialen Verteilungsprofil 25 zu gewährleisten. Anmerkung: Die für dieses Experiment berechneten Werte waren wie folgt: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g, ω 1 = 16000 rpm. </li><li> Berechnen nachfolgenden Geschwindigkeiten zu folgen, um eine ausreichende Differenz zwischen dem Verteilungsprofil mit einer Geschwindigkeit und die nächsten 25 zu gewährleisten. Hinweis: Diese kann auch von der Funktion durchgeführt werden &quot;schätzen Gleichgewicht Rotor beschleunigt Funktion&quot; in SEDFIT, die berücksichtigt die Lösung Säule (Füllvolumen). </li></ol> 2.2. Probenvorbereitung <ol><li> Bereiten Sie 1 ml Referenzlösung mit 5 mM C14SB und 32,3% 2 H 2 O ab Dichte passenden Experiment (Abschnitt 1), durch Mischen von 100 ul 10x-Puffer solutio bestimmtn (Schritt 1.1.1), 20 ul 50X Reinigungslösung (Schritt 1.1.1), 323 ul 2 H 2 O (99,9%) und 527 &amp; mgr; l deionisiertes H 2 O. </li><li> Löse lyophilisiert, HPLC-gereinigt SH Peptide (Expression und Reinigung vorher 31 beschrieben) in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol oder 50% v / v wässrigem Acetonitril. Messen A280 der gelösten Peptide in einer Mikroliter-Maßstab UV / Vis-Spektrophotometer und Aliquot für drei Proben zu A 280 zu geben, 12mm = 0,3, 0,5 und 0,8 (A 280, 10 mm = 0,25, 0,417 und 0,67), die jeweils, wenn sie verdünnt 130 ul. Lyophilisieren die Proben über Nacht und resuspendieren in 130 ul Standardlösung (Schritt 2.2.1), um die Musterlösungen zu geben. Anmerkung: SH-Protein kann von UV / Vis-Absorption bei 280 nm nachgewiesen, weil sie Trp und Tyr-Reste enthalten sein. Proteine ​​ohne aromatischen Reste können durch Markieren mit einem geeigneten Chromophor mit einem Trp enthaltenden Mutante oder durch Verwendung stören erkannt werdennce Messungen anstelle von Absorption. </li><li> Führen Sie die Schritte in Abschnitt 1.2, um einen 6-Kanal-AUC Zelle mit Quarzfenster montieren. Legen Sie die höchste Konzentration Probe (A 280, 12 mm = 0,8) in den Kanal am nächsten an der Rotormitte und niedrigste Konzentration Probe (A 280, 12 mm = 0,3) am weitesten von der Mitte des Rotors. </li></ol> 2.3. Einrichten Absorptionsmessungen <ol><li> Erstellen Sie eine neue Datei einrichten (Datei | Neue Datei) die Angabe &quot;Equilibrium&quot; und &quot;Absorption&quot; Messung. Geben Sie 280 nm als Detektor Wellenlänge. </li><li> Führen radialen Kalibrierung bei 3000 Umdrehungen pro Minute, indem Sie &quot;Radial Kalibrierung vor dem ersten Scan&quot; im Scan-Optionen, unter Angabe der Datenerhebung bei niedriger Auflösung, zB mit Radial-Schrittweite = 0,01 cm, Replikate = 3 (niedrige Auflösung, schnell), und die Ausführung eines Single Scan . Nachdem der Scan abgeschlossen ist, deaktivieren Sie die Option. </li><li> Richten Sie eine Sedimentationsgleichgewichtsmethode (&quot;Method &quot;Taste), um mit der ersten Geschwindigkeit in Schritt 2.1.3 berechnet laufen, bei 20 ° C, und sammeln Sie ein Scan alle 30 Minuten. In allen Zellen &quot;Detail&quot;, geben Sie die Datenerfassung mit niedriger Auflösung, wie in Schritt 2.3.2. Überwachen Gleichgewicht Fortschritt durch Öffnen der Dateien in HeteroAnalysis und Auswählen von Funktionen &quot;Spiel&quot; nach mindestens 18 Stunden (etwa über Nacht, Abb. 4). Anmerkung: Gleichgewichtseinstellung kann wesentlich längere Zeit für die erste Geschwindigkeit zu nehmen, während die nachfolgenden Geschwindigkeiten wird weniger Zeit. </li></ol><img alt="4" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Ergebnisse HeteroAnalysis Spiel-Funktion. Die erste und zweite Drehzahlen (oben links und rechts) erscheinen, um ein Gleichgewicht erreicht haben, aber es ist besser, ein paar Stunden warten, um sicher zu sein. Im Vergleich dazu haben die dritten und vierten Gang (links unten und rechts) deutlich Gleichgewicht erreichtin kürzerer Zeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <ol><li> Nachdem das Gleichgewicht erreicht ist, sammeln einen einzigen Scan mit hoher Auflösung, zB mit Radial Schrittgröße = 0.001 cm, Replikate = 10 (hohe Auflösung, langsam). </li><li> Nachdem der Scan abgeschlossen ist, wiederholen Sie die Schritte 2.3.3 und 2.3.4 für die nächste Geschwindigkeit. </li><li> Optional kann, wenn die erforderliche Zeit, um zu erreichen Gleichgewicht für jede Drehzahl ist bekannt (berechnet oder aus Erfahrung), die Sedimentationsgleichgewichtsmethode Scan eingestellt ist, um alle in Schritt 2.1.3 und berechnet Geschwindigkeiten sind bis 1 Scan nach der Gleichgewichtszeit für jeden zu sammeln Geschwindigkeit. In diesem Fall geben Sie hochauflösende Datenerhebung eines Zellen &quot;Detail&quot;. </li></ol> 2.4. Datenanalyse in SEDFIT und SEDPHAT Hinweis: Weitere Details und die Überlegungen bei der Datenanalyse Leser verwiesen to der folgenden Website: www.analyticalultracentrifugation.com. <ol><li> Öffnen Sie hochauflösende Scans in SEDFIT (Data | Last Sedimentationsgleichgewichtsdaten) und teilen Sie die Daten in 3 Kanäle (diese entsprechen unterschiedlichen Konzentrationen für jede Probe, Optionen | Loading Optionen | Speichern 6-Kanal-Rohdaten in 3 Untergruppen). </li><li> Wieder offenen Dateien, die auf der gleichen Probe und derselben Konzentration jedoch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in SEDFIT gehören. Stellen Sie den Meniskus (senkrechte rote Linie), Zellenboden (vertikale blaue Linie) und Pass Grenzen (vertikale grüne Linie), und exportieren Sie die Daten für den Einsatz in SEDPHAT (Data | Daten exportieren, um SEDPHAT). Eingabe der in Schritt 2.1.1 berechnet sowie Rotortyp und Kerntyp wie geforderten Parameter. Wiederholen Sie diesen Schritt für jede Probe und Konzentration. </li><li> Öffnen Sie alle Daten aus der gleichen Probe (alle Konzentrationen und Geschwindigkeiten) in SEDPHAT und füllen Experiment-Parameter; ein Beispiel ist in Fig. 5. Hinweis: wenn D 2 O in dem Puffer, deut hinzugefügt<html> ration von austauschbaren Protonen könnte das Molekulargewicht des Proteins wesentlich verändern, insbesondere für wasserlösliche Proteine. Membranproteine, vor allem kleine wie SH-Protein, sind weniger betroffen, da Membran eingebetteten Regionen sind vom Umtausch geschützt. Um dies zu korrigieren, geben Sie die &quot;Puffer D Molenbruch&quot;. Hinweis: Bei diesem Schritt wird empfohlen, um die bearbeitete Datensatz einzeln, indem Sie im Menü Daten speichern | Kopieren aller Daten und Save As New Config. </li><li> Wählen Sie ein Modell und füllen Globale Parameter für dieses Modell. Hinweis: Ein Beispiel sind die &quot;Monomer-n-Mer Selbstassoziation&quot; Modell und seine Parameter in Abb. 6. </li></ol><img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Abbildung 5. Ein Beispiel, wie man in der experimentellen Parameter zu füllen. Dateien / ftp_upload / 52.404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6. Ein Beispiel, wie man in Globale Parameter für die Monomer-n-Mer Selbstassoziation Modell zu füllen. <ol><li> Führen Sie einen globalen Fit über den Menü Fit | Die globale Fit und warten, bis die Passform konvergiert. Notieren Sie sich (oder nehmen Sie einen Screenshot) die passenden Ergebnisse, vor allem die globale reduzierte Chi-Quadrat-und log K a-Werte. Extrahieren Sie andere Daten wie Passdaten und passende Residuen aus dem Menü Kopieren und Anzeigen | Anzeigen Thermodynamische Informationen. </li><li> Zurück zur Seite Globale Parameter und überprüfen Sie M (1), das Monomer Molekulargewicht passen, und wiederholen Sie Schritt 2.4.5. Notieren Sie die Einbaumolekulargewicht und die globale reduzierte Chi-Quadrat. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.4.3 bis 2.4.6 für jedes Modell zu testen und vergleichen die Passqualität jedes Modell durch einen Vergleich der verringerten globalen Chi-Quadrat-Wert sowie passende Residuen. Hinweis: Kleine und Zufallspass Residuen allgemein eine gute Passform, und das Modell, das am besten wäreden geringsten globalen reduziert Chi-Quadrat. Die Einbau Monomer Molekulargewicht und seine Chi-Quadrat-Wert sollte nicht wesentlich von dem des feststehenden (theoretische) Molekulargewicht unterscheiden. </li><li> Berechnen Sie das Vertrauensintervall für die erhaltenen log Ka von Wert von ersten Auswahl Statistik | Kritische Chi-Quadrat für Fehler Oberflächenprojektionen und die Eingabe des gewünschten Konfidenzintervalls. Als nächstes, um Statistik Forum | Gene 1-dimensionale Fehler Flächenprojektion und deaktivieren loggen Ka im Dialog Globale Parameter, die Chi-Quadrat-Werte für log Ka erhalten. Hinweis: Leser wird empfohlen, die folgenden Quellen (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) für weitere Informationen über die Verfahren 32 sowie Abbildung der Methode 33 zu konsultieren. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Dokument enthält eine experimentelle Protokoll für die Probenvorbereitung und Analyse von Oligomerisierung von einem kleinen Membranprotein in Waschmittel mit Gleichgewicht Sedimentation. Das beschriebene Protokoll ist gleichermaßen gültig -und simpler- für lösliche Proteine, wie die Dichte Anpassungsschritt nicht erforderlich ist. Tatsächlich wird das System durch ein Gemisch aus Reinigungsmittel und Protein gebildet ist. Um Sedimentation Studien durchzuführen, muss das Reinigungsmittel unsichtbar für das Gravit...

Analytische Ultrazentrifugation 1-5 ist eine der wichtigsten Methoden, um Wechselwirkungen von Makromolekülen, die unter physiologischen Bedingungen zu studieren, zugänglich sowohl schwache und starke Wechselwirkung. Die Methode ist markierungsfreie und nutzt Lichtabsorption oder Störungen und sogar Fluoreszenz optische Systeme verwendet werden, um Konzentrationsbereiche über mehrere Größenordnungen 6 zuzugreifen. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, da die meisten biochemischen Prozessen abhängen reversible Interaktionen. Die Stöchiometrie und die Stärke dieser Wechselwirkungen müssen quantitativ charakterisiert, um biologische Prozesse zu verstehen, und eine Reihe von Methoden für diesen Zweck 7, 8 vorhanden sind. Allerdings sind vorübergehende Wechselwirkungen schwer zu untersuchen 9. Die Wahl eines Verfahrens zur makromolekularen Wechselwirkungen charakterisieren hängt von seiner statischen oder dynamischen Natur. Im ersten Fall, SEDIM<html> entation Geschwindigkeit (SV) verwendet wird, wobei die Rate der radialen Transport gemessen und Komplexe werden auf der Grundlage von Unterschieden in Auftriebs Masse und Form fraktioniert. Im Gegensatz dazu können dynamische Verbände, die auf der Zeitskala des Experiments reversible nicht physisch getrennt sein. In diesem Fall kann selbst- oder hetero-Wechselwirkungen, die zu nicht-kovalente Wechselwirkungen in einem Gleichgewicht stehen, die auf der Gesamtproteinkonzentration abhängt. Diese dynamischen Wechselwirkungen kann sowohl Sedimentationsgleichgewicht (SE) und Sedimentation Geschwindigkeit (SV) 10 untersucht werden. Jedoch ist das erste Verfahren einfacher durchzuführen, und wird hier beschrieben. In SE wird eine Zentrifugation bei einer ausreichend niedrigen Geschwindigkeit durchgeführt, so dass ein Gleichgewicht zwischen Diffusion und Sedimentation erreicht. An diesem Punkt wird das Gleichgewichtsprofil eines optischen Signals (UV-VIS) als eine Funktion des radialen Abstands, können mit vorgegebenen thermodynamischen Modellen für Verbände 11 analysiert werden. ve_content &quot;&gt; In der vorliegenden Arbeit wird eine Sedimentationsgleichgewichts Untersuchung der Selbstassoziation von einem viralen Membranprotein, Ionenkanäle bildet. Aufgrund ihrer Hydrophobizität präsentiert wird das Experiment in Gegenwart eines Detergens ausgeführt wird, und in diesem Fall die Dichte Lösungsmittel auf, dass der Reinigungsmittel abgestimmt werden. Das beschriebene Protokoll würde im Falle eines wasserlöslichen Proteins identisch ist, außer daß kein Lösungsmittel Dichteanpassung erforderlich wäre. Das verwendete Protein ist in der menschlichen Respiratory Syncytial Virus (HRSV), ein umhülltes Pneumovirus der Paramyxoviridae Familie, die Erkrankung der unteren Atemwege bei Säuglingen und älteren Menschen immun Populationen weltweit 12 bewirkt kodiert. Bis zu 64 Millionen Fälle von HRSV Infektion und 160.000 Todesfälle pro Jahr. HRSV Genom transkribiert 11 Proteinen, einschließlich der drei Membranproteine ​​F, G und kleine hydrophobe (SH). SH-Proteins beteiligt istbei der Pathogenese von RSV-Infektion. RSV fehlt das SH-Gen (RSVΔSH) war lebensfähig, verursacht die Bildung von Syncytien und wuchs als auch der Wildtyp (WT) Virus 13-16. Jedoch repliziert RSVΔSH Virus 10-mal weniger wirksam als das WT in den oberen Atemwegen 15, 16. Außerdem wurde RSVΔSH Virus in in vivo-Maus und Schimpansen Modelle 13, 17 gedämpft. Der SH-Protein ist ein 64 (RSV Untergruppe A) oder 65 (RSV Untergruppe B) Aminosäuren lang Typ II integrales Membranprotein, die meist an den Membranen des Golgi-Kompartiment 18 ansammelt. SH-Protein hat eine einzige sagte eine Helix-Transmembran (TM) Domäne 19, die hoch konserviert ist 20,21. Die C- und N-terminalen Domänen extramembranären lumenally / extrazellulär cytoplasmatisch, jeweils ausgerichtet sind. Sowohl synthetische TM-Domäne (Reste 18-43) Und in voller Länge SH Protein wurde gezeigt, dass homopentamers in einer Vielzahl von Reinigungsmitteln zu bilden. Die homopentameric Form ist für die Kanalaktivität in planaren Lipid-Doppelschichten 22,23 verantwortlich. Die korrekte Orientierung der TM-Monomeren in der Lipiddoppelschicht wurde zuerst bestimmt unter Verwendung von ortsspezifischen Infrarot-Dichroismus 23, die zeigten, His-22 in einer luminalen Seite nahe inter-helikalen, Orientierung. Das gleiche TM Domänenorientierung wurde durch NMR-Untersuchungen, die pentameren eine -helikale Bündel des gesamten Proteins in Dodecylphosphocholin (DPC) rekonstruiert Micellen 22 bestätigt. In diesem Modell &quot;Mizelle&quot;, ein einzelnes a- helikalen Transmembrandomäne wurde N-terminal durch eine a-Helix durch eine erweiterte b-Hairpin flankiert, und C-terminal. Die beiden protonierbaren Reste von SH-Protein, His-22 und His-51, sind in der TM-Domäne (lumenally orientiert) angeordnet ist, und an der Spitze des extramembranären C-terminalen β Hairpins (vom Kanalpore) sind. In einem bicellar environment erstreckt sich jedoch das TM α-Helix bis His-51, und beide His-Resten zugänglich dem Lumen des Kanals 24 sind. Die Kanalstruktur nimmt eine trichterartige Architektur 22, wobei der engere Bereich (Ser-29 bis Cys-45) 22 ist mit hydrophoben Seitenketten (Ile-32 Ile-36 Ile-40 und Leu-44) und ausgekleidet Ile-36 ist der engsten Stelle in der Kanal Lumen. His-22 mit der größten Öffnung des Trichters, während His-51 ist an der Spitze der kleinsten Öffnung. In der vorliegenden Arbeit, analytischen Zentrifugation in einer Sedimentationsgleichgewicht Modus verwendet wurde, um festzustellen, ob seine Protonierung die Stabilität des SH-Protein Pentamer betrifft. In diesem Fall wurde SH-Protein in C14-Betain-Wasch, die zuvor verwendet wurde, um die sh Proteinformen pentameren Oligomere 22 zeigen solubilisiert.

<table><tbody><tr><td>3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propansulfonat</td><td>Sigma</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxid 99,8</td>%<td>Cambridge Isotop</td><td>DLM-4-99.8</td><td></td></tr><tr><td>An-50 Ti Rotor, analytisch, 8-fach</td><td>Beckman Schar</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti Rotor, analytisch, 4-fach</td><td>Beckman Schar</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>Zellgehäuse</td><td>Beckman Schar</td><td></td><td></td>334784</tr><tr><td>12 mm Sechskanal-Mittelstück, mit Epon anthrazit gefüllt</td><td>Beckman Coulter</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Fensterhalter</td><td>Beckman Coulter</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>Fensterdichtung</td><td>Beckman Coulter</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>Fensterverkleidung</td><td>Beckman Coulter</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire Fenster</td><td>Beckman Coulter</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>Quarzfenster</td><td>Beckman Coulter</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>Schraubenringscheibe</td><td>Beckman Coulter</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>Schraubring</td><td>Beckman Coulter</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote</td><td>Beckman Coulter</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>Drehmomentständerbaugruppe</td><td>Beckman Coulter</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>Gegengewicht</td><td>Beckman Coulter</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>Zellausrichtungswerkzeug</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalyse&nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

sedimentationsgleichgewicht eines klein oligomer bildenden membrane protein: wirkung von histidin protonierung auf pentamere stabilität

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytische Ultrazentrifugation (AUC) kann verwendet werden, um reversible Wechselwirkungen zwischen Makromolekülen über einen weiten Bereich von Wechselwirkungsstärken und unter physiologischen Bedingungen untersucht werden. Dies macht AUC eine Methode der Wahl die quantitative Erfassung Stöchiometrie und Thermodynamik von Homo- und Hetero-Vereinigung, die vorübergehende und reversible in biochemischen Prozessen sind. In der Modalität Sedimentationsgleichgewichts (SE), ein Gleichgewicht zwischen Diffusion und Sedimentation ein Profil als eine Funktion der radialen Distanz, die an einem bestimmten Assoziationsmodell abhängt. Hierin wird eine detaillierte SE Protokoll beschrieben, um die Größe und die Monomer-Monomer-Assoziationsenergie eines kleinen Membranprotein-Oligomer mittels einer analytischen Ultrazentrifuge bestimmen. AUC-ES ist markierungsfreie, nur auf physikalischen Prinzipien beruhen, und kann auf beiden wasserlöslich und Membranproteinen verwendet werden. Ein Beispiel des letzteren gezeigt ist, die kleinen hydrophoben (SH) Protein im menschlichen Respiratory Syncytial Virus (HRSV), Ein 65-Aminosäuren-Polypeptid mit einer einzigen α-Helix-Transmembran (TM), die gegen pentamere Ionenkanäle bildet. NMR basierenden Strukturdaten zeigt, daß SH-Protein hat zwei protonierbare His-Resten in seiner Transmembrandomäne, die dem Lumen zugewandt orientiert des Kanals. SE-Experimente wurden entworfen, um festzustellen, wie pH Assoziationskonstante und die oligomere Größe SH Proteins beeinflusst. Während die pentameren Form wurde in allen Fällen erhalten, wurde sein Assoziationskonstante bei niedrigen pH reduziert. Diese Daten sind in Übereinstimmung mit einem ähnlichen pH-Abhängigkeit für SH Kanalaktivität beobachtet, die mit einer Lumen Orientierung der beiden His-Reste in SH-Protein. Letztere können die elektrostatische Abstoßung und reduziert Oligomer Stabilität bei niedrigen pH zu erleben. Zusammenfassend ist das Verfahren anwendbar, wenn die quantitative Informationen über feine Assoziation von Proteinen Veränderungen in physiologischen Bedingungen gemessen werden.

Die radiale Verteilungsprofil C14SB Detergensmicellen in 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7,3 bildet einen sehr flachen Exponentialfunktion, die auf einem linearen Modell (7A) ausgestattet werden kann. Die Steigung dieser Verteilung wird invers mit D 2 O-Konzentration (Abbildung 7B) korreliert. Der Punkt, wo die Neigung Null ist, das heißt, die Anpassungs D 2 O-Konzentration, wurde gefunden, daß 32,3% sein. Siehe Abbildung 7 ...

Sedimentationsgleichgewicht (SE) kann verwendet werden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in einer physiologischen Umgebung zu untersuchen. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung dieser Technik, um die Wirkung des pH-Werts auf die Stabilität eines Homo-Pentamers zu bestimmen, das aus dem kleinen hydrophoben (SH) Protein gebildet wird, das vom humanen Synzytial-Respiratorischen Virus (hRSV) kodiert wird.

Sedimentationsgleichgewicht eines Klein Oligomer bildenden Membrane Protein: Wirkung von Histidin Protonierung auf pentamere Stabilität

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Größe des Oligomers zu bestimmen, das von einem kleinen hydrophoben Polypeptid im C14-Sulfalan-Detergens gebildet wird, sowie die Stabilität dieses Oligomers, wenn der pH-Wert geändert wird. Dies wird zunächst durch die Bestimmung der Deuteriumoxid-Konzentration erreicht, die der Dichte der Detergens-Mizellen entspricht und somit deren Auftrieb neutralisiert. Als zweiter Schritt wird eine Reihe von Sedimentationsgleichgewichtsexperimenten an den in Lösung gebrachten Proben des kleinen hydrophoben Proteins durchgeführt.Im C 14 Sulfalane-Tensid wird die bestimmte Detergensoxid-Konzentration verwendet. Anschließend werden der erste und zweite Schritt bei einem anderen pH-Wert wiederholt, um das Sedimentationsprofil des Proteins bei diesen verschiedenen pH-Werten zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen sowohl die oligomere Größe des kleinen hydrophoben Proteins in diesem Tensid als auch den Einfluss des pH-Werts auf die Stabilität dieses Oligomers in C 14 Sulfalane-Tensid.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da mehrere Schritte wie die Montage, das Beladen der Zellen, die Dichteanpassung und das Erreichen der Gleichgewichtsbedingungen erforderlich sind, was Erstnutzer leicht überfordern und verwirren kann. Jeder kleine Fehler in diesen Schritten kann potenziell mehrere Tage experimenteller Arbeitszeit verschwenden. Das Verfahren wird von Suria, einer Doktorandin in meinem Labor, vorgeführt.Zunächst bereiten Sie einen 10×-Puffer und ein 50×-Detergens vor. Stamlösungen herstellen und jede über einen 0,2-Mikrometer-Spritzenfilter in ein 1,5-Milliliter-Einor abfiltern, sterilisieren. Bereiten Sie 200 Mikroliter drei getrennter Probelösungen vor, die 10 %, 30 % bzw. 50 % Deuteriumoxid bezogen auf das Volumen enthalten.Um eine sechsstufige analytische Ultrazentrifugationszelle ohne externes Befüllen zusammenzubauen, setzen Sie die Fensterdichtung in den Fensterhalter, biegen Sie leicht die Fensterzwischenlage und setzen Sie sie in den Fensterhalter ein, sodass sich der Spalt gegenüber dem Fensterhalter bildet. Schlüsselloch, dann ein Saphirfenster in die Fensterzwischenlage einsetzen, wobei die Markierung mit dem Fensterhalter ausgerichtet wird. Schlüsselloch, das Gehäuse mit der Teilennummer nach unten legen, wobei die Schlüssellöcher mit dem Gehäuseschlüssel übereinstimmen.Schieben Sie ein sechseckiges Zentrumselement mit abgeschrägter Seite nach unten in das Zellgehäuse, gefolgt von einer Fenstereinheit mit nach unten zeigendem Fenster. Bestreichen Sie anschließend die Gewindegänge und die Schraubringdichtscheibe leicht mit Spin-Coat-Schmiermittel. Setzen Sie eine Schraubringdichtscheibe auf die Fenstereinheit. Bringen Sie den Schraubring in das Fenstergehäuse ein, wobei das Wort „out“ nach außen zeigt, und ziehen Sie den Schraubring mit Hilfe des Zellausrichtwerkzeugs per Hand an.Dann die Schraubmutter nur mit 60 inch pounds mithilfe des Drehmomentschlüssels festziehen. Danach eine Zelle mit der Teilennummer senkrecht ausgerichtet und in Position 12 Uhr platzieren. 120 Mikroliter Referenzlösung in die linken Reihen und 110 Mikroliter Probenlösung in die rechten Reihen einfüllen.Unter Verwendung einer 200-Mikroliter-Pipette sicherstellen, dass jede Probe und jeder Referenzwert korrekt gepaart ist. Eine Fensteranordnung mit der Fensterseite nach unten vorsichtig in das Zellgehäuse schieben, wobei darauf geachtet werden muss, die Zelle nicht übermäßig zu stören, da dies zu einem Auslaufen ihres Inhalts führen könnte. Die vorherigen Schritte wiederholen und den zweiten Schraubring auf 120 Zoll-Pfund festziehen.Danach invertieren Sie die Zelle und ziehen den ersten Schraubring erneut auf 120 Zollpfund fest. Laden Sie die Zellen in den Rotor. Installieren Sie den Rotor in die Zentrifuge und bauen Sie das Monochromator gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.Nachdem ein ausreichender Vakuumzustand erreicht wurde, die Zentrifuge mit 3000 U/min laufen lassen. Das Interferenzmuster in der Benutzeroberflächen-Software vorab anzeigen und die Laserparameter anpassen, um den höchsten Kontrast zu erzielen. Anschließend eine neue Setup-Datei erstellen und Gleichgewichts- sowie Interferenzmessung festlegen.Richten Sie eine Sedimentationsgleichgewichtsmethode ein, die mit 45.000 Umdrehungen pro Minute oder der höchsten für Proteinproben vorgesehenen Geschwindigkeit bei einer Lauftemperatur von 20 Grad Celsius läuft. Nehmen Sie nach der ersten Aufnahme alle 15 Minuten einen Scan über mindestens 12 Stunden auf. Überwachen Sie den Fortschritt des Gleichgewichts, indem Sie die Datendateien in der Hetero-Analyse öffnen und die Übereinstimmungsfunktion auswählen. Bauen Sie zu diesem Zeitpunkt eine sechskanalige Zelle für die analytische Ultrazentrifugation mit Quarzfenstern auf dieselbe Weise wie zuvor zusammen.Unter Verwendung von Gel-Ladepipettenspitzen die zuvor vorbereitete Probe des kleinen hydrophoben Proteins mit der höchsten Konzentration in dem Kanal laden, der dem Rotormittelpunkt am nächsten liegt, und die Probe mit der niedrigsten Konzentration in dem Kanal, der dem Rotormittelpunkt am weitesten entfernt ist. Zum Einrichten der Absorptionsmessung eine neue Setup-Datei anlegen, in der Gleichgewicht und Absorptionsmessung angegeben werden. Als Detektorwellenlänge 280 Nanometer festlegen.Danach eine radiale Kalibrierung bei 3000 U/min durchführen, indem vor dem ersten Scan und in den Scan-Optionen die radiale Kalibrierung überprüft wird. Die Datensammlung bei niedriger Auflösung festlegen und einen einzelnen Scan durchführen. Nach Abschluss des Scans die Option deaktivieren.Richten Sie eine Sedimentationsgleichgewichtsmethode ein, die bei der zuvor berechneten ersten Geschwindigkeit bei 20 Grad Celsius läuft, und erfassen Sie alle 30 Minuten einen Scan für jedes Zelldetail. Legen Sie die Datensammlung mit niedriger Auflösung nach mindestens 18 Stunden fest. Überwachen Sie den Fortschritt des Gleichgewichts, indem Sie die Datendateien in der heterogenen Analyse öffnen und die Abgleichfunktion auswählen, sobald das Gleichgewicht erreicht ist.Sammeln Sie nach Abschluss des Scans eine einzelne Aufnahme mit hoher Auflösung. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte für die nächste Geschwindigkeit, sobald die zur Erreichung des Gleichgewichts für jede Geschwindigkeit erforderliche Zeit bekannt ist. Richten Sie die Sedimentations-Gleichgewichtsmethode „Scan“ so ein, dass alle zuvor berechneten Geschwindigkeiten enthalten sind, und nehmen Sie jeweils eine Aufnahme nach der Gleichgewichtszeit für jede Geschwindigkeit auf.In diesem Fall geben Sie eine Datenerfassung mit hoher Auflösung für jede Zelle an, um die radiale Verteilung des C 14 Sultandetergens in meinen Zellen sowie 50 molarer Natriumphosphatpuffer zu erfassen. Bei pH 7,3 ergibt sich eine sehr flache exponentielle Kurve, die durch ein lineares Modell angepasst werden kann. Die Steigung dieses Profils hängt von der Deuteriumoxid-Konzentration ab, und die Konzentration, die eine Steigung von null ergibt, betrug 32,3 %. Das gleiche Experiment wurde für pH 5,5 und pH 3 wiederholt, um entsprechende Deuteriumoxid-Konzentrationen von 30,3 % bzw. 41 % zu erhalten.Bei einem pH-Wert von 7,3 bildeten das kleine hydrophobe Protein und das Detergens Pentamere mit einem scheinbaren Logarithmus der Affinitätskonstante von 21,05. Die Assoziationskonstante änderte sich bei pH 5,5 nicht, war jedoch bei pH 3 deutlich verringert. Dies steht im Einklang mit früheren Berichten, die eine Abnahme der Leitfähigkeit bei niedrigerem pH-Wert mit einem pK von etwa 4,5 zeigen.Wenn man einmal den Gleichgewichtszellenaufbau beherrscht, können das Beladen und die Versuchsvorbereitung innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, sofern alles ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Sedimentationsgleichgewichtsexperiment vorbereitet, um die oligomere Größe Ihres Membranproteins zu bestimmen und die Stabilität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu vergleichen.

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Forschung

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Chemie

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Viele Proteine erfüllen ihre Funktion, wenn sie an Membranoberflächen gebunden sind. Die Bindung von extrinsischen Proteinen an Nanodisc-Membranen kann indirekt durch Transmissionselektronenmikroskopie abgebildet werden. Wir zeigen, dass das charakteristische Stapeln (Rouleau) von Nanodiscs, das durch die Negativfärbung Natriumphosphotungat induziert wird, durch die Bindung von extrinsischem Protein verhindert wird.

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie ein Modell mit niedriger Auflösung ab-initio und Strukturdetails Waschmittel solubilisiert Membranprotein in Lösung mit kleinen Winkel Neutronenstreuung mit Kontrast-matching des Waschmittels zu erhalten.

Kontrast-passende Reinigungsmittel im Small-Angle Neutron Streuexperimente für Membrane Protein strukturelle Analyse und Modellierung von Ab Initio

Ein Protokoll wird präsentiert, um schnell die thermische Stabilität von Proteinen in einer Vielzahl von Bedingungen durch thermische Verschiebung Assays und Nano differential scanning Fluorimetry testen. Puffersysteme, Salze und Zusatzstoffe, zusammen sind bestehend aus drei einzigartige Stabilität Bildschirme mit Proteinen zu identifizieren geeignete Puffer für funktionelle und strukturelle Studien untersucht.

Wie Protein zu stabilisieren: Stabilität-Bildschirme für thermische Verschiebung Assays und Nano-Differential Scanning Fluorimetry in den Virus-X-Projekt

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um den Dimer-Dodecamer-Übergang von TmPep1050, einer M42-Aminopeptidase, auf struktureller Ebene zu untersuchen. Es ist eine einfache Pipeline, die von der Proteinreinigung bis zur Röntgendatenverarbeitung reicht. Crystallogenese, Datensatzindexierung und molekularer Ersatz wurden durch einen Studienfall, TmPep1050H60A H307A Variante, betont.

Röntgenkristallographie zur Untersuchung des oligomeren Zustandsübergangs der Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Erfahren Sie, wie Sedimentationsgleichgewicht zur Untersuchung von Protein-Oligomeren verwendet wird. Diese Methode zeigt den Einfluss von pH-Wert auf die Stabilität pentamerer Membranproteine aus hRSV.

Sedimentationsgleichgewicht eines Klein Oligomer bildenden Membrane Protein: Wirkung von Histidin Protonierung auf pentamere Stabilität (Video) | JoVE Journal

Sedimentationsgleichgewicht eines Klein Oligomer bildenden Membrane Protein: Wirkung von Histidin Protonierung auf pentamere Stabilität

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