Name: Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Lernen Sie einen optogenetischen Ansatz zur Untersuchung synaptischer Verbindungen zwischen iPSC-abgeleiteten Neuronen und primären Kortikalneuronen in einem Co-Kultursystem. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen neuronaler Netzwerke.

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Wir danken K. Deisseroth und S. Je nach den ChR2 und Synapsin1-tdTomato lentiviralen Konstrukte bzw. C. Chai für den Austausch von Know-how und das Protokoll auf iPSC Generation, WY Leong für die technische Unterstützung, die Mitglieder der Goh-Labor für den Austausch von Reagenzien und Know-how. Diese Arbeit wurde von Abbott Nutrition and Academic Centre of Excellence (ACE) Forschungspreis von Glaxosmithkline (GSK) zu ELG im Rahmen ihrer wettbewerbsfähiges Forschungsprogramm (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) zu ELG, die von der National Research Foundation Singapur und GJA und von der Weltklasse Institute (WCI) Programm der National Research Foundation of Korea (NRF), die vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie Korea (MEST) gefördert (NRF Förderkennzeichen: WCI 2009-003) zu GJA

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</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Optogenetik stellt zeitliche und räumliche Präzision für die Aktivierung von definierten Populationen von Neuronen 13. In unseren Experimenten wurde der gesamte Bereich des Mikroskopobjektivs 30 Sek Photo stimulieren nur kortikalen Neuronen, ChR2 beleuchtet. Dies erlaubte uns, zu bestimmen, ob die synaptische Verbindungen wurden zwischen den verschiedenen Populationen von Neuronen in der Co-Kultur gebildet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Photo erhöht PSC Frequenz in iPS-abgeleitete Neuronen, was zeigt, dass diese Neuronen erhalten synaptischen Input von präsynaptischen Neurone Ausdruck ChR2. Dies wiederum festgestellt, dass die iPSC abgeleiteten Neuronen erfolgreich in Schaltungen mit den kortikalen Neuronen aufgenommen. Es gibt mehrere wichtige Schritte zur Erzeugung des Co-Kultursystem. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Maus NPC abgeleiteten Astrocytenkulturen gesund sind, mit minimalem Zelltod, bevor mit Überzug ausgehendvon anderen Zelltypen. Kortikalen Neuronen und menschlichen NPCs und befestigen auf gesunde Astrozyten und elektrophysiologischen Ableitungen hängen stark von den Kulturbedingungen. Die andere wichtige Schritte in diesem Protokoll sind die Elektroporation und Plattieren von kortikalen Neuronen auf Astrozytenkulturen. Da eine große Anzahl von Zellen nach der Elektroporation sterben, ist es wichtig, sicherzustellen, dass zumindest 6 Millionen kortikalen Neuronen zum Ausplattieren auf Astrocytenkulturen in Platten mit 24 Vertiefungen elektroporiert. Wir haben beobachtet, dass, wenn weniger als 6 Millionen Zellen wurden elektroporiert, die Anzahl der Neuronen, die überlebt haben, nicht einen dichten neuronalen Netzwerk, das elektrophysiologische Aufzeichnungen betroffen bilden. Die Anzahl der durch Elektroporation kortikalen Neuronen sollte auch konsequent sein für jeden Co-Kultur-Experiment Vergleich zwischen unterschiedlichen Studien zu ermöglichen. Für alle Schritte, welche die enzymatische Verdauung, ist es wesentlich, die nicht an Zellen in Verdauungslösung zu lange, weil es zum Zelltod führen lassen. DieseAnsatz kann verwendet werden, um die Fähigkeit von Neuronen aus patientenspezifischen Fibroblasten synaptische Kontakte mit anderen Neuronen bilden screenen. Neuronen aus Fibroblasten von Patienten mit der Erkrankung des Nervensystems Rett-Syndrom (RTT) abgeleitet aufweisen synaptischen Übertragung Defekte: RTT Neuronen zeigen eine signifikante Abnahme der PSC Frequenz und Amplitude im Vergleich zu gesunden Neuronen, was vermutlich auf weniger synaptischer Verbindungen 14. Unsere Co-Kultursystem erlaubt die Untersuchung der Wirkung von Medikamenten auf Neuronen anzeigt Entwicklungsdefekte. Dies kann durch Zugabe von Verbindungen von Interesse bei der Aussaat von erkrankten menschlichen NSC sowie bei kontinuierlicher Exposition zu Verbindungen der ganzen Zeit der neuronalen Differenzierung durchgeführt werden. Während diese Co-Kultursystem kann auch als Modell für Drogentests verwendet werden, ist eine Einschränkung bei diesem Ansatz, dass der Prozess der Untersuchung der Auswirkungen der einzelnen Kandidatenverbindung kann lang und mühsam sein, wiees ist nicht ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren. Nach der Behandlung mit Wirkstoffkandidaten haben iPSC abgeleiteten Neuronen einzeln gepatcht werden, um die Auswirkungen der einzelnen Verbindungen auf PSCs zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es noch nicht viele vorhanden Fibroblasten und iPS-Zellen von Patienten. Daher wird es von Interesse, in der nahen Zukunft sein, mehr Patientenzellen und auch auf dieses Protokoll für Hochdurchsatz-Screening angepasst werden. Zum Beispiel durch Markierung iPSC abgeleiteten Neuronen mit einem Indikator, wie beispielsweise genetisch codierten Sensoren von Ionen oder des Membranpotentials, wäre es möglich, die Durchlaufgeschwindigkeit im Wesentlichen durch Seitenschritt die zeitraubelektrophysiologische Prozedur zu erhöhen. Da der gesamte Vorgang der Erzeugung dieses Co-Kultursystem, von Umprogrammierung Fibroblasten zur Durchführung elektrophysiologischen Ableitungen, benötigt mehr als 90 Tage, ist es empfehlenswert, entweder die menschlichen iPSCs oder NSC erweitert werden, nach der Umprogrammierung und neurale Induktion Schritte jeweilsund kryokonserviert, um die Zeit für zukünftige Experimente nötig zu verringern. In unseren Experimenten haben wir ausgedrückt ChR2 in kortikalen Neuronen unter synapsin1 Promotors. Da dieser Promotor pan-neuronalen wir vermutlich wurden beide hemmenden und erregenden kortikalen Neuronen photostimulating. Wenn das Ziel der zukünftigen Experimenten ist, spezifisch abzufragen entweder inhibitorisch oder exzitatorischer Schaltungen könnten spezifischeren Promotoren verwendet werden. Alternativ könnte kortikalen Neuronen aus transgenen (oder Virus-injizierten Mäusen) wobei ChR2 Expression spezifisch genetisch definierte Subpopulationen von Neuronen gezielt erhalten werden. Zum Beispiel, Ernte kortikalen Gewebe von einer Maus, die Cre-Rekombinase hat ausgedrückt in Parvalbumin haltige Inter (PV Inter), die mit einer Maus mit floxed ChR2 gekreuzt ist eine Situation, in der nur kortikalen Neuronen, ChR2 wird PV Inter 15 werden erhalten. Die Verwendung solcher ChR2-exprimierenden Inter in unserer gleichzeitig culture System ermöglichen die Bestimmung, ob ein patched iPSC abgeleiteten Neuron ist in der Lage, in einen Stromkreis mit PV Inter integrieren. Basierend auf einer früheren Studie 9, sind kortikalen Neuronen reifen mit überlappenden Dendriten nach 14 Tagen in vitro. Wenn also die Photo keine Antwort von einem patched iPSC abgeleiteten Neuron hervorrufen sollte darauf hinweisen, dass das Neuron nicht die Fähigkeit, synaptische Verbindungen mit kortikalen Neuronen zu machen. Ein iPSC abgeleiteten Neuron kann synaptischen Eingang entweder von anderen iPSC abgeleiteten Neuronen oder kortikalen Neuronen empfangen. Wenn traditionelle Patch-Clamp-Messungen verwendet wurden, wäre es nicht möglich, zu unterscheiden, wo das synaptische Eingabe kommt. Der Vorteil unseres Systems ist die postsynaptische Reaktionen aus kortikalem präsynaptischen Eingang selektiv evozierten und identifiziert werden. Die hier beschriebenen Verfahren bieten einen einfachen Einstieg in die Fähigkeit der iPS-abgeleiteten Neuronen bewerten zu integrierenin einen definierten neuronalen Netzwerks.

In den letzten Jahren haben unser Verständnis des Neurons und der neuronalen Schaltungsfunktion durch mehrere optogenetische Werkzeuge, die neuronale Erregbarkeit steuern revolutioniert. Ein solches Instrument ist das Licht-aktivierten Kationen-Kanal, Channelrhodopsin-2 (ChR2): Neuronen, ChR2 Feuer Aktionspotentiale in Reaktion auf Lichtstimulation 1-3. Da Neuronen normalerweise nicht empfindlich auf Licht, öffnet sich diese bemerkenswerte Fähigkeit neue Wege für die genaue zeitliche und räumliche Steuerung der Aktivität von genetisch definierten Populationen von Neuronen 4 und hat sich stark beschleunigt Studien der Hirnfunktion. ChR2 wurde angewandt, um Zellforschung für verschiedene Zwecke ergeben, von der Überwachung der neuronalen Entwicklung 5 bis Regulierung Aktivität neuronaler Netzwerke 6. Hier ChR2 verwendet wir, um die Nützlichkeit eines neuronalen Cokultursystem erhöhen. Co-Kultur-Systeme ermöglichen die Bewertung von Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen.Co-Kulturen von Neuronen und Gliazellen, die Hauptzelltypen des Nervensystems werden häufig verwendet, um zu untersuchen Signalisierung zwischen den verschiedenen Zelltypen, sowie die Bedeutung dieser Signalisierung für physiologische Reaktionen zu bewerten, die Ausbreitung des Schadens und die Studie molekularen Mechanismen, die möglicherweise in dieser Signal 7 beteiligt sind. Eine frühere Untersuchung zeigte, dass menschliche iPSCs unterscheiden sich sehr schnell in die Neuronen in Gegenwart von Rattenkortexprimärkultur enthält Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia 8. In diesem Protokoll zeigen wir eine Methode, die ChR2 nutzt in einer Co-Kultursystem zur synaptischen Verbindungen zwischen Ratte kortikalen Neuronen und Neuronen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) abgeleitet verhören. Wir beschreiben Schritte zu zerlegen und zu ernten Hirngewebe 9 sowie zu pflegen und zu differenzieren Maus neurale Vorläuferzellen (NPCs) in Astrozyten und menschlichen NPCs into Neuronen, die Co-Kultursystem zu schaffen. Um diese Co-Kultursystem zu etablieren, haben wir die von Okita et al Integration freie Umprogrammierung Verfahren. 10 die menschliche iPS-Zellen zu erzeugen. Diese iPS-Zellen wurden dann effizient in NPCs in chemisch definierten Bedingungen differenziert mit niedermolekularen Inhibitoren wie von Li et al. 11 In den Co-Kulturen können die verschiedenen Populationen von Neuronen über Erkennung des ChR2 Expression in kortikale Neuronen und Markierung von iPSC abgeleiteten Neuronen über das fluoreszierende Protein, tandem-Dimer Tomate (tdTomato) identifiziert werden. Kombinieren elektrophysiologische Aufzeichnungen von iPSC abgeleiteten Neuronen mit optogenetische Photo der kortikalen Neuronen ermöglicht Einschätzung der Fähigkeit dieser zwei Arten von Neuronen zu einander bilden. Insbesondere Photo von ChR2-exprimierenden kortikalen Neuronen hervorrufen synaptischen Antworten in iPS-abgeleitete Neuronen, die synaptischen Schaltungen gebildet habenmit der photo kortikalen Neuronen-Netzwerk. Wir zeigen, dass erhöhte postsynaptische Ströme sind in der Tat in iPS-abgeleiteten Neuronen unter diesen Bedingungen erkannt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der synaptischen Schaltung unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen einschließlich Rekapitulation verschiedenen neurologischen Erkrankungsmodellen unter Verwendung iPSCs von Fibroblasten aus Patienten mit Morbus abgeleitet.

<table><tbody><tr><td>Neurocult Proliferation Kit (Maus)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5702</td><td>enthält NSC-Basalmedium und NSC-Proliferationsergänzung</td></tr><tr><td>Epi5 episomales iPSC-Reprogrammierungskit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>12719F</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasalmedium</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>MEM ohne Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>11090081</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Humanes LIF</td><td>Invitrogen</td><td>PHC9484</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130103926</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td></td></tr><tr><td>Compound E</td><td>Merck Millipore</td><td>565790</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Merck Millipore</td><td>324856</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>233FB025</td><td></td></tr><tr><td>Research Grade FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30160.03</td><td>Für Astrozyten-Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>Definiert FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>Für primäres Neuronenmedium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Für primäres Neuronenmedium</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>EMD Millipore</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td></td><td>15630080 für Entnahme von Gehirnen</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Zell-Sieb</td><td>BD Biosciences&nbsp; &nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; m Filtereinheit</td><td>Sartorius Stedim</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fluka</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7520</td><td>Für elektrophysiologische Untersuchungen</td></tr><tr><td>K-Gluconat</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>KANTO Chemical</td><td>3234400</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Für elektrophysiologische Untersuchungen</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>World precision instruments, Inc</td><td>1604323</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>9761146</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolben</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Deckgläser</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>111520</td><td></td></tr><tr><td>AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit& nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VPG1003</td><td>Für die Elektroporation von primären kortikalen Neuronen</td></tr><tr><td>Neon-Transfektionssystem&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>Für die Elektroporation von humanen Fibroblasten</td></tr><tr><td>Mini-Analyse&nbsp;</td><td>Synaptosoft</td><td>Mini Analysis v.6</td><td>Zur Messung von PSCs</td></tr><tr><td>Normal Dermal Human Fibroblasts</td><td>PromoCell</td><td>C12300</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE</td><td>Addgene</td><td>20945</td><td></td></tr><tr><td>Quecksilber-Kurzbogenlampe</td><td>OSRAM</td><td>HBO 103 W/2</td><td></td></tr></tbody></table>

ein optogenetische ansatz zur abschätzung bildung neuronaler verbindungen in einer co-kultursystem

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung einer Co-Kultur, die aus 2 verschiedenen neuronalen Populationen besteht. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) werden mit Hilfe episomaler Vektoren aus humanen Fibroblasten reprogrammiert. Kolonien von iPSCs können 30 Tage nach Beginn der Fibroblasten-Reprogrammierung beobachtet werden. Pluripotente Kolonien werden manuell gepflückt und in neuronalem Induktionsmedium gezüchtet, um die Differenzierung in neurale Vorläuferzellen (NPCs) zu ermöglichen. iPSCs wandeln sich innerhalb von 1 Woche schnell in Neuroepithelzellen um und behalten die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern, wenn sie bei einer hohen Kulturdichte gehalten werden. Primäre Maus-NPCs werden in Astrozyten differenziert, indem sie 7 Tage lang einem serumhaltigen Medium ausgesetzt werden, und bilden eine Monoschicht, auf der embryonale Tag 18 (E18) kortikale Neuronen der Ratte (transfiziert mit Channelrhodopsin-2 (ChR2)) hinzugefügt werden. Menschliche NPCs, die mit dem fluoreszierenden Protein Tandem-Dimer-Tomate (tdTomato) markiert sind, werden dann am nächsten Tag auf die Astrozyten-/kortikale Neuronenkultur ausgesät und dürfen sich 28 bis 35 Tage lang differenzieren. Wir zeigen, dass dieses System synaptische Verbindungen zwischen iPSC-abgeleiteten Neuronen und kortikalen Neuronen bildet, was sich in einer Zunahme der Häufigkeit synaptischer Ströme bei Photostimulation der kortikalen Neuronen zeigt. Dieses Co-Kultursystem bietet eine neuartige Plattform zur Bewertung der Fähigkeit von iPSC-abgeleiteten Neuronen, synaptische Verbindungen mit anderen neuronalen Populationen herzustellen.

Hier wird ein Protokoll der mehreren Schritte beim Erzeugen einer Co-Kultur, die aus Astrozyten beteiligt beschreiben, kortikale Neuronen und humanen Neuronen dargestellt. Menschen iPSCs wurden durch Neuprogrammierung Fibroblasten mit episomalen erhalten Vektoren 10 und spezifiziert in ein neuronales Linie mit einem Cocktail aus niedermolekularen Inhibitoren, so dass NPCs 11, die bei hoher Dichte (1A) gehalten wurden. Mehrere Schritte sind nötig, um die Co-Kultur zu generieren: Differenzierung von Maus-NPCs in Astrozyten, Beschichtung der Ratte kortikalen Neuronen, ChR2, und Aussaat der menschlichen NPCs mit tdTomato (1B) markiert. An Tag 2 der Differenzierung, können saure Gliafaserprotein (GFAP) + Astrozyten ohne weiteres in unseren Kulturen (1C) zu beachten. Maus NSC wurden für mindestens eine Woche vor dem Beschichten unterscheiden kortikalen Neuronen, ChR2 in die Astrozyten Monoschicht (1D). Nach 3bis 4 Wochen menschlicher NPC Differenzierung wurden tdTomato + -Neuronen in Kulturen (1E) detektiert. Diese Co-Kultursystem ermöglicht die konsistente Erfassung der postsynaptischen Ströme von einzelnen iPSC abgeleiteten Neuronen in Reaktion auf Lichtstimulation (2A). Wenn sie durch Licht angeregt wurden Aktionspotentiale in kortikalen Neuronen, ChR2 (2B) erzeugt wird. iPSC abgeleiteten Neuronen auch erregbaren (2C), welche erhöhte neuronaler Aktivität als die Amplitude der depolarisierenden Stromimpulse erhöht wurde (2D). Damit diese Zellen reife neuronale Eigenschaften. In der Abwesenheit von Licht, empfangen iPSC abgeleiteten Neurone spontan synaptischen Eingaben (2E). Diese inneren postsynaptischen Ströme wurden überwiegend von AMPA-Rezeptoren vermittelt, da Ströme durch GABA-Rezeptoren würde nach außen und NMDA-Rezeptoren tragen keine aktuellen eint die Haltepotential von -70 mV. Mindestens einige dieser Eingänge den von präsynaptische kortikale Neuronen, ChR2, weil Lichtstimulation der Frequenz des postsynaptischen Ströme (2E) stark erhöht. Der Zeitverlauf der Erhöhung der synaptischen Eingang in 2F dargestellt: Photo der kortikalen Neuronen wurde während des 30 s langen Lichtblitz aufrechterhalten. Während die Frequenz der PSCs wurde erhöht, wenn ChR2-exprimierende Neurone wurden photostimulierte (Figur 2G), war ihre Amplitude unbeeinflusst (Figur 2H). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die iPS-abgeleiteten Neuronen zeigte reife neuronale Eigenschaften und könnte synaptischen Verbindungen mit präsynaptischen Neurone zu bilden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung zur Erzeugung KokulturSystem. (A) Timeline zur Umprogrammierung menschlichen Fibroblasten in iPS-Zellen und neurale Induktion an NPCs. (B) Zeitleiste für die terminale Differenzierung der menschlichen NPCs zu reifen Neuronen auf kortikalen Neuronen und Astrozyten-Kulturen. (C) Maus NPCs schnell in GFAP unterscheiden + Astrozyten nach 2 Tagen in vitro. (D) nach einer Woche kortikalen Neuronen, ChR2 wurden auf GFAP + Astrozyten bei 4 bis 5 Wochen nach der Differenzierung menschlicher NSC plattiert. (E), wurden elektrophysiologische Aufzeichnungen auf tdTomato + Neuronen durchgeführt. Maßstabsbalken entspricht 100 &amp; mgr; m. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: optogenetische Analyse der funktionalen synaptischer Verbindungen. (A) iPS-abgeleiteten Zellen mit tdTomato (rot) markiert waren mit kortikalen Neuronen, co-kultiviert das lichtaktivierteKanal, ChR2 (grün). Aufnahmen aus iPS-abgeleiteten Neuronen zeigte postsynaptischen Strom (PSC) Antworten, die entweder von den kortikalen Neuronen oder andere iPSC abgeleiteten Neuronen kommen könnte. (B) Beleuchtung (blauer Balken) rief eine Reihe von Aktionspotentialen in kortikalen Neuronen, ChR2. ( C) iPS-abgeleiteten Zellen sind durch Strominjektion hervorgerufen. (D) Brenn vs Stromkurve von iPS-Zellen abgeleitet. (E) Photostimulation der ChR2-exprimierenden kortikalen Neuronen (blauer Balken) erhöht die Frequenz der PSCs in iPS-abgeleiteten Neuronen . (F) den zeitlichen Verlauf der Zunahme der PSC Frequenz durch Ausleuchtung erzeugt. Blaue Balken zeigt die Zeit der Photostimulation. (G, H) Während PSC Frequenz wurde durch Photo (G) erhöht wird, PSC Amplitude unverändert war (H). * Zeigt Ihnen, p &lt;0,05 im Vergleich zu mit Student-t-Test zu kontrollieren.

Ein Protokoll zur Generierung eines Co-Kultursystems, bestehend aus Neuronen, die von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abstammen, primären kortikalen Neuronen und Astrozyten wird beschrieben. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht den Nachweis der Bildung von synaptischen Kontakten und Schaltkreisen zwischen neuen, iPSC-abgeleiteten Neuronen und bereits vorhandenen kortikalen Neuronen, die Channelrhodopsin-2 exprimieren.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein Kokultursystem zu etablieren, um die Fähigkeit von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Neuronen zu untersuchen, funktionelle Verbindungen mithilfe eines genetischen Ansatzes aufzubauen, der auf der Lichtstimulation kultivierter Neuronen über Channelrhodopsin-2 oder CR2 basiert. Dies wird erreicht, indem primäre murine neuronale Vorläuferzellen (NPCs) isoliert und zu Astrozyten differenziert werden. Anschließend werden primäre kortikale Neuronen der Ratte mit CH R two transfiziert und auf die Astrozytenschicht aufgebracht, die als bestehende neuronale Population dient.Anschließend werden humane NPCs, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder IPSC-Kulturen gewonnen wurden, mit dem Synapsin-eins-2D-Tomato-Virus transduziert, anschließend auf die Astrozyten-Neuronen-Kultur aufgesetzt und zur Differenzierung angeregt, wodurch synaptische Verbindungen entstehen. Die Ergebnisse zeigen, dass die aus IPSCs stammenden Neuronen synaptische Verbindungen mit kortikalen Rattenneuronen eingehen, basierend auf elektrophysiologischen Aufzeichnungen postsynaptischer Ströme in den aus IPSCs abgeleiteten Neuronen nach genetischer Lichtstimulation der CHR2-exprimierenden kortikalen Neuronen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Kokultur von lediglich Astrozyten mit humanen, aus IPSCs stammenden Neuronen, liegt darin, dass die Reifungszeit dieser humanen Neuronen kürzer ist.Der Grund hierfür ist, dass das Vorhandensein primärer Neuronen die Reifung dieser humanen Neuronen beschleunigen kann. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Uni Chin, eine Doktorandin aus meinem Labor, sowie durch Y aus dem Labor von George Augustine. Nach der Gewinnung embryonaler Rattenhirne und der Isolierung des kortikalen Gewebes gemäß dem Textprotokoll wird das kortikale Gewebe in eine Schale mit vorgewärmter kortikaler Gewebe-Digestionslösung überführt. Das kortikale Gewebe so fein wie möglich zerkleinern, bevor es 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Nach der Inkubation das kortikale Gewebe in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und das Gewebe mithilfe einer serologischen Pipette so lange dissoziieren, bis eine homogene Lösung ohne Gewebestücke entsteht.Lassen Sie die Gewebelösung durch einen Zellfilter mit 70 Mikron, um verbleibende Gewebeklumpen zu entfernen. Portionieren Sie drei Milliliter der Lösung in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Geben Sie 800 Mikroliter 7,5 % BSA in 1× PBS langsam in das untere Ende jedes Röhrchens, sodass sich eine Schicht unterhalb der Gewebeschicht bildet. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 200 × g. Anschließend entfernen Sie den Überstand, indem Sie vorsichtig an der Grenzfläche der beiden Schichten absaugen. Vermeiden Sie es, das Zellpellet am Boden des Röhrchens aufzuwirbeln.Nachdem ein Milliliter Primärneuronen-Medium verwendet wurde, um jede Zellprobe erneut in Suspension zu bringen, werden alle Proben in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vereinigt. Anschließend wird mit einem Hämozytometer die Zelldichte bestimmt und 6 Millionen Ratten-Kortikalneuronen bei 200 Gs für fünf Minuten zentrifugiert; danach wird das Überstand entfernt.Für die Elektroporation werden mindestens 6 Millionen kortikale Neuronen benötigt. Um die Bildung eines neuronalen Netzwerks durch überlebende Neuronen sicherzustellen, 100 Mikroliter Elektroporationslösung zum Zellpellet geben und vorsichtig resuspendieren. Anschließend 100 Mikroliter der Zellsuspension mit sechs Mikrogramm CR zwei-Plasmid vermischen und in einen zertifizierten Vektor überführen.Wählen Sie das geeignete Programm für die Elektroporation gemäß den Herstelleranweisungen aus und wenden Sie es an. Nach der Elektroporation fügen Sie 500 Mikroliter MEM dem Vial hinzu. Überführen Sie die Zellen in 11,5 Milliliter Primärneuronenmedium und resuspendieren Sie sie vorsichtig.Anschießend 500 Mikroliter in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte hinzufügen, die Mausastrozyten enthält. Die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren. Nach der Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen oder IPCs die Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll zu einer Kultur menschlicher neuraler Vorläuferzellen oder NPCs differenzieren und kultivieren.In diesem Beispiel werden die NPCs mithilfe des lentiviralen Vektors Synapsin an einem Tag nach der Zugabe primärer Neuronen zu einer Astrozytenkultur mit TD-Tomato markiert. Spülen Sie humane NPCs einmal mit 1× PBS, geben Sie dann eine Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei 30 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass sich alle Zellen abgelöst haben.Anschließend überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das die doppelte Menge an D-M-E-M-F 12 enthält, und zentrifugieren bei 200 ×g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie neuronales Differenzierungsmedium, um das Pellet vorsichtig in Einzelzellen aufzuschwemmen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Als Nächstes saugt man vorsichtig das Medium aus der Platte mit Astrozyten-Kortexneuronen-Kulturen ab. Die humanen NPCs mit 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter pro Vertiefung in neuronaler Differenzierungs-Medium. Inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5%CO2 und das Medium alle zwei bis drei Tage für mindestens 28 Tage erneuern.Um zu überprüfen, ob humane IPCs wie reife Neuronen funktionieren, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einer 60x-Wasserimmersionslinse, um aus humanen IPCs differenzierte Zellen zu finden. Visualisieren Sie dazu TD-Tomato. Ziehen Sie eine Aufnahmepipette auf einen Widerstand von vier bis sechs Ohm und perfundieren Sie.Die Zellen bei Raumtemperatur in einer äußeren Lösung, die kontinuierlich mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durchblubbert wird. Verwenden Sie eine innere Lösung, um die Aufzeichnungsmikropipette zu füllen, führen Sie eine Patch-Clamp-Aufzeichnung an einer TD-Tomato-positiven Zelle im Ganzzellmodus durch und registrieren Sie die Aktionspotentialfeuerung als Reaktion auf Strominjektion im Stromklammertyp. Um zu bestätigen, dass das Aktionspotential kortikaler Zellen, die CHR2 exprimieren, zuverlässig durch Lichtstimulation hervorgerufen wird.Zunächst kortikale Zellen identifizieren, die CR zwei exprimieren, indem das GFP mittels Lichtbeleuchtung mit einer Quecksilberbogenlampe visualisiert wird und ein Anregungsfilter mit einer Wellenlänge von 480 über 40 Nanometer verwendet wird. Überprüfen Sie, ob über eine Stromklampenaufzeichnung im Ganzzellmodus zuverlässig ein Aktionspotential ausgelöst wird. Um eine genetische Stimulation durchzuführen, patchen Sie eine TD-Tomato-positive Zelle im Ganzzellmodus und stellen die Spannungsfixierung bei minus 70 Millivolt ein, wobei die gesamte Feld-Quecksilberlampe und ein Anregungsfilter von 480 über 40 verwendet werden.Stimulieren Sie das gesamte Feld für 30 Sekunden. Registrieren Sie postsynaptische Ströme oder PSCs einer gepatchten Zelle, die durch die Lichtstimulation von CHR2-exprimierenden präsynaptischen kortikalen Neuronen hervorgerufen werden. Legen Sie die Schwelle für Amplitude und Stromfläche manuell bei fünf Pikoampere hier bzw. PICO fest und überprüfen Sie diese Ereignisse manuell, um alle nicht zu PSCs gehörenden Spuren auszuschließen.Wie in diesem Video gezeigt, sind mehrere Schritte erforderlich, um die Kokultur von Neuronen, die aus IPCs stammen, primären kortikalen Neuronen und Astrozyten herzustellen. Dieses Bild zeigt, dass am zweiten Tag der Differenzierung von mausischen NPCs in Astrozyten Astrozyten, die für das gliale fibrilläre saure Protein oder GFAP positiv sind, leicht beobachtet werden können. Mausische NPCs wurden mindestens eine Woche lang differenzieren gelassen, bevor kortikale Neuronen, die CR zwei exprimieren, auf die Astrozyten-Monoschicht aufgebracht wurden, und beide Zelltypen werden in dieser Kokultur durch immunfluoreszenztechnische Färbung von GFAP und CHR zwei identifiziert.Nach drei bis vier Wochen der Differenzierung menschlicher NPCs wurden TD-Tomato-positive Neuronen in den Kulturen detektiert, wie hier gezeigt. Bei Lichtstimulation wurden Aktionspotentiale in kortikalen Neuronen, die CHR zwei IPSC exprimieren, erzeugt. Die differenzierten Neuronen sind ebenfalls erregbar und zeigen eine erhöhte Aktivität.Potentielle Feuertätigkeit, während die Amplitude depolarisierender Strompulse erhöht wurde. In Abwesenheit von Licht erhielten IPSC-abgeleitete Neuronen spontane synaptische Eingänge. Diese einwärts gerichteten postsynaptischen Ströme wurden vorwiegend durch AMPA-Rezeptoren vermittelt.Die photochemische Stimulation der kortikalen Neuronen wurde während des 32. langen Lichtblitzes aufrechterhalten, während die Frequenz der PSCs erhöht war. Bei photochemischer Stimulation von kortikalen Neuronen, die CHR zwei exprimierten, blieb ihre Amplitude unverändert. Nach diesem Verfahren können wir andere Kokultursysteme mit verschiedenen patientenspezifischen Zelltypen verwenden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Wirkung von Wirkstoffkandidaten auf bestimmte Krankheiten von Interesse.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Entwicklungsbiologie

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