Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, große Mengen eines Influenzavirus mit hohem Titer in einem kostengünstigen System herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst serimerfreie, frisch befruchtete Hühnereier im Serum gewonnen werden. Im zweiten Schritt werden die Eier über die Alan-Toic-Wurzel mit dem Influenzavirus infiziert.

48 Stunden lang wird dann die Alan Toic-Flüssigkeit, die das Virus enthält, geerntet und das Virus in flüssigem Stickstoff eingefroren. Letztendlich können Plaque- und Hämagglutinin-Assays durchgeführt werden, um den Einfluss des Virustiters des gesammelten Alan Toic zu bestimmen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Ernteschritte sehr sensibel sind und einen sorgfältigen Umgang mit den Eiern und eine gute Kenntnis ihrer Anatomie erfordern.

Vor Beginn des Eingriffs erhalten Sie serumpathogenfreie, frisch befruchtete Davieneier von einem geeigneten Anbieter. Legen Sie die Eier sofort nach der Ankunft in einen befeuchteten Eierbrutkasten mit automatischem Eierwender, um die Eier 10 bis 11 Tage lang regelmäßig bei 37 Grad Celsius und 55 bis 60 % Luftfeuchtigkeit zu drehen. Nach sieben bis acht Tagen Inkubation tragen Sie mit 70 % Ethanol desinfizierte Handschuhe.

Wischen Sie eine Eierkerze mit dem Ethanol ab und geben Sie die Eier aus dem Brutkasten in die leeren Eierkartons. Schalten Sie dann das Licht aus und halten Sie das große Ende der Eier nacheinander gegen den Krebs. Wenn eine Eizelle befruchtet ist, sollten dünne Blutgefäße, die zu einem bohnenförmigen Embryo führen, deutlich sichtbar sein.

Wenn die Eizelle unbefruchtet ist, wird ein kleiner Blutfleck mit einem sichtbaren Eigelb beobachtet. Entsorgen Sie dann die unbefruchteten Eizellen und legen Sie die lebensfähigen Eizellen wieder in den Brutkasten. Wenn der Status eines Eies nicht bestätigt werden kann, markieren Sie es für eine spätere Beobachtung am Tag 10 oder 11 nach der Befruchtung und verdünnen Sie unmittelbar vor der Verwendung einen Influenza-A-Virusbestand auf eins mal 10 bis zum dritten bis 10 bis zum vierten PFU pro Milliliter in sterilem PBS, das mit Hippies ergänzt wird, und legen Sie es auf Eis.

Zünden Sie dann jedes Ei erneut an und beseitigen Sie alle toten, unbeweglichen Embryonen. Nehmen Sie dann drei Eier aus dem Brutkasten und ordnen Sie sie in einer separaten Halterung an. Mit den Luftsäcken nach oben den Luftraum der Eier mit einem Permanentmarker markieren.

Waschen Sie dann den Bereich über dem Luftraum mit 70% Ethanol und übertragen Sie den Luftraum der Eier in einen Eierkarton in einer BSL two Biosicherheitshaube. Stanzen Sie nun mit einer sterilen 18-Gauge-Nadel ein kleines Loch in die Schale über dem Luftsack jedes Eies. Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu tief einzuführen, um ein Stechen des Embryos oder des Eigelbs zu vermeiden.

Ziehen Sie dann das verdünnte Influenzavirus in eine sterile Ein-Milliliter-Spritze. Befestigen Sie eine 22-Gauge-Nadel und schieben Sie die Nadel vorsichtig in einem 45-Grad-Winkel in den Alan-Toic-Hohlraum des ersten Eies. Injizieren Sie 0,2 Milliliter des verdünnten Virus in das Ei und entsorgen Sie nach der Injektion der anderen beiden Eier die Spritze und verschließen Sie jedes Loch mit einem Tropfen Klebstoff aus einer Klebepistole.

Achten Sie darauf, dass der Kleber nicht in das Ei ausläuft, und legen Sie die Eier dann wieder in den Brutkasten. Nachdem alle Eier geimpft wurden, brüten Sie die infizierten Eier bei 37 Grad Celsius und 60 % Luftfeuchtigkeit ohne Wenden aus, um die optimale Inkubationszeit zu erzielen. Abhängig vom Influenzavirustyp.

Am Ende der Inkubationszeit kühlen Sie die Eier mindestens vier Stunden lang bei vier Grad Celsius, um den Embryo abzutöten und die Blutgefäße zu verengen. Wenn die Eier ausreichend gekühlt sind. Füllen Sie sie in eine Biosicherheitshaube und einen festen Halter und reinigen Sie die Eioberflächen mit 70% Ethanol.

Öffnen Sie dann mit einer sterilen Schere die Eierschale über dem Luftsack des ersten Eies. Entfernen Sie die Hülle um den Luftsack. Achten Sie darauf, die Chorio-Alan-Toic-Membran nicht zu beschädigen.

Öffnen Sie dann mit einer sterilen stumpfen Pinzette die Chorio-Alan-Toic-Membran und schieben Sie den Embryo und den Dottersack vorsichtig mit einem kleinen Spatel oder Löffel beiseite, wobei Sie darauf achten, dass das Eigelb nicht aufreißt. Anschließend mit einer Einor-Pipette von einem Milliliter vorsichtig die Alan Toic-Flüssigkeit auffangen und das Ei zur Seite kippen, um so viel Flüssigkeit wie möglich aufzufangen. Jedes Ei sollte bei der Ernte zwischen fünf und 10 Milliliter leicht gelblicher Flüssigkeit ergeben.

Sammeln Sie das Alan Toic Fluid in konischen 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen auf Eis. Wenn die gesamte Flüssigkeit aufgefangen ist, schleudern Sie das Virus herunter und geben Sie die klare Flüssigkeit in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Zum Schluss die Eier in A BSL zwei Abfallbehälter entsorgen und sofort Eloqua zu geklärter LAN toic Flüssigkeit geben.

Dann schnappen Sie das Virus ab, frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein und legen Sie die gefrorenen Stängel in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius. Bei langfristiger Lagerung verursacht eine Influenzavirusinfektion einen zytopathischen Effekt, der zu kreisförmigen Zonen von geschnürten Zellen oder Plaques führt, die sich auf einer Monoschicht von Zellen bilden. In diesem Experiment wurden die Plaques durch Färben der Zellen mit Kristallviolett sichtbar gemacht und 65 Plaques in der Vertiefung gezählt, wobei die einmal 10 bis minus 12 Verdünnung des Virus erfolgte, da 500 Mikroliter verdünnter Virusbestand auf den Zellen kultiviert wurde.

In diesem Experiment betrug der Endtiter 1,3 mal 10 hoch 14 PFU pro Milliliter. Der Hämagglutinin-Nation-Assay ist eine Methode zum Titern von Influenzaviren, die auf der Fähigkeit des Virus basiert, sich an die Oberfläche der roten Blutkörperchen zu binden. Wie beobachtet, verklebt die Virussuspension die roten Blutkörperchen und verhindert, dass sich die roten Blutkörperchen aus der Suspension absetzen.

Ein deutlich negatives Ergebnis wurde bei einer Verdünnung des Virus in 50 Mikrolitern um zwei bis minus 10 beobachtet. Daher beträgt der Endtiter 2,1 mal 10 bis zum vierten HAU pro Milliliter. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Influenzavirus vermehrt, indem man Hühnereier impft und die Atlantikflüssigkeit, die das Virus enthält,