Name: Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Lernen Sie die Patch-Clamp-Technik zur Aufzeichnung lichtevozierter postsynaptischer Antworten in Neuronen der dunkeladaptierten Mäuseretina. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Messungen mit hoher Sensitivität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund und RPB-Zuschüsse unterstützt.

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der Wayne State University zugelassen. 1. Vorbereitung der Versuchslösung <ol><li> Vorbereiten des Präparationslösung 1 Tag bis 1 Woche vor dem eigentlichen Experiment. Verwenden Sie ein HEPES-Pufferlösung für die Netzhaut Dissektion wegen seiner starken Pufferfähigkeit bei niedrigen Temperaturen 16. Mischen Sie alle Chemikalien wie folgt (in mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,0 MgCl 2, 10 HEPES, 28 Glucose. PH-Wert auf 7,4 mit NaOH. Die Lösung wird in einem Kühlschrank bis zu 1 Woche. </li><li> Aufzeichnungslösung ist Ames &#39;Medium, das eine künstliche Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) für die Netzhautpräparate 17 ausgelegt ist. Mit dem Tag des Experiments abzuwiegen Ames-Pulver (4,4 g für 500 ml Lösung) in einem Rohr. Auch abwiegen NaHCO 3 (0,95 g für 500 ml Lösung) und mit der A mischenmes &quot;Pulver. </li><li> Bereiten Sie die intrazellulären Pipette Lösung für Patch Clamp Messungen von der Tag des Experiments. Mischen Sie alle Chemikalien wie folgt (in mM): 111 K-Gluconat, 1,0 CaCl 2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1.0 MgCl2, 5 ATP-Mg und 1,0 GTP-Na. PH-Wert auf 7,2 mit KOH. Filtern der Pipettenlösung mit einem herkömmlichen Spritzenfilter. Stellen Sie ~ 500 ul Aliquots und speichern sie in einem Gefrierschrank oder eine Tiefkühltruhe. </li></ol> 2. Vorbereitung für den Tag der Experiment <ol><li> In der Nacht vor dem Experiment, legen Sie eine Maus in einen Käfig (C57BL / 6J oder ähnlichen Hintergrund, 4 - 8 Wochen alt, männlich) in einem dunklen Raum für O / N Dunkeladaptation. </li><li> Vorbereitung für die Präparation: <ol><li> Füllen Sie sezieren Lösung (100 - 200 ml) in einem Becherglas, legen Sie es auf Eis und Blase mit Sauerstoff für mindestens 10 min. </li><li> Starten Sie die Sauerstoffversorgung des dunklen Kasten Netzhautvorbereitung Lagerung. </li><li> Bereiten Kunststoffdeckgläser mit Fett Schienen für WiederDarm-Schnittpräparate und legen Sie jeden von ihnen in einem 35-mm-Kunststoffschale. </li><li> Setzen Sie eine neue Rasierklinge zu einem Chopper (Gewebeschneidemaschine). </li><li> Schneiden Sie einen Filtermembran in zwei Hälften. Dies ist für die Netzhaut-Schneiden. </li><li> Richten Sie die Sezieren Werkzeuge und Transferpipetten in der Nähe des Binokular. Der Arbeitsbereich ist auch so gestaltet sein, dass jedes Werkzeug kann im Dunkeln leicht zugegriffen werden. </li></ol></li><li> Vorbereitung für die Patch-Clamp-Aufnahmen: <ol><li> Löse Ames Pulver und NaHCO 3 in destilliertem Wasser (Ames 4,4 g und 0,95 g NaHCO 3/500 ml ddH 2 O). Blasen AMES &#39;Medium mit gemischten Sauerstoff (95% O 2 und 5% CO 2) für mindestens 30 min unter Erwärmen auf einem Aufzeichnungstemperaturniveau (~ 35 ° C). Den pH-Wert auf 7,4 mit NaHCO 3, während immer noch sprudelt. </li><li> Tauen Sie den internen Pipettenlösung während der Präparation. Nachdem es aufgetaut ist, fügen 0,01% Sulforhodamin B für die intrazelluläre Färbung. </li></ol></li></ol> 3. Netzhaut Dissection <ol><li> In einem dunklen Raum, einschläfern der Maus unter Verwendung von Kohlendioxid und bilaterale Pneumothorax. Nach 2 - 3 min mit dem Kohlendioxid, wird die Maus das Bewusstsein verlieren. </li><li> Wenn die Maus reagiert nicht mehr auf einem Schwanz kneifen, schnell die Augen enukleiert und legen Sie sie in einem kalten Sektions Lösung in einer Kunststoffschale. Führen Sie die bilateralen Pneumothorax zum Tode des Tieres sicherzustellen. Schnell speichern das Auge in die Schüssel in der Dunkelheit ein. Verwenden Sie eine Infrarot-Viewer, um das Verfahren in der Dunkelheit zu führen. HINWEIS: Alternativ Isofluran, Enthauptung oder Genickbruch für Euthanasie verwendet werden. Die Methode der Euthanasie sollte die Leitlinien des National Institute of Health (NIH) und / oder der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss folgen. </li><li> In einem dunklen Raum, stellen Sie den Binokular und Infrarotbeleuchtung. Unter dem Mikroskop über ein Auge aus seiner Schale in eine 10 cm Plastikschale wit dem Sezieren Lösung gekühlt. Kontinuierlich Blase Sauerstoff durch das Rohr auf dem Boden des Kunststoffschale gegeben. Die Durchflussvolumen, damit es nicht zu gering, aber sicherzustellen, dass sie nicht hoch genug ist, um die Dissektion zu stören. </li><li> Hornhaut und Linse entfernen: <ol><li> Einen Einschnitt auf der Oberseite der Hornhaut mit einem mikrochirurgischen Messer. Halten des Sehnervs am anderen Ende des Augapfels verhindert das Auge bewegt. Erweitern Sie den Schnitt mit einem Paar chirurgische Schere. Schneiden Sie die Hornhaut mit einigen Lederhaut um ihn herum. </li><li> Schnappen Sie sich die Linse mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie das Objektiv langsam aus. Wenn der Glaskörper zu klebrig ist, um die Linse zu entfernen, schneiden Sie den Glaskörper mit einer Schere. </li><li> Sobald die Augenmuschel gemacht wird, sanft gießen Sie kaltes, sauerstoff Sezieren Lösung in die Augenmuschel mit einem kleinen Transferpipette. HINWEIS: Der Augapfel schnell entleert, nachdem ein Einschnitt in der Hornhaut vorgenommen. Es ist wichtig, die Form des Auges, wie Verformen des Auges während dieser Pro aufrechtzuerhaltenverfahren wird die Netzhaut beschädigen und zu einer Netzhautablösung. </li></ol></li><li> Die Ermittlung der dorsalen und ventralen Seiten der Netzhaut: HINWEIS: Aufgrund der ungleichen Verteilung der grünen und der ultravioletten (UV) Kegel 18, Identifizierung einer bestimmten Netzhautbereich ist wichtig für die Lichtreaktion Aufnahmen. <ol><li> Identifizieren Sie die Linie, die über die Netzhaut-Augenmuschel vorbei an der Papille. Diese Linie verläuft meist auf der Bauchseite des Sehnerven; die Seite inklusive der Sehnerv ist die Rückenseite, während der andere ventral 19. Sehen Sie dieses Wahrzeichen deutlich unter Infrarot Zuschauer. </li><li> Je nach dem Zweck des Versuchs, einen Schnitt an der unnötige Neben. Dies kann hilfreich nach Trennen der Netzhaut von der Augenmuschel ist. </li></ol></li><li> Glaskörperentfernung: <ol><li> Optional inkubieren Sie die Augenmuschel mit Hyaluronidase (0,5 mg / ml) für 15 min. </li><li> Entfernen Sie den Glaskörper mit extra feinen Pinzette. Der Glaskörper ist in erster Linieauf dem Boden und der Außenkante der Okularmuschel angebracht. Entfernen Sie sie ohne sie zu berühren oder stoßen die Netzhaut. Da die Glaskörper kann fest an der Augenmuschel befestigt werden, entfernen Sie vorsichtig, um eine Netzhautablösung von der Augenmuschel zu vermeiden. Weiter zu ziehen, bis keine Spannung erreicht ist. Anmerkung: Dieser Schritt ist besonders wichtig für Sezieren der Mausretina; es ist jedoch kein Problem für den Netzhäuten von anderen Spezies, wie Ratten und Salamander. </li></ol></li><li> Isolieren Sie die Netzhaut von der Augenmuschel. Besorgen Sie sich die Lederhaut und sanft ziehen Sie die Netzhaut unter Verwendung der Rückseite der Zange. HINWEIS: Whole-Mount-Netzhaut-Präparate können aus der isolierten Netzhaut durchgeführt werden. Stellen Sie drei vor vier Schnitte an den Kanten und glätten die Netzhaut, oder schneiden Sie die Netzhaut in mehrere Stücke. </li><li> Schneiden Sie die Netzhaut und entsorgen Sie die unnötige Hälfte der Netzhaut (Schritt 3.5). Im gleichen Kunststoffschale, schneiden Sie die restlichen Netzhaut in zwei Stücke. Für jedes Stück der Netzhaut, schneiden Sie die Ränder um ein zu machenNetzhaut-Platte, und schneiden Sie die Falzkanten. </li><li> Übertragen einer Netzhaut-Platte auf eine Glasplatte mit einem großen Transferpipette (~ 2 ml). Saugen Sie die überschüssige Lösung mit einer kleinen Pipette, mit einem Stück Filterpapier, um die Platte zu glätten, und dann schnell legen Sie ein Stück der Filtermembran auf der Oberseite des Gewebes. <ol><li> Mit einem kleinen Transfer Pipette einen Tropfen Sezieren Lösung auf der Filtermembran. Warten Sie ca. 15 Sekunden, bis die Lösung erstreckt sich über der Membran. Während dieser Zeit wird das Netzhautgewebe, um die Filtermembran haften. </li><li> Pour mehr kalte Sezieren Lösung unter und um den Filter. Das Retinagewebes mit der Filtermembran wird schwimmen. Besorgen Sie sich die Filtermembran mit einer Pinzette und legen Sie sie in der Schneidkammer. Gießen Sie sezieren Lösung über das Gewebe, und speichern Sie die Zubereitung in der Dunkelheit ein. HINWEIS: Das hier beschriebene Verfahren ist von entscheidender Bedeutung. Es ist wichtig, diese Schritte schnell durchzuführen, um sicherzustellen, daß die Netzhautgewebe klebt an den Filter memBrane und trocknet nicht aus. </li></ol></li><li> Mit einem Chopper, schneiden Sie das Netzhautgewebe in Scheiben schneiden. Rund 200 um Dicke machbar für Patch-Clamp-Studien. </li><li> Legen Sie eine Kunststoff-Deckglas mit Fett Schienen im Schneideraum. Übertragen einer Netzhaut-Scheibe auf der Oberseite der Fett Schienen auf einer Kunststoffdeckglas. Drehen Sie die Scheibe um 90 °, so dass der Querschnitt zu sehen ist. Drücken Sie die Filtermembran nach unten auf das Deckglas, dann decken Sie die Seiten des Filterpapier mit Fett. <ol><li> Nachdem die Scheibe auf einer Kunststoffdeck immobilisiert, schnappen Sie das Deckglas und überträgt es auf einer 35 mm Kunststoffschale. Gießen Sie kaltes Sezieren Lösung auf die Netzhaut-Vorbereitung und tauchen die Vorbereitung. Bewahren Sie die Schale in den dunklen Kasten, der kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert werden soll. ANMERKUNG: Das gesamte Verfahren muss sorgfältig durchgeführt, so dass die Filtermembran nicht deformiert werden. Andernfalls wird der retinaler Scheibe leicht trennt von der Filtermembran. </li></ol></li></ol><ol><li> Aufnahme der Zubereitung: <ol><li> Prime die Perfusionsschläuche mit Ames &#39;Medium. Lassen Sie alle Blasen passieren beim Füllen der Schläuche. </li><li> Stellen Sie Patch-Clamp-Aufzeichnung Pipetten mit einem Abzieher. Um eine Pipette mit der Pipettenlösung, Sprung in die Rückseite einer Pipette 1 min zu füllen, bis die Pipettenspitze aufgefüllt. Als nächstes füllen ~ 1/3 der Pipette mit einer Mikropipette Füllstoff. Bewahren Sie die Pipette in einem feuchten Pipettenfeld. </li><li> Schalten Sie die Geräte für Patch-Clamp-Aufnahmen; einschließlich des Computers, Verstärker, CCD-Kamera und Mikroskop. </li></ol></li><li> Schalten Sie die Raumbeleuchtung. Setzen Sie ein Netzhaut-Schnittpräparat auf den Mikroskoptisch Kammer mit einem Infrarot-Betrachter. Nachdem es immobilisiert ist, beginnen kontinuierliche Perfusion. Stellen Sie die Perfusion Temperatur bei 33 bis 37 ° C. </li><li> Sehen Sie sich die Scheibenoberfläche mit der CCD-Kamera. Konzentrieren Sie sich auf die Zielposition, wo das Ziel cell Arten befinden. Wählen Sie eine gesund aussehende Zelle für Patch-Clamp-Aufzeichnung (dh es sollte glatt aussehende Oberfläche und eine gute Zellform haben). </li><li> Legen Sie eine Aufnahme Pipette in einer Pipettenhalter. Voraus die Pipette auf die Schnittpräparat. Wenn es in der Nähe der Schnittpräparat (~ 2 mm oben) finden die Spitze der Pipette mit dem Mikroskop. Sobald der Pipettenspitze ist unter dem Mikroskop sichtbar ist, bewegen Sie die Spitze nach unten in Richtung der Zielzelle. </li><li> Stellen Sie den Verstärker. Stellen Sie die Pipette bei 0 mV / pA 0 (Nullstellung) und starten Sie einen kontinuierlichen elektrischen Impuls von ca. 5 mV bei ~ 10 Hz. Prüfen Sie die Pipette Widerstand; idealen Widerstand zwischen 5 und 10 M für die meisten Netzhautneuronen. </li><li> Starten Ausblasen von der Spitze. Verwenden Sie ein Mundstück, oder verwenden Sie eine Spritze, um Überdruck anzuwenden, wenn die Pipette taucht in der Badlösung. Kontinuierlich Ausblasen der internen Lösung, bis die Spitze ist auf der Oberfläche der Zielzelle. <ol><li> Wenn der Überdruck macht einen kleinen Grübchen auf the Zelloberfläche, voranzutreiben die Spitze leicht und Stop Ausblasen. Prüfen Sie die Pipette Widerstand, der zu erhöhen sollte. Wenn es ständig zu, lassen Sie es und Überwachung der Resistenz bis&gt; 1 G (Giga) erreicht. Wenn der Widerstand nicht spontan zu erhöhen, leicht negativen Druck ausüben, bis es eine undurchlässige. </li></ol></li><li> Nach dem Gigaseal erreicht ist, ändern Sie die Haltepotential auf -70 mV. Dann intermittierenden negativen Druck, um die Membran im Inneren der Pipettenspitze Bruch anzuwenden. Wenn der Gesamtzellkonfiguration hergestellt ist, kann die Pipettenwiderstand zwischen 500 MOhm und 1 GOhm, und der kapazitive Strom zu sehen sein. Manchmal spontane postsynaptischen Ströme beobachtet werden kann. </li><li> Notieren Sie sich die IV-Beziehung von -80 bis +40 mV. Verschiedene Typen von spannungsabhängigen Kanäle aktiviert je nach Zelltyp. </li><li> Nehmen Licht-evozierte synaptische Ströme oder Spannungen. </li></ol>

<ol><li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy%2C+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li>
<li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li>
<li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li>
<li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li>
<li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells%2C+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+558+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li>
<li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li>
<li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+524+Pt%22%5BJournal%5D)">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li>
<li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+for+a+binary+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li>
<li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li>
<li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li>
<li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29%2C+GABA%28C%29+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li>
<li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li>
<li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li>
<li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature%3A+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primordial%2C+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Gute Aufnahmen können nur mit einer guten Netzhautvorbereitung und gut durchdachten Patch-Clamp-Setups gemacht werden. Obwohl alle oben beschriebenen Schritte wichtig sind, werden in der Diskussion einige kritische Schritte sowohl für die Sektion als auch für die Aufzeichnung hervorgehoben. 
Für die Dissektion sind zwei Dinge besonders wichtig: Kühlung und Sauerstoffversorgung. Nach der Enukleation des Auges wird der vordere Teil des Auges in einer Präparierkammer mit sauerstoffblasenartiger, ...

Die Netzhaut ist einer der einzigartigen Teile des Nervensystems. Als zugänglicher Teil des Gehirns ist seine synaptische Architektur gut charakterisiert. Darüber hinaus können die Funktionen dieses neuronalen Netzwerks mit einem physiologischen Reiz untersucht werden: Licht. Wenn das Netzhautgewebe in einem dunklen Raum mit geeigneten Verfahren isoliert wird, reagieren Neuronen im Gewebe auf Licht. Dieses Präparat wurde verwendet, um die visuelle Signalverarbeitung zu untersuchen und verschiedene synaptische Mechanismen und Funktionen neuronaler Netzwerke sowie Krankheitsmechanismen aufzuklären. 
Lichtreaktionen in retinalen Neuronen werden seit Jahrzehnten aufgezeichnet. Frühe Studien verwendeten scharfe Elektroden, um intrazelluläre Aufzeichnungen von Mudppy-Netzhautneuronen zu machen1. In den 1980er Jahren wurde die Patch-Clamp-Technik erfunden2 und wurde bald zu einer beliebten Methode unter Sehforschern3,4. Einzelzellaufnahmen von niederen Wirbeltieren, einschließlich Mudpupppy- und Fisch-Netzhautneuronen, waren beliebte Methoden, die zur Aufklärung der Mechanismen der visuellen Signalverarbeitung beitrugen5,6. 
Nachdem genetische Mutationstechniken entwickelt wurden, wurde die Netzhaut der Maus ein beliebteres Modell für Sehforscher7-9. Die Netzhaut von Säugetieren ist attraktiver als die von niederen Wirbeltieren, weil sie evolutionär näher an der menschlichen Netzhaut liegt und die Möglichkeit besteht, Krankheitsmodelle zu verwenden. Netzhautzellen von Mäusen sind jedoch klein und zerbrechlich10, und die Herstellung von Netzhautpräparationen und die Durchführung von Patch-Clamp-Aufzeichnungen in einem dunklen Raum ist eine Herausforderung. Mit der Verbesserung der Technologie stehen verschiedene Ansätze zur Untersuchung visueller Signalmechanismen zur Verfügung, wie z. B. bildgebende Untersuchungen11 und das Elektroretinogramm (ERG)12. Nichtsdestotrotz ist die Einzelzellaufzeichnung mit der Patch-Clamp-Methode nach wie vor wichtig, da sie im Vergleich zu anderen Methoden zeitlich und räumlich sehr sensitiv ist. Aus diesem Grund haben wir kontinuierlich Patch-Clamp-Aufzeichnungen durchgeführt und unsere Methoden zur Untersuchung der visuellen Signalverarbeitung in Maus-Netzhautschnittpräparationenverbessert 13-15.
In diesem Video-Tutorial werden die Protokolle mit wichtigen Tipps vorgestellt. Gute Aufnahmen können nur mit einer guten Vorbereitung gemacht werden. Das Üben des Sezierens von Tieren und der Bau eines robusten Patch-Clamp-Rigs ermöglichen es den meisten Forschern, erfolgreiche Aufnahmen zu erzielen.

<table><tbody><tr><td>Mäuse (28-60 Tage alt, männlich)</td><td>Jackson Labor</td><td>C57BL/6J Stamm</td><td></td></tr><tr><td>Ames' mittleres Pulver</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>ausgezeichnet</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>ausgezeichnet</td></tr><tr><td>Präparierwerkzeug: Pinzette</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td><td>ausgezeichnet</td></tr><tr><td>Präparierwerkzeug: Schere</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>ausgezeichnet</td></tr><tr><td>Präparierwerkzeug: Chirurgiemesser</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>ausgezeichnet</td></tr><tr><td>Rasierklinge (für Zerkleinerer)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>ausgezeichneter</td></tr><tr><td>Häcksler</td><td>handgefertigter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarotbetrachter</td><td>Nachteule Optik</td><td>NOBG1</td><td>Es zeigt helle Ansicht. Das Fokussieren kleiner Objekte ist ein Problem.</td></tr><tr><td>Abzieher</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>ausgezeichnet; stellt Pipetten in gleichbleibender Größe her.</td></tr><tr><td>Dark Box</td><td>Pelican</td><td>Dark Box</td><td>ausgezeichnet</td></tr><tr><td>Patch Clamp System</td><td>Scientifica</td><td>Slice Scope 2000</td><td>Ausgezeichnetes Setup. Die meisten Schlüsselkomponenten sind in einem Paket enthalten. Mikromanipulatoren eignen sich hervorragend.</td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Hervorragende und einfache Steuerung.</td></tr><tr><td>Erwerb der Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp Software</td><td>Hervorragende und einfache Steuerung.</td></tr><tr><td>Lichtquelle (LED)</td><td>Coole LED</td><td>pE-2 4-Kanal-System</td><td>Ausgezeichnete</td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Q-Imaging</td><td>Retiga 2000</td><td>Ausgezeichneter</td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>handgefertigt</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

recording licht-evozierte postsynaptische antworten in neuronen im dunkel-adaptierten, maus retinalen scheibe vorbereitungen verwendung patch-clamp-techniken

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Die Netzhaut ist das Tor zu den visuellen Systems. Zur visuellen Signalverarbeitung Mechanismen zu verstehen, untersuchen wir retinale neuronalen Netzwerkfunktionen. Retinalen Neuronen in dem Netzwerk umfassen eine Reihe von Subtypen. Mehr als 10 Subtypen der bipolaren Zellen, Ganglienzellen und Amakrinzellen wurden durch morphologische Studien identifiziert. Mehrere Subtypen von retinalen Neuronen sind gedacht, um unterschiedliche Merkmale der visuellen Signalisierung, wie Bewegung und Farbe zu codieren, und bilden mehrere Nervenbahnen. Jedoch sind die funktionalen Rollen von jedem Neuron in der visuellen Signalverarbeitung nicht vollständig verstanden. Die Patch-Clamp-Methode ist hilfreich, diese grundlegende Frage zu beantworten. Hier ist ein Protokoll, um Licht-evozierte synaptische Antworten in Maus retinalen Neuronen mit Patch-Clamp-Aufnahmen im dunkeladaptierten Bedingungen aufnehmen wird. Die Maus Augen sind dunkeladaptierten O / N, und Netzhautschnittpräparate werden in einem dunklen Raum mit Infrarotbeleuchtung und Zuschauer seziert. Infrarotlicht nichtAktivieren Maus Photorezeptoren und damit bewahrt ihr Licht Reaktionsfähigkeit. Patch-Clamp verwendet, um Licht hervorgerufenen Reaktionen in retinalen Neuronen aufzuzeichnen. Ein Fluoreszenzfarbstoff während Aufnahmen auf neuronale morphologischen Subtypen charakterisieren injiziert. Dieses Verfahren ermöglicht es, die physiologischen Funktionen von jedem Neuron in der Maus-Retina zu bestimmen.

Eine repräsentative Schnittpräparat ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Schnittpräparat in einer geraden Position, welche Photorezeptoren Ganglionzellen in einer flachen Oberfläche, und keine Ablösung vom Filterpapier. Wenn eine Scheibe geneigt ist, ist nur ein Teil der Vorbereitung im Fokus, was es schwierig macht, eine geeignete Zelle für Patch-Clamp identifizieren. Für Aufnahmen ist es wichtig, eine gute Soma, die in der Regel hat eine glänzende Oberfläche, eine gleichmäßige runde Form, und keine sic...

Wir werden zeigen, wie man Netzhautschnitte aus dem Mausauge präpariert und Lichtreaktionen in retinalen Neuronen aufzeichnet. Das gesamte Verfahren wird unter dunkeladaptierten Bedingungen durchgeführt.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, Aufzeichnungen der Lichtantwort von dunkeladaptierten Netzhautneuronen zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zuerst ein Mausauge entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Netzhaut zu isolieren und für Schnittpräparationen zu schneiden.Anschließend wird das Netzhautpräparat auf einem Mikroskop montiert und betrachtet, um eine Zielzelle für Patch-Clamp-Aufzeichnungen zu finden. Nach Herstellung einer Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration wird ein Lichtreiz in der Nähe der Zelle appliziert. Schließlich kann die gleichzeitige elektrophysiologische Antwort mittels Erfassungssoftware beobachtet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der KRC-Bildgebung besteht darin, dass die Aufnahmesensitivität hoch ist und die Aufnahmezellen morphologisch identifiziert werden können. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Arbeit unter völliger Dunkelheit für Ungeübte schwierig und desorientierend sein kann. Um eine Serie zu beginnen, bereiten Sie die Präparationswerkzeuge und Transferpipetten in der Nähe des Präparationsmikroskops vor.Der Arbeitsbereich wird gut organisiert sein, sodass jedes Werkzeug im Dunkeln leicht zugänglich ist. Wenn bereit, verwenden Sie einen Infrarot-Viewer, um den Eingriff im Dunkeln durchzuführen. Nach der Tötung schnell die Augen enukleieren und sie in eine Schale mit kalter Präparationslösung geben, die in einer dunklen Box aufbewahrt wird; arbeiten Sie dabei unter einem Mikroskop.Überführen Sie ein Auge in eine Schale mit kalter Pufferlösung zum Disponieren. Die Lösung wird kontinuierlich mit Sauerstoff durchblubbert. Um die Hornhaut und Linse zu entfernen, halten Sie den Sehnerv am gegenüberliegenden Ende des Augapfels fest, um eine Bewegung zu verhindern, und führen Sie einen Schnitt an der Oberseite der Hornhaut mit einem mikrochirurgischen Messer durch.Verlängern Sie den Schnitt mit einer chirurgischen Schere und entfernen Sie die Hornhaut, wobei etwas umgebendes Sklerengewebe erhalten bleibt. Greifen Sie danach die Linse mit feinen Pinzetten und ziehen Sie sie langsam heraus. Sobald die Augentasse hergestellt ist, geben Sie vorsichtig kalte, mit Sauerstoff angereicherte Pufferlösung mit einer kleinen Transferpipette in die Augentasse.Arbeiten Sie schnell, um die Form der Netzhaut beizubehalten, und üben Sie sanften Druck aus, um die dorsale und ventrale Seite der Netzhaut zu identifizieren. Verwenden Sie Infrarotbetrachter, um die Linie zu erkennen, die über die Netzhaut-Augenschale verläuft und in der Nähe des Sehnervenkopfes liegt. Diese Linie verläuft hauptsächlich über die ventrale Seite des Sehnervs, und die Seite, die den Sehnerv einschließt, ist die dorsale Seite.Je nach Experiment einen Schnitt entweder an der ventralen oder der dorsalen Seite anlegen. Dies kennzeichnet die überflüssige Seite und dient als nützlicher Marker für die weiteren Schritte. Anschließend vorsichtig den Glaskörper mit besonders feinen Pinzetten entfernen, ohne die Netzhaut zu berühren.Das Glaskörper ist hauptsächlich an der Unterseite und der äußeren Kante der Augenschale befestigt. Da der Glaskörper möglicherweise fest mit der Augenschale verbunden ist, gehen Sie vorsichtig vor, um eine Netzhautablösung zu vermeiden. Ziehen Sie weiter, bis keine Spannung mehr spürbar ist.Wenn die Netzhaut isoliert ist, ergreifen Sie die Sklera und lösen Sie vorsichtig die Netzhaut ab. Mit der Rückseite der Pinzette beschneiden Sie die Netzhaut und entsorgen die überflüssige Hälfte in derselben Plastikschale. Schneiden Sie die verbleibende Netzhaut in zwei Stücke, jedes in zwei Teile.Schneiden Sie die Ränder ab, um einen Netzhautblock zu erhalten, und beschneiden Sie die gefalteten Kanten. Übertragen Sie anschließend mithilfe einer großen Transferpipette einen Netzhautblock auf eine Glasplatte. Saugen Sie die überschüssige Lösung mit einer kleinen Pipette ab und glätten Sie den Block mit einem Stück Filterpapier.Platzieren Sie vorsichtig ein Stück der Filtermembran mit einer kleinen Transferpipette auf dem Gewebe. Geben Sie einen Tropfen Dissektionslösung auf die Filtermembran. Warten Sie etwa 15 Sekunden, während sich die Lösung ausbreitet und das Netzhautgewebe an der Filtermembran befestigt.Wenn die Membran einmal zusammengeklebt ist, gießen Sie weitere kalte Dissektionslösung unter und um den Filter, bis die Membran schwimmt. Anschließend bringen Sie die Filtermembran in die Schneidekammer ein und bedecken sie mit Dissektionslösung. Arbeiten Sie schnell, um sicherzustellen, dass die Membran nicht austrocknet, und verwenden Sie den Schneideapparat, um das Netzhautgewebe in Schnitte zu zerlegen.Platzieren Sie eine Kunststoff-Abdeckung mit Fettrillen in die Schneidekammer. Übertragen Sie eine Netzhautscheibe auf die Fettrillen und drehen Sie die Scheibe um 90 Grad, sodass der Querschnitt sichtbar ist. Drücken Sie die Filtermembran auf die Abdeckung, bevor Sie die Seiten des Filterpapiers mit Fett abdichten.Nachdem die Schnitte auf einem Kunststoff-Objektträger fixiert sind, überführen Sie diesen in eine 33-Millimeter-Kunststoffschale. Benetzen Sie die Präparation mit einer kohlensäurehaltigen Ringerlösung und lagern Sie jede Schale in einer dunklen Box, die kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert wird. Für die Patch-Clamp-Ableitungen.Spülen Sie die Perfusionsröhrchen mit AIMs-Medium und lassen Sie alle Blasen aus der Tubing entweichen. Nachdem Sie Aufnahmepipetten mit einem Glaspol erstellt haben, füllen Sie die Spitze rückwärts mit der Pipettenlösung. Füllen Sie anschließend mit einem Mikropipettenfüller etwa ein Drittel der Pipette und lagern Sie jede Pipette nach dem Befüllen in einer feuchten Pipettenbox.Schalten Sie als Nächstes die Ausrüstung für Patch-Plant-Aufnahmen ein, einschließlich Computer, Verstärker, CCD-Kamera und Mikroskop, das unter Dunkelbedingungen arbeitet. Plazieren Sie eine Netzhautschnittpräparation mithilfe eines Infrarot-Betrachters auf dem Mikroskoptisch. Nachdem sie fixiert ist, beginnen Sie mit der kontinuierlichen Perfusionsgabe.Stellen Sie die Perfusions­temperatur auf 33 bis 37 Grad Celsius ein. Betrachten Sie die Schnitt­oberfläche mit einer CCD-Kamera. Fokussieren Sie den Ziel­ort.Wenn die Zielzelltypen vor Ort sind, wählen Sie eine gesund aussehende Zelle für eine Patch-Clamp-Aufnahme aus. Sobald eine gesunde Zelle identifiziert wurde, platzieren Sie eine Aufnahmepipette in einem Pipettenhalter und führen die Pipette zur Schnittpräparation. Wenn sie sich nahe der Schnittpräparation befindet, suchen Sie die Pipettenspitze mit einem Mikroskop. Sobald die Pipettenspitze unter dem Mikroskop sichtbar ist, bewegen Sie die Spitze in Richtung der Zielzelle nach unten. Stellen Sie anschließend den Verstärker ein und justieren Sie die Pipette am Pika-Verstärker. Fünf Volt pro Nanoampere.Starten Sie einen kontinuierlichen elektrischen Impuls mit etwa fünf Millivolt und etwa 10 Hertz und überprüfen Sie den Pipettenwiderstand. Ein idealer Widerstand liegt zwischen fünf und zwölf Megaohm. Für die meisten retinalen Neuronen.Wenn bereit, verwenden Sie eine Mundstück oder eine Spritze, um die Innere Lösung auszublasen, bis die Spitze der Pipette auf der Oberfläche der Zielzelle liegt. Wenn der positive Druck einen kleinen Delle auf der Zelloberfläche erzeugt, bewegen Sie die Spitze leicht vorwärts und hören Sie auf, auszublasen. Wenn der Pipettenwiderstand kontinuierlich ansteigt, lassen Sie es und überwachen Sie den Widerstand, bis er über einen Gigaohm erreicht.Falls der Widerstand nicht spontan ansteigt, vorsichtig Unterdruck anlegen, bis ein Giga-Seal entsteht. Nach Erreichen des Giga-Seals das Haltepotential auf minus 70 Millivolt umschalten und anschließend intermittierend Unterdruck anwenden, um die Membran innerhalb der Pipettenspitze zu rupturieren. Sobald die Ganzzell-Konfiguration hergestellt ist, kann der Pipettenwiderstand zwischen 500 Megaohm und einem Gigaohm liegen, und der kapazitive Strom ist beobachtbar.Notieren Sie die Strom-Spannungs-Beziehung von minus 80 bis 40 Millivolt. Abhängig vom Zelltyp werden unterschiedliche Arten von spannungsabhängigen Kanälen aktiviert. Zuletzt nehmen Sie lichtinduzierte synaptische Ströme oder Spannungen auf.Diese Schnittpräparation, bei 10-facher Vergr&ouml;&szlig;erung betrachtet, zeigt sowohl Photorezeptoren als auch Ganglienzellen, ohne dass eine Abl&ouml;sung vom Filterpapier auftritt. Bei Betrachtung dieser Pr&auml;paration mit einem 60-fachen Objektiv wird jede Zellschicht deutlich sichtbar. Lichtinduzierte exzitatorische postsynaptische Potentiale von Netzhautneuronen wurden als Reaktion auf einen Lichtimpuls hervorgerufen.Die Peak-Amplitude und die Abklingzeit variieren je nach Zelltyp und -untertyp. Der Zelltyp und sein morphologischer UnterTyp wurden durch Sulfurmarkierung nach physiologischen Ableitungen nach der Entwicklung offenbart. Diese Technik ebnete den Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Retina-Forschung den Weg, um die Funktionen der natürlichen visuellen Signalübertragung sowie den Beitrag synaptischer Mechanismen zu untersuchen.

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt den Prozess der whole-cell voltage clamp Aufnahmen in der Netzhaut Scheibe der aquatischen Tiger Salamander. Wir zeigen die Herstellung der Scheibe als auch, wie man Patch Clamp Messungen während visueller Stimulation der Netzhaut führen.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von dunkeladaptierten Scheiben der Maus Netzhaut elektrophysiologischen Ableitungen.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

Dieses Video zeigt eine Ganzzell-Patch-Clamp-Technik für die elektrophysiologische Aufzeichnung von einer flach montierten Mausnetzhaut. Eine dünne Glaspipette mit einer Elektrode wird verwendet, um sich den Starburst-Amakrinzellen (SACs) innerhalb der Netzhaut zu nähern. Nach dem Formen einer Versiegelung wird ein Sog angewendet, um die Membran zu brechen und die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration zu bilden. Schließlich wird der Fluss von Ionen durch die synaptischen SAC-Rezeptoren anhand der...

Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von einer flach montierten Maus-Netzhaut

Das Video zeigt ein Protokoll zur Untersuchung synaptischer Interaktionen und neuronaler Reaktionen in einem transfizierten Hippocampus-Hirnschnitt der Maus. Dabei werden sensorische Neuronen mit großer Reichweite beleuchtet, um Aktionspotentiale auszulösen, und die daraus resultierenden exzitatorischen postsynaptischen Potentiale im aufgezeichneten Neuron unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik aufgezeichnet.

Photostimulation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Neuronen in Hippocampus-Schnitten der Maus

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von lichtevozierten postsynaptischen Reaktionen in einer dunkeladaptierten Maus-Netzhaut-Gewebeschnittpräparation. Der Netzhautschnitt wird in eine Aufnahmekammer gelegt, und eine Aufnahmepipette wird verwendet, um die elektrische Kontinuität mit einer retinalen Ganglienzelle herzustellen. Mit Lichtimpulsen werden exzitatorische postsynaptische Potentiale in den Ganglienzellen erzeugt, die mit der Pipette aufgezeichnet werden.

Lichtevozierte postsynaptische Reaktionen in Neuronen von Netzhautschnitten von Mäusen

Wir beschreiben die Herstellung von dünnen Scheiben von retinalen Wasserorganismen Tiger Salamander...

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

Dieses Protokoll zeigt, wie Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf die retinale Neuronen aus einem flachen-Mount-Vorbereitung durchzuführen.

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

Wir entwickelten eine horizontale Schnittpräparat der erwachsenen Säugetier-Netzhaut mit der Ebene parallel zu der Netzhautoberfläche sectioning. Dendritische Bereichen nonradially orientierte Netzhautneuronen wurden nicht abgeschnitten, so dass die Untersuchung der Signalverarbeitung mit Patch-Clamp-und Imaging-Techniken.

Vorbereitung von Horizontal Scheiben der erwachsenen Maus Retina für elektrophysiologische Untersuchungen

In diesem Artikel besprechen wir drei Gehirn-Präparate für die ganze Zelle Patch Clamp Aufzeichnung die Retinotectal Schaltung von Xenopus Laevis Kaulquappen zu studieren. Jede Vorbereitung, mit ihren eigenen spezifischen Vorteilen, trägt zur experimentellen Lenkbarkeit des Xenopus Kaulquappe als Vorbild für neuronale Schaltkreis-Funktion zu untersuchen.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

Lernen Sie die Patch-Clamp-Technik zur Aufzeichnung lichtevozierter postsynaptischer Antworten in Neuronen der dunkeladaptierten Mäuseretina. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Messungen mit hoher Sensitivität.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken (Video) | JoVE Journal

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

Weitere Videos entdecken