Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, Aufzeichnungen der Lichtantwort von dunkeladaptierten retinalen Neuronen zu erhalten. Dazu wird zunächst ein Mausauge geerntet. Der zweite Schritt besteht darin, die Netzhaut zu isolieren und für die Schnittvorbereitung zu schneiden.

Als nächstes wird das Netzhautpräparat montiert und an einem Mikroskop betrachtet, um eine Zielzelle für Patch-Clamp-Aufnahmen zu finden. Nach der Etablierung einer Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration wird ein Lichtreiz in der Nähe der Zelle angewendet. Schließlich kann die gleichzeitige elektrophysiologische Reaktion durch die Erfassungssoftware beobachtet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der KRC-Bildgebung besteht darin, dass die Aufzeichnungsempfindlichkeit hoch ist und dass die aufzeichnenden Zellen morphologisch identifiziert werden können. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Arbeit in völliger Dunkelheit für diejenigen, die nicht daran gewöhnt sind, schwierig und verwirrend sein kann. Um einen Bereich zu beginnen, werden die Präparierwerkzeuge und Transferpipetten in der Nähe des Präpariermikroskops verwendet.

Der Arbeitsbereich wird gut organisiert, so dass jedes Werkzeug auch im Dunkeln leicht zugänglich ist. Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie Dawn einen Infrarotbetrachter, um den Eingriff im Dunkeln durchzuführen. Nach der Euthanasie schnell die Augen keimen und in eine Schale mit kalter Präparierlösung legen, die in einer dunklen Box unter dem Mikroskop aufbewahrt wird.

Übertragen Sie ein Auge in eine Schüssel mit kalter Präparierlösung. Kontinuierlich mit Sauerstoff gefüllt. Um die Hornhaut und die Linse zu entfernen, halten Sie den Sehnerv am anderen Ende des Augapfels, damit er sich nicht bewegt, und machen Sie mit einem mikrochirurgischen Messer einen Schnitt an der Oberseite der Hornhaut.

Verlängern Sie den Schnitt mit einer chirurgischen Schere und entfernen Sie die Hornhaut, wobei Sie etwas Sklera um sie herum lassen. Fassen Sie dann die Linse mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie sie langsam heraus. Sobald die Augenmuschel hergestellt ist, gießen Sie mit einer kleinen Transferpipette vorsichtig kalte, sauerstoffhaltige Präparierlösung in die Augenmuschel.

Arbeiten Sie schnell, um die Form der Netzhaut zu erhalten, und üben Sie leichten Druck aus, um die dorsale und ventrale Seite der Netzhaut zu identifizieren. Verwenden Sie Infrarotbetrachter, um die Linie zu identifizieren, die durch die Netzhaut-Augenmuschel verläuft und in der Nähe des Sehnervenkopfes verläuft. Diese Linie verläuft hauptsächlich über die ventrale Seite des Sehnervs und die Seite, einschließlich des Sehnervs, ist die dorsale Seite.

Je nach Versuch wird ein Schnitt entweder auf der ventralen oder dorsalen Seite vorgenommen. Dies markiert die unnötige Seite und ist ein nützlicher Marker für die Zukunft. Anschließend entfernen Sie den Glaskörper vorsichtig mit einer extra feinen Pinzette, ohne die Netzhaut zu berühren.

Der Glaskörper wird hauptsächlich am unteren und äußeren Rand der Augenmuschel befestigt. Da der Glaskörper möglicherweise fest an der Augenmuschel befestigt ist, gehen Sie vorsichtig vor, um die Netzhautablösung zu entfernen. Ziehen Sie weiter, bis keine Spannung mehr zu spüren ist.

Sobald die Netzhaut isoliert ist, greifen Sie nach der Sklera und ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig ab. Schneiden Sie mit der Rückseite der Pinzette die Netzhaut ab und entsorgen Sie die unnötige Hälfte in derselben Plastikschale. Schneide die restliche Netzhaut in zwei Stücke für jedes Stück.

Schneide die Kanten ab, um eine Netzhautplatte zu machen, und schneide die Faltkanten ab. Verwenden Sie als Nächstes eine große Transferpipette, um eine Netzhautplatte auf eine Glasplatte zu übertragen. Saugen Sie die überschüssige Lösung mit einer kleinen Pipette auf und drücken Sie die Platte mit einem Stück Filterpapier flach.

Legen Sie ein Stück der Filtermembran vorsichtig mit einer kleinen Transferpipette auf das Gewebe. Geben Sie einen Tropfen Präparierlösung auf die Filtermembran. Warten Sie etwa 15 Sekunden, während sich die Lösung ausbreitet und das Netzhautgewebe an der Filtermembran klebt.

Sobald es zusammengeklebt ist, gießen Sie mehr kalte Präparierlösung unter und um den Filter, bis die Membran schwimmt. Legen Sie anschließend die Filtermembran in die Schneidekammer und bedecken Sie sie mit Präparierlösung. Um sicherzustellen, dass die Membran nicht austrocknet, schneiden Sie das Netzhautgewebe mit dem Zerkleinerer in Scheiben.

Legen Sie einen Kunststoff-Abdeckschub mit Fettschienen in die Schneidekammer. Übertragen Sie eine Netzhautscheibe auf die Fettschienen und drehen Sie die Scheibe um 90 Grad, so dass der Querschnitt sichtbar ist. Drücken Sie die Filtermembran auf den Deckglas, bevor Sie die Seiten des Filterpapiers mit Fett bedecken.

Nachdem die Scheiben auf einem Kunststoff-Deckglas immobilisiert sind, geben Sie sie in eine 33-Millimeter-Kunststoffschale. Tauchen Sie die Zubereitung in Kohle-Präparierlösung und lagern Sie jede Schale in einer dunklen Box, die kontinuierlich mit Sauerstoff angereichert ist. Für Patch-Clamp-Aufnahmen.

Grundieren Sie die Profusion-Tuben mit mittlerer Ausrichtung und lassen Sie alle Blasen aus dem Schlauch austreten. Nachdem Sie Pipetten mit einem polaren Glas aufgenommen haben, füllen Sie die Spitze mit Pipettenlösung auf. Verwenden Sie als Nächstes einen Mikropipettenfüller, um etwa ein Drittel der Pipette zu füllen, sobald sie gefüllt ist, bewahren Sie jede Pipette in einem feuchten Pipettenkasten auf.

Schalten Sie als Nächstes die Ausrüstung für die Aufnahme von Patch-Pflanzen ein, einschließlich des Computerverstärkers, der CCD-Kamera und des Mikroskops, die unter dunklen Bedingungen arbeiten. Legen Sie eine Netzhautschnittpräparation mit Hilfe eines Infrarotbetrachters auf den Mikroskoptisch. Nachdem es immobilisiert ist, beginnen Sie mit der kontinuierlichen Perfusion.

Stellen Sie die Perfusionstemperatur auf 33 bis 37 Grad Celsius ein. Betrachten Sie die Schnittoberfläche mit einer CCD-Kamera. Konzentrieren Sie sich auf den Zielort.

Wenn sich die Zielzelltypen befinden, wählen Sie eine fehlerfrei aussehende Zelle für eine Patch-Clat-Aufzeichnung aus. Sobald eine gesunde Zelle identifiziert ist, legen Sie eine Aufzeichnungspipette in einen Pipettenhalter und führen Sie die Pipette zur Schnittvorbereitung vor. Wenn es sich in der Nähe der Schnittvorbereitung befindet, suchen Sie die Spitze der Pipette mit einem Mikroskop.

Sobald die Pipettenspitze unter dem Mikroskop sichtbar ist, bewegen Sie die Spitze nach unten in Richtung der Zielzelle. Stellen Sie als Nächstes den Verstärker ein und stellen Sie die Pipette am Pika-Verstärker ein. Fünf Volt pro Nana-Ampere.

Starten Sie einen kontinuierlichen elektrischen Impuls von ca. fünf Millivolt und ca. 10 Hertz und überprüfen Sie den Pipettenwiderstand. Ein idealer Widerstand liegt zwischen fünf und 12 Megaohm. Für die meisten retinalen Neuronen.

Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie ein Mundstück oder eine Spritze, um die innere Lösung auszublasen, bis die Spitze der Pipette auf der Oberfläche der Zielzelle liegt. Wenn der Überdruck ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche hinterlässt, schieben Sie die Spitze leicht nach vorne und hören Sie auf zu blasen. Wenn der Pipettenwiderstand kontinuierlich ansteigt, lassen Sie ihn stehen und überwachen Sie den Widerstand, bis er mehr als ein Gigaohm erreicht.

Wenn der Widerstand nicht spontan zunimmt, üben Sie vorsichtig Unterdruck aus, bis es zu einer Giga-Dichtung wird. Nachdem die Giga-Versiegelung erreicht ist, ändern Sie das Haltepotenzial auf minus 70 Millivolt und üben Sie dann intermittierend Unterdruck aus, um die Membran in der Pipettenspitze zu zerreißen. Wenn die gesamte Zellkonfiguration vorgenommen wird, kann der Pipettenwiderstand zwischen 500 Megaohm und einem Gigaohm liegen, und der kapazitive Strom ist beobachtbar.

Notieren Sie das IV-Verhältnis von minus 80 bis 40 Millivolt. Je nach Zelltyp werden unterschiedliche Arten von spannungsgesteuerten Kanälen aktiviert. Zu guter Letzt evozierte Schallplattenlicht synaptische Ströme oder Spannungen.

Diese Schnittpräparation zeigt bei 10 x betrachtet sowohl Photorezeptoren als auch Ganglienzellen ohne Ablösung vom Filterpapier. Wenn dieses Präparat mit einem 60-fach-Objektiv betrachtet wird, ist jede Zellschicht deutlich zu sehen. Licht, das exzitatorische postsynaptische Potentiale von retinalen Neuronen hervorrief, wurden als Reaktion auf ein Stufenlicht evoziert.

Die Spitzenamplitude und die Abklingzeit variieren je nach Zelltyp und Subtyp. Der Zelltyp und sein morphologischer Subtyp wurden durch Schwefelmarkierung nach physiologischen Aufzeichnungen nach seiner Entwicklung aufgedeckt. Diese Technik ebnete den Weg für Wissenschaftler auf dem Gebiet der Netzhautforschung, um die Funktionen der natürlichen visuellen Signalübertragung sowie den Beitrag synaptischer Mechanismen zu untersuchen.