Name: Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Lernen Sie die Vermehrung von Influenza A-Virus in bebrüteten Hühnereiern für Virologie und Impfstoffentwicklung. Diese Methode liefert hohe Virustiter für Forschung und weitere Assays.

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Die vorliegende Studie wurde von den NIH Grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.) und dem American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.) unterstützt.

HINWEIS: Allgemeine Hinweise: Führen Sie alle Verfahren, die Manipulation des Ei unter sterilen Bedingungen und steriler Technik sollte entsprechend verwendet werden. Vorreinigen gesamte Ausrüstung mit 70% Ethanol vor dem Gebrauch. Im allgemeinen sollte Influenza Virusinokulation und Ernte in einem BSL-2 Labor durchgeführt werden. Allerdings, wenn dieses Protokoll wird verwendet, um zu verbreiten viel mehr pathogenen Influenzaviren (zB Pandemie und Pre-Pandemiestämme, Stämme, die eine Gefahr für Geflügel und Vieh, hoch pathogenen aviären Influenza-Stämme, die 1918 H1N1-Stamm darstellen), höhere Biosicherheitsstufen und in einigen Fällen werden Biosicherheitsmaßnahmen und Genehmigungen erforderlich. Der lokale Institutional Biosafety Committee sollte alle Forschung mit Influenza-Virus zu genehmigen. 1. Vorbereitung der Eier für Impfung <ol><li> Erhalten Serum pathogenfreien (SPF) frisch befruchteten Hühnerkeimen aus einem geeigneten Anbieter. Typischerweise sind Hühnereier verwendet. Eier sollten unsed sofort nach Ankunft. </li><li> Nach der Ankunft statt Eier in einem befeuchteten Brutkasten mit einem automatischen Ei Turner, Eier regelmäßig zu drehen. Ist ein automatischer Ei Turner nicht verfügbar ist, von Hand drehen Eier mindestens 2-3 mal pro Tag (stellen Sie sicher, Handschuhe zu tragen und halten alles so steril wie möglich). </li><li> Eiern bei 37 ° C und 55-60% Luftfeuchtigkeit für 10-11 Tage. </li></ol> 2. Eierkerzen <ol><li> Verwenden Sie ein Ei candler, um das Ei vor einem hellen Licht in einem dunklen Raum zu untersuchen, um Eier für Unfruchtbarkeit, die durch Durchleuchten nach ca. 7 oder 8 Tagen Inkubation zu überprüfen. <ol><li> Wischen Sie die Eierdurchleuchter mit 70% Ethanol. Handschuhe häufig wechseln und Desinfektion mit 70% Ethanol, um das Risiko einer Kontamination mit Krankheitserregern zu minimieren. </li><li> Entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator und sie in leeren Eierkartons. </li><li> Schalten Sie das Licht in den Raum. </li><li> Halten Sie das große Ende jedes Ei einzeln nacheinander gegen die candler. </li><li> Beobachten Sie das Ei zu determine, wenn es fruchtbar oder unfruchtbar. HINWEIS: Dünne Blutgefäße, die zu einer bohnenförmigen Embryos muss deutlich sichtbar sein. Unbefruchteten Eiern wird als kleiner Blutfleck mit einem sichtbaren Eigelb angezeigt. </li></ol></li><li> Werfen Sie unbefruchtete Eier, die sind, und gibt die lebensfähige Eier in den Inkubator. Lassen Sie keine Eier außerhalb des Inkubators für mehr als 30 min. Wenn der Status eines Eies nicht bestätigt werden kann, markieren Sie ihn und später beobachten sie. </li></ol> 3. Herstellung von Virus Inoculum <ol><li> Verdünne Influenzavirusbestand zu etwa 3. Oktober-4. Oktober pfu / ml in sterilem PBS, enthaltend 10 mM HEPES (pH 7,4). Critical Schritt: Verdünnen Sie die Virusstamm unmittelbar vor der Anwendung und halten die verdünnten Virus auf dem Eis die ganze Zeit. </li></ol> 4. Influenza Virus Impfung über die Allantois Routen <ol><li> Am Tag der Virusinokulation (Tag 10 oder 11), Kerze die Eier wieder und beseitigen tote Embryonen. Unterscheiden Sie Live-EmbryonenSuche nach Bewegung in das Ei. </li><li> Entfernen Sie drei Eier aus dem Inkubator, und ordnen Sie die Eier in einem separaten Halter mit dem Luftsack auf. </li><li> Markieren Sie den Luftraum der Eier mit einem wasserfesten Stift. </li><li> Oberhalb des Luftraums mit 70% Ethanol waschen die Eierschale. </li><li> Die Eier mit dem Luftraum in einem Eierkarton und in einen biologischen Sicherheit Haube (BSL-2). </li><li> Verwenden Sie eine sterile 18G Nadel ein kleines Loch in der Schale auf den Luftsack jedes Ei zu stanzen. Achten Sie darauf, um die Nadel zu tief einfügen, um zu vermeiden, stech den Embryo oder Eigelb. </li><li> Erstellung des verdünnten Influenza-Virus in eine sterile 1 ml-Spritze und fügen Sie eine 22G-Nadel. </li><li> Die Spritze mit Nadel vorsichtig voran in einem Winkel von 45 ° in die Allantoishöhle. </li><li> Injizieren 0,2 ml der verdünnten Influenza-Virus. </li><li> Wiederholen Sie die Injektion mit den anderen zwei Eier, und dann werfen Sie die Spritze und Nadel. </li><li> Dichten Sie das Loch mit einem Tropfen Klebstoff aus einer Klebepistole (oder geschmolzene Paraffinwachs). Be Achten Sie darauf, dass Kleber nicht im Inneren des Eis lecken. </li><li> Legen Sie die Eier in die Brutkasten mit der Luftraum deutete nach oben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,2 bis 4,12, bis alle Eier wurden geimpft. </li></ol> 5. Inkubationszeit <ol><li> Die infizierten Eiern Inkubieren ohne Drehen bei 37 ° C und ca. 60% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Wählen optimale Inkubationszeit in Abhängigkeit von der Influenza-Virus-Typ. Inkubieren Influenza A 48 h; inkubieren Influenza B und C für 72 Stunden. </li></ol> 6. Influenza Virus-Ernte <ol><li> Nach Inkubationszeit Chill die Eier bei 4 ° C für mindestens 4 Stunden (oder O / N), um den Embryo zu töten und verengen die Blutgefäße, um das Risiko einer Verunreinigung des infizierten Allantoisflüssigkeit mit Blut zu verringern. Tun dies, um die roten Blutzellen absorbieren das Virus, was die Ausbeute verringert verhindern. Alternativ Chill Eier für 30 min bei -20 ° C; aber dies erhöht die Gefahr einer Kontamination des Blutes. </li><li> Nachdem die Eier ausreichend gekühlt wurde, übertragen Sie die Eier auf einem Bio-Sicherheitshaube. Legen Sie das Ei in eine feste Halterung mit der Luftsack nach oben zeigt. Reinigen Sie das Ei Oberfläche mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden einer sterilen Schere, um die Eierschale über dem Luftsack zu öffnen. Entfernen Sie die Hülle um den Luftsack, während man aufpassen, nicht die Chorioallantoismembran zerstören. </li><li> Öffnen Sie die Chorioallantoismembran mit sterilem stumpfen Pinzette. Vorsichtig zur Seite legen den Embryo und der Dottersack mit einem kleinen Spatel oder Löffel. Darauf achten, dass das Eigelb bersten. </li><li> Mit einer 1 ml-Eppendorf-Pipette vorsichtig sammeln die Allantoisflüssigkeit. Wenn nötig, kippen Sie das Ei ein wenig zur Seite, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu sammeln. </li><li> Kombinieren Sie die Allantoisflüssigkeit aller Eier in einen 50-ml-Kunststoff konischen Rohr. Während der Virusernte halten Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten. Ein Ei Ausbeuten 5-10 ml eines leicht gelblichen Flüssigkeit. </li><li> Drehe das virushaltige Allantoisflüssigkeit bei 1.000 × g für 10 min bei 46; C bis Trümmer zu pelletieren. Übertragen Sie die klare Flüssigkeit in eine neue 50-ml-Röhrchen auf Eis gehalten. Entsorgen Sie Eier in eine BSL-2 Abfallbehälter. </li></ol> 7. Lagerung <ol><li> Die geklärt Allantoisflüssigkeit (zB 50, 100 oder 500 ul Aliquote) sofort aliquotiert und Snap-freeze in flüssigem Stickstoff. Übertragen gefrorenen Virusstocks bis -80 ° C Gefrierschrank für langfristige Lagerung. </li></ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Influenza verursacht einen großen globalen Krankheitslast, und die Arbeit geht weiter in das Verständnis der Pathogenese der Lungenschädigung 7. Erleichtert die Forschung in dieser tödlichen Krankheit, wurden verschiedene Verfahren entwickelt, um den Influenzavirus 6 ausbreiten. Hier beschreiben wir eine Technik, um Influenza-Virus in Hühnereiern produziert. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es in hohem Maße reproduzierbar ist und führt zu großen Mengen von hohem Titer Influenzavirusstämme, d...

Influenza A weiterhin eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit sein. Es ist eine potenziell verheerenden Erkrankung der Atemwege mit einem großen globalen Belastung verursacht bis zu 500.000 Todesfälle weltweit pro Jahr 1. Influenza-Viren sind in der Familie Orthomyxoviridae und führen 8 Minus-Sense einzelsträngige RNA in ihrem Genom 1,2. Die hohe Veränderlichkeit (dh antigene &quot;Drift&quot;) des Virusgenoms verhindert Langzeitimmunität. Außerdem ist Influenza zunehmend resistent gegen antivirale Medikamente 3. Das H1N1 2009-Grippe-Pandemie markiert alle herausfordernden Fragen mit dem Influenzaerkrankung (Pandemie-Stamm, anti-virale Resistenz, verzögert Impfstoffproduktion) verbunden. Die Impfstoff-Formulierung wird jährlich von der Weltgesundheitsorganisation für die wahrscheinlichste pathogenen Influenza-Stämme (je eine für H1N1, H3N2 und Influenza B) 4 bestimmt. Da diese Methode beruht auf Annahmen basierte Influenza-Stamms, pathogenen Stämmen werden gelegentlich falsch identifiziert und die Wirksamkeit des Impfstoffes sinkt dramatisch. Darüber hinaus kann das Auftreten von neuen Influenza-Stämme diese präventive Programme verursachen Pandemien 2 zu umgehen. Die Schaffung eines universellen Influenza-Impfstoff ist schwer 5. Daher müssen Erforschung Verständnis der Pathogenese der Lungenschädigung weiter. Um die Anlage der Laborforschung wurden verschiedene Verfahren für die virale Isolation und Vermehrung 6 entwickelt. Menschlichen Influenza-Viren können in einer Vielzahl von Säugetierzellsubstraten verstärkt werden. Jedoch werden die Erzeugung hoher Titer von Viren in großen Mengen am besten in embryonierten Eiern erreicht. Das folgende Protokoll beschreibt eine Technik für die Influenza A-Virusvermehrung und Speicherung von vorhandenen Virusstocks.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Serum pathogenfrei (SPF) befruchtete Hühnereier&nbsp;</td><td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator für befeuchtete Eier</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modell 2100</td><td></td></tr><tr><td>automatischer Eierwender</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modell 3200</td><td></td></tr><tr><td>Eierkerzenmaschine</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Modell 3300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18G Nadel</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20G / 22G Nadel</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol>99,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>mit einer Wasserklebepistole auf 70% verdünnt</td></tr><tr><td>"Ad tech Hi Temp Projekt Pro"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Modell 1105</td><td></td></tr><tr><td>Kleber "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>MDCK-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Gewaschene gepoolte rote Blutkörperchen aus dem Truthahn, 10%</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

influenza virus vermehrung in embryonierten hühnereiern

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza-Infektion ist mit rund 36.000 Tote und mehr als 200.000 Krankenhauseinweisungen pro Jahr in den Vereinigten Staaten verbunden. Die kontinuierliche Entstehung neuer Influenza-Virus-Stämme aufgrund von Mutation und Wiederzusammenstellung erschwert die Kontrolle des Virus und die ständige Entwicklung neuer Arzneimittel und Impfstoffe. Die Laboruntersuchung von Influenza erfordert ein zuverlässiges und kostengünstiges Verfahren für die Vermehrung des Virus. Hier wird ein umfassendes Protokoll für Influenza-A-Virusvermehrung in fruchtbare Hühnereiern, die konsequent liefert hohen Titer Virusbeständen. 11 Tage - Kurz gesagt, werden Serum pathogenfreien (SPF) befruchtete Hühnereier bei 37 ° C und 55-60% Luftfeuchtigkeit für 10 inkubiert. In diesem Zeitraum können die Entwicklung des Embryos einfach mit ein Ei candler überwacht werden. Virusinokulation erfolgt durch Injektion von Virusstocks in die Allantois-Höhle unter Verwendung einer Nadel durchgeführt. Nach 2 Tagen Inkubation bei 37 ° C, sind die Eiergekühlt für mindestens 4 Stunden bei 4 ° C. Die Eischale oberhalb der Luftsack und die Chorioallantoismembran werden dann vorsichtig geöffnet und die Allantoisflüssigkeit, die das Virus geerntet. Das Fluid wird von Bruchstücken durch Zentrifugation geklärt, in Aliquote aufgeteilt und bis -80 ° C zur Langzeitlagerung transferiert. Die große Menge (5-10 ml des virushaltigen Fluids pro Ei) und hoher Virustiter in der Regel mit diesem Protokoll erreicht hat die Verwendung von Eiern für die Viruspräparation unserer günstiges Verfahren zur in vitro-Studien, die größere Mengen, insbesondere des Virus in denen hohe Dosierungen des gleichen Virusstock erforderlich.

Mehrere Verfahren sind entwickelt worden, um Influenza-Virus zu titrieren. Eine Überlegung bei der Auswahl eines geeigneten Verfahrens ist, dass einige zu bestimmen Gesamtpartikel unabhängig von Lebensfähigkeit (zB Hämagglutinin-Assay), während andere auf die Infektiosität der Basis, die lebensfähigen Virionen bewertet wird (zB Plaque-Test) 6. Hier wurde der Virustiter von Allantoisflüssigkeit aus Hühnereiern mit einer Maus-adaptierten Influenzavirus (A / PR / 8/34) beimpft gesammelt durch P...

Fruchtbare Hühnereier werden häufig verwendet, um große Mengen an humanen Influenza-A-Viren zu produzieren, da sie ein bequemes und kostengünstiges System zum Nachweis hoher Viruserträge bieten.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, große Mengen eines Influenzavirus mit hoher Titerkonzentration in einem kosteneffizienten System herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst serumpathogenfreie, frisch befruchtete Hühnereier beschafft werden. Im zweiten Schritt werden die Eier über die Allantoiswurzel mit Influenzavirus infiziert.Das Alan-Toic-Fluid, das das Virus enthält, wird anschließend 48 Stunden lang gesammelt, und das Virus wird in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren. Abschließend können Plaque- und Hämaggglutinations-Assays durchgeführt werden, um den Einfluss der Virus-Titer des gesammelten Alan-Toic-Fluids zu bestimmen. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Ernteschritte sehr emp empfindlich sind und sorgfältiges Handling der Eier sowie fundierte Kenntnisse ihrer Anatomie erfordern.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, beschaffen Sie pathogenfreie, frisch befruchtete Hühnereier von einem geeigneten Anbieter. Stellen Sie die Eier unmittelbar nach Erhalt in einen befeuchteten Brutkasten mit automatischem Eiroller, um die Eier regelmäßig bei 37 Grad Celsius und einer Luftfeuchtigkeit von 55 bis 60 % für 10 bis 11 Tage zu inkubieren. Nach sieben bis acht Tagen der Inkubation, tragen Sie Handschuhe, die mit 70 % Ethanol desinfiziert wurden.Wischen Sie einen Ei-Kontrollleuchter mit Ethanol ab und übertragen Sie die Eier aus dem Inkubator in leere Eierschachteln. Schalten Sie dann das Licht aus und halten Sie nacheinander das größere Ende der Eier gegen den Kontrollleuchter. Ist ein Ei befruchtet, sollten dünne Blutgefäße, die zu einem bohnenförmigen Embryo führen, deutlich sichtbar sein.Wenn das Ei nicht befruchtet ist, zeigt sich ein kleiner Blutfleck mit sichtbarem Eigelb. Entsorgen Sie dann die nicht befruchteten Eier und geben Sie die lebensfähigen Eier zurück in den Inkubator. Wenn der Zustand eines Eis nicht bestätigt werden kann, kennzeichnen Sie es zur späteren Beobachtung am Tag 10 oder 11 nach der Befruchtung; verdünnen Sie unmittelbar vor der Verwendung einen Influenza-A-Virus-Stamm auf 1 × 10³ bis 10⁴ PFU pro Milliliter in sterilem PBS, ergänzt mit Hippies, und stellen Sie es auf Eis.Beleuchten Sie dann jedes Ei erneut und entfernen Sie alle toten, bewegungslosen Embryonen. Entnehmen Sie anschließend drei Eier aus dem Inkubator und platzieren Sie sie in einem separaten Halter. Mit den Luftkammern nach oben markieren Sie den Luftkammerbereich der Eier mit einem Permanentstift.Reinigen Sie anschließend den Bereich über dem Luftkammer mit 70 % Ethanol und überführen Sie die Eier mit der Luftkammer nach oben in eine Eierschachtel innerhalb einer Sicherheitswerkbank der Schutzstufe zwei. Verwenden Sie nun eine sterile Kanüle mit 18 Gauge, um ein kleines Loch in die Schale über der Luftkammer jedes Eis zu bohren. Achten Sie darauf, die Kanüle nicht zu tief einzuführen, um den Embryo oder das Eigelb nicht zu verletzen.Ziehen Sie dann das verdünnte Influenzavirus in eine sterile Ein-Milliliter-Spritze auf. Befestigen Sie eine 22-Gauge-Nadel und führen Sie die Nadel vorsichtig in einem Winkel von 45 Grad in die Allantoishöhle des ersten Eis ein. Injizieren Sie 0,2 Milliliter des verdünnten Virus in das Ei, und nachdem Sie die anderen beiden Eier injiziert haben, entsorgen Sie die Spritze und die Nadel, und verschließen Sie jedes Loch mit einem Tropfen Klebstoff aus einer Heißklebepistole.Stellen Sie sicher, dass der Klebstoff nicht ins Innere des Eis gelangt, und legen Sie die Eier anschließend zurück in den Inkubator. Nachdem alle Eier infiziert wurden, inkubieren Sie die bebrüteten Eier bei 37 Grad Celsius und 60 % Luftfeuchtigkeit ohne Drehen für die optimale Inkubationszeit. Abhängig vom Influenzavirus-Typ.Am Ende der Inkubationszeit die Eier mindestens vier Stunden lang bei vier Grad Celsius abkühlen, um das Embryo abzutöten und die Blutgefäße zusammenzuziehen. Sobald die Eier ausreichend abgekühlt sind, überführen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank und auf einen festen Halter und reinigen Sie die Eioberflächen mit 70 % Ethanol.Öffnen Sie dann mit sterilen Scheren die Eierschale oberhalb des Luftkissens des ersten Eis. Entfernen Sie die Schale um den Luftkissenbereich herum, wobei darauf zu achten ist, das Chorioallantois-Membran nicht zu beschädigen.Öffnen Sie dann mit sterilen stumpfen Pinzetten die Chorionhaut und schieben Sie vorsichtig mit einem kleinen Spatel oder Löffelchen den Embryo und den Dottersack beiseite, wobei darauf zu achten ist, den Dottersack nicht zu verletzen. Danach sammeln Sie mit einer Einwegpipette mit einem Volumen von einem Milliliter unter leichter Neigung des Eies zur Seite so viel wie nötig die Alan Toic-Flüssigkeit vorsichtig auf. Jedes Ei sollte zwischen fünf und 10 Milliliter leicht gelblich gefärbte Flüssigkeit liefern, sobald es geerntet wird.Vereinigen Sie die alan toic-Flüssigkeit in 50-Milliliter-Kunststoffkegelflaschen auf Eis. Sobald die gesamte Flüssigkeit gesammelt ist, zentrifugieren Sie das Virus und überführen Sie die klare Flüssigkeit in ein neues 50-Milliliter-Gefäß auf Eis. Entsorgen Sie abschließend die Eier in einem BSL-2-Abfallbehälter und führen Sie unverzüglich Eloqua zur geklärten LAN-toic-Flüssigkeit durch.Dann schnell einfrieren, den Virus in flüssigem Stickstoff einfrieren und die gefrorenen Stiele in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius stellen. Für die Langzeitlagerung verursacht eine Influenza-Virusinfektion eine zytopathische Wirkung, die sich in runden Zonen von durchlöcherten Zellen oder Plaques äußert, die sich auf einer Zellmonolayer bilden. In diesem Experiment wurden die Plaques durch Anfärben der Zellen mit Kristallviolett sichtbar gemacht, und in der Vertiefung mit der Verdünnung des Virus von 1 × 10⁻¹² wurden 65 Plaques gezählt, da 500 µL verdünnter viraler Stamm auf den Zellen kultiviert wurden.In diesem Experiment betrug die endgültige Titerkonzentration 1,3 mal 10 hoch 14 PFU pro Milliliter. Der Hämagglutinationsassay ist eine Methode zur Bestimmung der Influenzavirus-Titerkonzentration, die auf der Fähigkeit des Virus beruht, an die Oberfläche von roten Blutkörperchen zu binden. Wie beobachtet, agglutinieren die viralen Suspensionen die roten Blutkörperchen, wodurch verhindert wird, dass sich die roten Blutkörperchen aus der Suspension absetzen.Ein eindeutig negatives Ergebnis wurde bei einer Verdünnung des Virus um Faktor zwei hoch minus 10 in 50 Mikrolitern beobachtet. Daher beträgt die endgültige Titerkonzentration 2,1 × 10⁴ HAU pro Milliliter. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Influenzaviren vermehrt, indem man Hühnereier impft und die enthaltende Viruslösung aus dem Allantoisfluid gewinnt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Eine gleichzeitige Infektion mit Influenza A-Virus ist einer der Faktoren bei der Induktion von invasiven Pneumokokken-Erkrankung bei asymptomatischen...

Mit Bioluminescent Imaging, um Synergie von Untersuchen Streptococcus pneumoniae Und Influenza A Virus in Infant Mäuse

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung von Escape-Varianten von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern des Influenzavirus. Antikörper-neutralisierte Virussuspension wird in embryonisierte Hühnereier injiziert, um Fluchtvarianten selektiv zu vermehren. Dies führt zu einer Viruspopulation, die überwiegend aus Escape-Varianten besteht, was durch einen Hämagglutinationsassay bestätigt wurde.

Entstehung von Influenzavirus-Escape-Varianten gegen neutralisierende Antikörper

Das Video zeigt eine Methode zur Herstellung von kälteadaptierten rekombinanten Influenzaviren. Dabei werden menschliche Zellen mit bidirektionalen Plasmiden transfiziert, gefolgt von einer Inkubation bei niedrigeren Temperaturen, um Viren zu erhalten, die für die Impfstoffproduktion geeignet sind und sich durch eine verminderte Replikation unter wärmeren Bedingungen auszeichnen.

Erzeugung rekombinanter abgeschwächter Lebend-Influenzaviren für Impfstoffe

Newcastle Disease Virus (NDV) wurde ausgiebig in den letzten Jahren, um neue Vektoren für Impfung und Therapie zu entwickeln, unter anderem untersucht. Diese Studien wurden durch Techniken, um rekombinante Virus aus cDNA zu retten, wie die, die wir hier beschreiben, möglich.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Systemische und lokalisierte Zebrafisch-Infektionsmodelle für humane Influenza-A-Viren werden demonstriert. Unter Verwendung eines systemischen Infektionsmodells kann der Zebrafisch zum Screening von antiviralen Medikamenten verwendet werden. Unter Verwendung eines lokalisierten Infektionsmodells kann der Zebrafisch zur Charakterisierung der Immunzellreaktionen des Wirts verwendet werden.

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Hier boten wir eine Methode zur Erreichung einer stabilen Transfektion von Eimeria-Parasiten durch Nukleofektive Sporozoite oder Merozoitder der zweiten Generation. Genetisch veränderte eimerische Parasiten, die heterologe antigene Gene exdrücken, könnten als Impfstoff-Liefervehikel verwendet werden.

Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten

Das übergeordnete Ziel dieses Papiers ist es, zu beschreiben, wie bei der intrazellulären Injektion von exogenen Materialien in Hühnerembryonen durchgeführt werden kann. Dieser Ansatz ist sehr nützlich, um die Entwicklungsbiologie von Hühnerembryonen zu untersuchen.

In Ovo Intravaskuläre Injektion in Hühnerembryonen

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Quantifizierung des rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer zur Verfügung. Dieses Protokoll ergibt durchweg &gt; 6 × 109 plaquebildende Einheiten/ml und liefert Virusmengen, die für In-vivo-Tierversuche geeignet sind. Zusätzliche Qualitätskontrollassays zur Gewährleistung der Sicherheit in vivo werden beschrieben.

Herstellung des rekombinanten Newcastle-Disease-Virus mit hohem Titer aus Allantoic Fluid

Diese Methode zeigt den Hühnerembryo als einfaches und kostengünstiges in vivo Modell, um den bakteriellen Erreger L. monocytogenes aus einem lebensfähigen, aber nicht kultivierbaren (VBNC) Zustand wiederzubeleben und mit potenziellen weiteren Anwendungen für das Verständnis der bakteriellen Ruhemechanismen.

Hühnerembryo als In-vivo-Modell zur Wiederbelebung lebensfähiger, aber nicht kultivierbarer Krankheitserreger

Lernen Sie die Vermehrung von Influenza A-Virus in bebrüteten Hühnereiern für Virologie und Impfstoffentwicklung. Diese Methode liefert hohe Virustiter für Forschung und weitere Assays.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

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