Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein Kokultursystem zu etablieren, um die Fähigkeit von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Neuronen zu untersuchen, funktionelle Verbindungen mithilfe eines genetischen Ansatzes aufzubauen, der auf der Lichtstimulation kultivierter Neuronen über Channelrhodopsin-2 oder CR2 basiert. Dies wird erreicht, indem primäre murine neuronale Vorläuferzellen (NPCs) isoliert und zu Astrozyten differenziert werden. Anschließend werden primäre kortikale Neuronen der Ratte mit CH R two transfiziert und auf die Astrozytenschicht aufgebracht, die als bestehende neuronale Population dient.

Anschließend werden humane NPCs, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder IPSC-Kulturen gewonnen wurden, mit dem Synapsin-eins-2D-Tomato-Virus transduziert, anschließend auf die Astrozyten-Neuronen-Kultur aufgesetzt und zur Differenzierung angeregt, wodurch synaptische Verbindungen entstehen. Die Ergebnisse zeigen, dass die aus IPSCs stammenden Neuronen synaptische Verbindungen mit kortikalen Rattenneuronen eingehen, basierend auf elektrophysiologischen Aufzeichnungen postsynaptischer Ströme in den aus IPSCs abgeleiteten Neuronen nach genetischer Lichtstimulation der CHR2-exprimierenden kortikalen Neuronen. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Kokultur von lediglich Astrozyten mit humanen, aus IPSCs stammenden Neuronen, liegt darin, dass die Reifungszeit dieser humanen Neuronen kürzer ist.

Der Grund hierfür ist, dass das Vorhandensein primärer Neuronen die Reifung dieser humanen Neuronen beschleunigen kann. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Uni Chin, eine Doktorandin aus meinem Labor, sowie durch Y aus dem Labor von George Augustine. Nach der Gewinnung embryonaler Rattenhirne und der Isolierung des kortikalen Gewebes gemäß dem Textprotokoll wird das kortikale Gewebe in eine Schale mit vorgewärmter kortikaler Gewebe-Digestionslösung überführt. Das kortikale Gewebe so fein wie möglich zerkleinern, bevor es 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert wird. Nach der Inkubation das kortikale Gewebe in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen und das Gewebe mithilfe einer serologischen Pipette so lange dissoziieren, bis eine homogene Lösung ohne Gewebestücke entsteht.

Lassen Sie die Gewebelösung durch einen Zellfilter mit 70 Mikron, um verbleibende Gewebeklumpen zu entfernen. Portionieren Sie drei Milliliter der Lösung in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Geben Sie 800 Mikroliter 7,5 % BSA in 1× PBS langsam in das untere Ende jedes Röhrchens, sodass sich eine Schicht unterhalb der Gewebeschicht bildet. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 200 × g. Anschließend entfernen Sie den Überstand, indem Sie vorsichtig an der Grenzfläche der beiden Schichten absaugen. Vermeiden Sie es, das Zellpellet am Boden des Röhrchens aufzuwirbeln.

Nachdem ein Milliliter Primärneuronen-Medium verwendet wurde, um jede Zellprobe erneut in Suspension zu bringen, werden alle Proben in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vereinigt. Anschließend wird mit einem Hämozytometer die Zelldichte bestimmt und 6 Millionen Ratten-Kortikalneuronen bei 200 Gs für fünf Minuten zentrifugiert; danach wird das Überstand entfernt.

Für die Elektroporation werden mindestens 6 Millionen kortikale Neuronen benötigt. Um die Bildung eines neuronalen Netzwerks durch überlebende Neuronen sicherzustellen, 100 Mikroliter Elektroporationslösung zum Zellpellet geben und vorsichtig resuspendieren. Anschließend 100 Mikroliter der Zellsuspension mit sechs Mikrogramm CR zwei-Plasmid vermischen und in einen zertifizierten Vektor überführen.

Wählen Sie das geeignete Programm für die Elektroporation gemäß den Herstelleranweisungen aus und wenden Sie es an. Nach der Elektroporation fügen Sie 500 Mikroliter MEM dem Vial hinzu. Überführen Sie die Zellen in 11,5 Milliliter Primärneuronenmedium und resuspendieren Sie sie vorsichtig.

Anschießend 500 Mikroliter in jede Vertiefung einer 24-Loch-Platte hinzufügen, die Mausastrozyten enthält. Die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren. Nach der Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen oder IPCs die Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll zu einer Kultur menschlicher neuraler Vorläuferzellen oder NPCs differenzieren und kultivieren.

In diesem Beispiel werden die NPCs mithilfe des lentiviralen Vektors Synapsin an einem Tag nach der Zugabe primärer Neuronen zu einer Astrozytenkultur mit TD-Tomato markiert. Spülen Sie humane NPCs einmal mit 1× PBS, geben Sie dann eine Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei 30 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass sich alle Zellen abgelöst haben.

Anschließend überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das die doppelte Menge an D-M-E-M-F 12 enthält, und zentrifugieren bei 200 ×g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie neuronales Differenzierungsmedium, um das Pellet vorsichtig in Einzelzellen aufzuschwemmen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.

Als Nächstes saugt man vorsichtig das Medium aus der Platte mit Astrozyten-Kortexneuronen-Kulturen ab. Die humanen NPCs mit 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter pro Vertiefung in neuronaler Differenzierungs-Medium. Inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5%CO2 und das Medium alle zwei bis drei Tage für mindestens 28 Tage erneuern.

Um zu überprüfen, ob humane IPCs wie reife Neuronen funktionieren, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einer 60x-Wasserimmersionslinse, um aus humanen IPCs differenzierte Zellen zu finden. Visualisieren Sie dazu TD-Tomato. Ziehen Sie eine Aufnahmepipette auf einen Widerstand von vier bis sechs Ohm und perfundieren Sie.

Die Zellen bei Raumtemperatur in einer äußeren Lösung, die kontinuierlich mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durchblubbert wird. Verwenden Sie eine innere Lösung, um die Aufzeichnungsmikropipette zu füllen, führen Sie eine Patch-Clamp-Aufzeichnung an einer TD-Tomato-positiven Zelle im Ganzzellmodus durch und registrieren Sie die Aktionspotentialfeuerung als Reaktion auf Strominjektion im Stromklammertyp. Um zu bestätigen, dass das Aktionspotential kortikaler Zellen, die CHR2 exprimieren, zuverlässig durch Lichtstimulation hervorgerufen wird.

Zunächst kortikale Zellen identifizieren, die CR zwei exprimieren, indem das GFP mittels Lichtbeleuchtung mit einer Quecksilberbogenlampe visualisiert wird und ein Anregungsfilter mit einer Wellenlänge von 480 über 40 Nanometer verwendet wird. Überprüfen Sie, ob über eine Stromklampenaufzeichnung im Ganzzellmodus zuverlässig ein Aktionspotential ausgelöst wird. Um eine genetische Stimulation durchzuführen, patchen Sie eine TD-Tomato-positive Zelle im Ganzzellmodus und stellen die Spannungsfixierung bei minus 70 Millivolt ein, wobei die gesamte Feld-Quecksilberlampe und ein Anregungsfilter von 480 über 40 verwendet werden.

Stimulieren Sie das gesamte Feld für 30 Sekunden. Registrieren Sie postsynaptische Ströme oder PSCs einer gepatchten Zelle, die durch die Lichtstimulation von CHR2-exprimierenden präsynaptischen kortikalen Neuronen hervorgerufen werden. Legen Sie die Schwelle für Amplitude und Stromfläche manuell bei fünf Pikoampere hier bzw. PICO fest und überprüfen Sie diese Ereignisse manuell, um alle nicht zu PSCs gehörenden Spuren auszuschließen.

Wie in diesem Video gezeigt, sind mehrere Schritte erforderlich, um die Kokultur von Neuronen, die aus IPCs stammen, primären kortikalen Neuronen und Astrozyten herzustellen. Dieses Bild zeigt, dass am zweiten Tag der Differenzierung von mausischen NPCs in Astrozyten Astrozyten, die für das gliale fibrilläre saure Protein oder GFAP positiv sind, leicht beobachtet werden können. Mausische NPCs wurden mindestens eine Woche lang differenzieren gelassen, bevor kortikale Neuronen, die CR zwei exprimieren, auf die Astrozyten-Monoschicht aufgebracht wurden, und beide Zelltypen werden in dieser Kokultur durch immunfluoreszenztechnische Färbung von GFAP und CHR zwei identifiziert.

Nach drei bis vier Wochen der Differenzierung menschlicher NPCs wurden TD-Tomato-positive Neuronen in den Kulturen detektiert, wie hier gezeigt. Bei Lichtstimulation wurden Aktionspotentiale in kortikalen Neuronen, die CHR zwei IPSC exprimieren, erzeugt. Die differenzierten Neuronen sind ebenfalls erregbar und zeigen eine erhöhte Aktivität.

Potentielle Feuertätigkeit, während die Amplitude depolarisierender Strompulse erhöht wurde. In Abwesenheit von Licht erhielten IPSC-abgeleitete Neuronen spontane synaptische Eingänge. Diese einwärts gerichteten postsynaptischen Ströme wurden vorwiegend durch AMPA-Rezeptoren vermittelt.

Die photochemische Stimulation der kortikalen Neuronen wurde während des 32. langen Lichtblitzes aufrechterhalten, während die Frequenz der PSCs erhöht war. Bei photochemischer Stimulation von kortikalen Neuronen, die CHR zwei exprimierten, blieb ihre Amplitude unverändert. Nach diesem Verfahren können wir andere Kokultursysteme mit verschiedenen patientenspezifischen Zelltypen verwenden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Wirkung von Wirkstoffkandidaten auf bestimmte Krankheiten von Interesse.