Name: Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von Tacrolimus in getrockneten Blutflecken mittels HPLC-MS/MS. Diese Methode ermöglicht minimal-invasive Probenahme und verbessert die therapeutische Arzneimittelüberwachung.

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Diese Arbeit wurde durch den Vertrag HHSF223201310224C der United States Federal Drug Administration (FDA) und den Zuschuss 1U01FD004573-01 der United States National Institutes of Health/FDA unterstützt.

De-identifizierte Blutproben von gesunden Personen waren von der University of Colorado Hospital (Aurora, Colorado). Die Verwendung von de-identifizierten Blutbank-Proben für die Validierungsstudien sowie für die Herstellung von Kalibratoren und Qualitätskontrollproben wurde als von der Colorado Mehr Institutional Review Board (COMIRB, Aurora, Colorado) &quot;befreit&quot;. 1. Herstellung von Referenzen und Lösungen <ol><li> Kauf Tacrolimus und der interne Standard D 2, 13 C-Tacrolimus aus den in der Materialliste aufgeführt Anbieter. <ol><li> Stammlösungen in reinem Methanol bei einer Konzentration von 1 mg / ml für Tacrolimus und einer Konzentration von 10 ug / ml D 2, 13 C-Tacrolimus. Machen Stammlösungen von Referenzmaterialien auf Basis von drei unabhängigen Gewichtungen. Aliquot Stammlösungen und bei -70 ° C oder darunter. </li></ol></li><li> Bereiten Lösung Proteine ​​auszufällenund extrahieren Tacrolimus Verwendung von Methanol / 0,2 M ZnSO 4 in Wasser (7: 3, V: V). Diese Lösung enthält auch den internen Standard D 2, 13 C-Tacrolimus in einer Konzentration von 2,5 ng / ml und wird für die Extraktion von allen Proben mit Ausnahme der Entnahme von Leerproben (siehe 1.3.3) verwendet. <ol><li> Bereiten Sie diese Proteinfällungslösung frisch auf jeder Extraktion Tag und stellen Sie den Ablauf der Lösung bei 12 Stunden. </li></ol></li><li> Herstellung der Eichkurve und Qualitätskontrolle (QC) Proben <ol><li> Bereiten Stammlösungen von Tacrolimus, indem geeignete Verdünnungen der Stammlösung mit reinem Methanol. </li><li> Um Kalibratoren und Qualitätskontrollproben vorzubereiten, Spike 20 ul entsprechend verdünnten Stammlösung in EDTA-Vollblut, bei 37 ° C unter leichtem im Wasserbad Schütteln, um eine homogene Verteilung von Tacrolimus in die zellulären Blutbestandteile für 20 min und aliquoten ermöglichen in 1,5 ml Polypenropylene Röhrchen mit konischem Boden und Schnappdeckel. Sicherzustellen, dass das relative Volumen an organischem Lösungsmittel 5% nicht übersteigen. </li><li> Spot 50 ul der Stachelvollblut in der Mitte jedes Kreises auf der Filterkarten unter Verwendung einer Pipette. </li><li> Trocknen Sie die Blutflecken auf Filterkarten bei RT für 3 h. </li><li> Vorbereitung Tacrolimus Kalibrierstandards humanes EDTA-Vollblut bei Tacrolimus Konzentrationen von 1, 2,5, 5, 10, 25 und 50 ng / ml. Bereiten Sie eine leere Probe für die Extraktion wie die Kalibrierungsstandards mit der Proteinfällung Lösung, die den internen Standard D 2, 13 C-Tacrolimus (&quot;Nullprobe&quot;). </li><li> Vorbereitung QC Proben menschlichen EDTA-Vollblut bei Konzentrationen von 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Bereiten Sie eine leere Probe. Im Gegensatz zu den QC-Proben, die mit Ausfällen den internen Standard enthält D 2 extrahiert werden, 13 C-Tacrolimus, extrahieren Sie diese Blindprobe mit Proteinfällungslösung, die funktioniertnicht enthalten, die den internen Standard D 2, 13 C-Tacrolimus (&quot;Blindprobe&quot;). </li></ol></li><li> Sammlung von klinischen Proben <ol><li> Sammeln getrocknete Blutflecken wie in 43,44 beschrieben. </li></ol></li></ol> 2. Extraktion von Tacrolimus Trockenblut Proben <ol><li> Sichtprüfung der getrockneten Blutfleck auf akzeptable Probenqualität und Volumen 45 zu gewährleisten. </li><li> Punch Zentrum der Blutfleck auf der Filterkarte mit einem 6-mm-Lochung. Hinweis: Die Qualität von Schlägen kann durch Wiegen kontrolliert werden. Eine Stanz gesättigten Filterscheibe wiegt durchschnittlich 5,02 mg ± 0,09 mg (Bereich: 4.83- 5.14 mg, n = 12). </li><li> Platz Scheiben in 1,5 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden und Schnappdeckel. </li><li> Hinzufügen 20-30 Kugeln in jedes Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 500 ul der Proteinfällungslösung (Methanol: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, V: V mit 2,5 ng / ml interner Standard) in jedes Röhrchen. Für die extrWirkung von Leerproben, verwenden Proteinfällungslösung ohne inneren Standard. </li><li> Homogenisieren die Scheiben in der Kugel-Mischer für 1 min (Maximaldrehzahl, der Einstellung &quot;10&quot;). </li><li> Schütteln Sie Proben bei RT auf Mehrrohr Vortex (Maximaldrehzahl, die Einstellung &quot;10&quot;) für 10 min. </li><li> Zentrifuge Proben bei 16.000 × g und 4 ° C für 10 min. </li><li> Die Überstände in Glas HPLC-Ampullen mit einer 300 ul Einsatz ausgestattet. Verwenden vorgeschlitzten Teflondichtungen. Anmerkung: Die extrahierten Proben können bei -20 ° C oder darunter, bis LC-MS / MS-Analyse gespeichert werden. </li></ol> 3. LC-MS / MS-Analyse <ol><li> Last 100 ul des Überstands der extrahierten Probe auf die Extraktionssäule C8 Patrone und waschen mit einem 7: 3-Verhältnis von 0,1% Ameisensäure in Wasser: Acetonitril, bei einem Fluss von 5 ml / min für 1 min. Die Anschlüsse des Schaltventils sind in Figur 2 gezeigt und die Steigung durch die Extraktionspumpe in Tabelle 1 ausgeführt </strong&gt;. </li><li> Jenseits, aktivieren Sie die Schaltventil, was zu Rückspülung der Analyten aus der Vorsäule auf die analytische Säule. </li><li> Stellen Sie den Säulenthermostat auf 65 ° C. </li><li> Elution der Analyten aus der analytischen Säule mit Hilfe der Durchflussraten und Gradienten in Tabelle 1 dargestellt. </li><li> Schließen Sie die Trennsäule mit einem Tandem-Massenspektrometer über das Turbo-Elektrospray-Ionisations-Quelle. Anpassung der wesentlichen Parameter des Massenspektrometers gemäß Tabelle 2. </li><li> Erkennung von positiven Ionen ([M + Na] +) in der Mehrfachreaktionsmodus (MRM). Verwenden Sie die folgenden Ionenübergänge für die Quantifizierung: Tacrolimus: m / z (Masse / Ladungs) = 826,6 → 616,2 und D 2, 13 C-Tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2. Hinweis: Die Gesamtlaufzeit beträgt 4,6 min. </li></ol> 4. Quantifizierung <ol><li> Für jeden Durchlauf, erzeugen eine Eichkurve auf der Grundlage der in 1.3.5 und hergestellt Kalibratorengehören in jede Analysenserie. <ol><li> Generieren Sie eine Eichkurve Nennkonzentrationen gegenResponseFaktor des Analyten (Peakfläche [Analyt] / Peak-Bereich [interner Standard]) unter Verwendung des Massenspektrometers Software. </li><li> Setzen Sie die Kalibratoren mit einer quadratischen Anpassung in Verbindung mit 1 / X Gewichtung. </li></ol></li><li> Quantität Tacrolimus in den getrockneten Blutflecken integrieren die Tacrolimus und des internen Standardpeaks in den extrahierten MRM Chromatogramme. Berechnen Sie die Reaktionsfaktor für Tacrolimus (Peakfläche [Analyt] / Peak-Bereich [interner Standard]) und vergleichen Sie mit der Eichkurve unter Verwendung der Massenspektrometrie-Software. </li></ol> 5. Validierungsverfahren <ol><li> Untere Nachweisgrenze (untere Nachweisgrenze) und Untergrenze (LLOQ). <ol><li> Betrachten wir die niedrigste Konzentration von Tacrolimus mit einer Spitze-zu-Rausch-Verhältnis von 4: 1 als die untere Nachweisgrenze (untere Nachweisgrenze). Definieren Sie die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) alsniedrigste Konzentration der Eichkurve mit einer Genauigkeit, die gleich oder besser als ± 20% Abweichung von der Soll-Konzentration und Präzision gleich oder besser als 20% (Variationskoeffizient). </li></ol></li><li> Intra- und inter Tag Genauigkeiten und Präzisierungen. <ol><li> Testen der Genauigkeit und Präzision bei vier Konzentrationen von 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) und 40 ng / ml (QC4). </li><li> Bereiten Sie die QC-Proben auf jeder Validierung Tag im menschlichen EDTA-Vollblut, Trocken auf Filterkarten, extrahieren und zu analysieren, wie oben beschrieben. </li><li> Bestimmen Sie Intraday-Genauigkeit und Präzision mit 6 Proben pro QC Konzentration. </li><li> Beurteilen Sie Inter-Day-Genauigkeit und Präzision über 20 Tage. Messen Sie jedes QC-Ebene mit 4 Proben pro Tag. </li><li> Analysieren Sie zwei Kalibrierungskurven zusammen mit den QC-Proben an jedem Tag. </li><li> Intraday-Genauigkeit zu berechnen als% der Nominalkonzentration (sechs Proben pro Konzentrationsstufe, siehe 5.2.2). CalcUlate Präzision als Varianzkoeffizienten (CV%). </li><li> Betrachten Sie Intraday-Genauigkeit akzeptabel, wenn sie fällt in der vorgegebenen Grenzwerte in 85% bis 115% des Nominalkonzentration. Sehen untertägigen Genauigkeit akzeptabel ist, wenn er gleich oder besser als ein CV (Variationskoeffizient) von 15%. </li><li> Berechnen inter Tag Genauigkeit und Präzision als Mittelwert für jeden QC Konzentration an den 20 Validierungs Tagen analysiert. </li><li> Betrachten mittlere Inter-Day-Genauigkeit akzeptabel, wenn sie fällt in der vorgegebenen Grenzwerte in 85% bis 115% des Nominalkonzentration. Prüft unter Tages Genauigkeit akzeptabel ist, wenn er gleich oder besser als ein CV (Variationskoeffizient) von 15%. </li></ol></li><li> Ausschluss von Matrixinterferenzen. <ol><li> Für den Ausschluss von Störungen, die durch die Matrix-Signale verursacht werden können, zu analysieren leere getrocknete Blutflecken (8 verschiedenen Individuen, vorzugsweise 4 Männer und 4 Frauen). </li><li> Sichtprüfung Ionenchromatogramme. Wenn Spitzen innerhalb der RetentionszeitFenster von Tacrolimus festgestellt werden, zu integrieren und vergleichen Sie die Flächen unter der Kurve mit denen von Tacrolimus Spitzen im Leerproben gespickt mit Tacrolimus im LLOQ. Die Fläche der Peaks in den Leerproben sollen nicht 15% der von Tacrolimus im LLOQ überschreiten. </li></ol></li><li> Ionensuppression / ion Verbesserung. <ol><li> Verwenden Sie einen Post-Spalte Infusionsprotokoll, wie beschrieben, 45, um mögliche Störungen von Ionenunterdrückung / ion Verbesserung durch koeluierenden Matrixkomponenten verursacht zu bewerten. </li><li> Infundieren Tacrolimus in einer Konzentration von 10 ug / ml in 0,1% iger Ameisensäure gelöst: Methanol (30:70, v / v) post-Säule mit einer Geschwindigkeit von 10 ul / min. <ol><li> Verbinden einer Spritzpumpe über T-Stück zwischen der Trennsäule und dem Elektrosprayquelle des Massenspektrometers. </li><li> Überwacht die MS / MS-Signalintensität der MRM Gänge für Tacrolimus und seiner internen Standard (m / z = 826,6 → 616,2 und m / z = 829,6 → 619,2) nach der Injektion von extracted Leerproben (n = 8 Proben von verschiedenen Individuen). Anmerkung: In Abwesenheit von Ionenunterdrückung / Ionenanreicherungs sollte das Dauersignal von einer Infusion der Analyten verursacht nicht durch Injektion des Blindmatrix beeinflusst werden, während Ionensuppression bewirkt einen Sprung des Signals und Ionenanreicherungs ein Peak. </li></ol></li></ol></li><li> Übertrag. <ol><li> Bewertung der potenziellen Übertrag durch Analysieren extrahierten Leerproben nach den höchsten Kalibratoren (50 ng / ml, n = 6). </li><li> Sichtprüfung Ionenchromatogramme. Wenn Peaks innerhalb des Retentionszeitfenster von Tacrolimus festgestellt werden, zu integrieren und vergleichen Sie die Flächen unter der Kurve mit denen von Tacrolimus Spitzen im Leerproben gespickt mit Tacrolimus im LLOQ. Die Fläche der Peaks in den Leerproben sollen nicht 15% der von Tacrolimus im LLOQ überschreiten. </li></ol></li><li> Extraction Erholungen. <ol><li> Bestimmen Sie, Rückforderungen durch Vergleich der Signale der Analyten nach der Extraktion des QC samsätze an allen vier Konzentrationsstufen (n = 6 pro Konzentration) mit denen der leere getrocknete Blutflecken versetzt mit der entsprechenden Beträge von Tacrolimus nach der Extraktion. </li><li> Vorbereitung vier Sätze von QC (Konzentration: 2, 4, 20, 40 ng / ml). </li><li> Bereiten Sie weitere 4 Sätze von entsprechenden &quot;Rückgewinnung Testproben&quot; durch Spotting 50 ul blank EDTA-Vollblut auf die Filterpapierkarten und Trocknen 2 h. </li><li> Im Folgenden wird sowohl für die QC und blank &quot;Recovery-Testproben&quot;, schneiden Sie die gesamte Blutfleck auf der Filterkarte mit einer Schere und legen Sie die resultierenden Scheiben in eine Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden und Schnappdeckel. </li><li> Extrahieren Sie alle Proben. </li><li> Die Überstände (400 &amp; mgr; l) in Glas HPLC-Ampullen. </li><li> In Tacrolimus-Stammlösung zu den blank &quot;extrahiert Recovery-Testproben&quot;, um Konzentrationen von 2, 4, 20 und 40 ng / ml (4 &amp; mgr; l von 200, 400, 2.000, 4.000 ng / ml Tacrolimus stock Sol erreichenutions bis 400 &amp; mgr; l Überstand). </li><li> Nach dem LC-MS / MS-Analyse, zu vergleichen, die Signale in beide QC Proben und &quot;Recovery Testproben&quot; der entsprechenden Konzentration (Rückgewinnung% = Signalproben versetzt vor der Extraktion / Signalproben versetzt nach der Extraktion x 100). </li></ol></li><li> Dilution Integrität. <ol><li> Herzustellen Verdünnungs Integrität mit dotierten Proben mit den Analyten bei 500, 250 und 100 ng / ml. </li><li> Nach der Extraktion, verdünnte Proben unter Verwendung von Protein-Fällungslösung (1.10, n = 3 pro Konzentrationsstufe). </li><li> Berechnen Sie Abweichungen von den Nennkonzentrationen. Betrachten Sie Ergebnisse, die innerhalb von 85% -115% der Nenn akzeptabel fallen. </li></ol></li><li> Stabilitäten. <ol><li> Untersuchen Stabilitäten Verwendung der QC-Proben an allen vier Konzentrationsstufen (n = 4 pro Konzentration) analysiert zu verschiedenen Zeitpunkten und unter unterschiedlichen Lagerbedingungen. </li><li> Ergebnisse nach Lagerung mit den Sollwerten zu vergleichen. Betrachten rrgebnisse, die innerhalb 85% -115% der Nenn akzeptabel fallen. </li><li> Stellen Sie die Probenstabilität für 1 Woche bei Raumtemperatur, 1 Woche bei 4 ° C, 1 Monat bei -20 ° C und 1 Monat bei -80 ° C. </li><li> Test Gefrier-Tau-Stabilität über drei Zyklen (-20 ° C). Test extrahierten Probe und Autosampler-Stabilität, indem Proben in den thermostatisierten Autosampler auf 4 ° C eingestellt. Injizieren Proben nach 72 h. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Obwohl, wie oben erwähnt, ist das Konzept der therapeutischen Arzneimittel und Einhaltung Überwachung der Tacrolimus auf Basis von Trockenblut attraktiv, es gibt analytische Herausforderungen, die über die in der Regel mit der LC-MS / MS-Analyse von Tacrolimus im venösen EDTA-Vollblut-Proben verbunden zu gehen. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die Tatsache, dass die Matrix Kappilarblut in die Baumwolllinters Material des hier verwendeten Filterkarte Materials und der geringen Blutvolumen (20 ul) geträ...

Tacrolimus ist ein potenter immonosuppressant 1-7 die Makrolidstruktur 8 (Figur 1) besitzt. Aufgrund cis - trans-Isomerie der CN Bindungen sie zwei Rotameren in Lösung 9, die durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt werden können bildet (HPLC) Tacrolimus ist lipophil und löslich in Alkoholen (Methanol: 653 g / l, Ethanol: 355 g / L), halogenierte Kohlenwasserstoffe (Chloroform: 573 g / L) und Äther. Es ist in aliphatischen Kohlenwasserstoffen (Hexan kaum löslich: 0,1 g / l und Wasser (pH 3. 0,0047 g / l) 9 Das Molekül keinerlei Chromophor, und das UV-Absorptionsmaximum nicht enthalten, ist 192 nm Tacrolimus über eine Hemmung der Calcineurin wirkt. . Sein Wirkungsmechanismus ist in den Referenzen 10,11 prüft worden. Es ist derzeit in mehr als 80% der Festorgantransplantationspatienten in den Vereinigten Staaten 12 verwendet. Der therapeutische Index von Tacrolimus ist stattd schmalen 13 zu sein. Darüber hinaus ist die Korrelation zwischen Tacrolimus-Dosen und Konzentrationen im Blut arm und Pharmakokinetik ist variabel 14,15. Therapeutische Medikamentenüberwachung auf Tacrolimus Dosierung bei Transplantationspatienten zu führen ist daher allgemeine klinische Praxis 16-20. Das Ziel ist, die Tacrolimus-Blutkonzentrationen innerhalb einer vorgegebenen therapeutischen Bereich zu halten. Tacrolimus-Blutspiegel unter dem therapeutischen Bereich kann in einer erhöhten Aktivität der chronischen oder akuten Allo-Immunreaktionen führen, während die oberhalb des therapeutischen Fensters erhöhen das Risiko für Über Immunsuppression, Krebs und Toxizitäten, wie Nierentoxizität, Neurotoxizität, Bluthochdruck und Diabetes. Hohe pharmakokinetischen intraindividuellen Schwankungen von Tacrolimus kann sich nachteilig auf beiden Transplantationsorgan und das Überleben der Patienten 21,22 sein. Während interindividuelle Variabilität der Pharmakokinetik von Tacrolimus wird hauptsächlich durch CYP3A5-Polymorphismen, Gründe für intraindividuelle verursachtVariabilität beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, Arzneimitteln, krankheits Drogen-und Lebensmittel Wechselwirkungen 14,15 begrenzt. Auch fehlt der Einhaltung der immunsuppressiven Therapie Drogen-Regime ist ein Faktor und ein Hauptgrund für Transplantatverlust 23,24. Diese Überlegungen zeigen, dass häufige Hause therapeutischen Drug-Monitoring und die Einhaltung von Tacrolimus-Vollblutkonzentration kann vorteilhaft sein, um sicherzustellen, dass Patienten Tacrolimus Exposition innerhalb des gewünschten therapeutischen Fenster zu allen Zeiten. Allerdings, die Logistik und die Kosten der häufigeren therapeutischen Drug-Monitoring, wie es der gängigen klinischen Praxis 15 ist unerschwinglich. Einer der Gründe ist, dass der Patient zu sehen, ein phlebotomist, um die erforderliche venöse Blutprobe gezogen haben. Getrocknetes Blut wurden vor kurzem als attraktives Konzept 25-28 entstanden. Nach einer einfachen Finger-Stick, den Patienten sammelt einen Blutstropfen auf einem speziellen Filterpapierkarte und nach der Blutfleck ist dRied, kann es zu einem zentralen Labor zur Analyse von Tacrolimus und einer anderen Immunsuppressivum, dass der Patient möglicherweise gerade unter zugesandt. Dies hat sich auf die Entwicklung von hochempfindlichen und spezifischen LC-MS / MS-Assays zur Quantifizierung von Tacrolimus und anderen Immunsuppressiva in sehr kleinen Blutvolumina, wie beispielsweise Trockenblut (typischerweise 20 &amp; mgr; l Blut) 25,29-43 möglich. Ein weiterer Vorteil ist, dass minimal-invasive, geringes Volumen Probennahme-Strategien wie Trockenblut therapeutischen Drug-Monitoring und pharmakokinetischen Untersuchungen bei Kleinkindern 28 erheblich erleichtern. Tacrolimus wird in der Regel in venösen EDTA-Vollblut 15 gemessen. Gründe sind, dass Tacrolimus weitgehend verteilt in Blutzellen und klinische Studien haben eine bessere Korrelation zwischen Tacrolimus Talspiegel im Blut als im Plasma mit klinischen Ereignissen 15,18 ausgewiesen. Zum Vergleich: Die Analyse tacrolimus in getrockneten Blutflecken auf Kapillarblut, die mit der Filterpapiermatrix eingemischt basiert. Dies stellt Herausforderungen in Bezug auf die Solubilisierung von Tacrolimus und mögliche Interferenzen mit der LC-MS / MS-Analyse. Hier präsentieren wir einen etablierten und validierten Assay basierend auf Homogenisierung der getrocknete Blut vor Ort mittels einer Kugel Mixer in Kombination mit einem High-Flow-Online Spalte Probenvorbereitungsverfahren und LC-MS / MS-Analyse. Bis heute hat dieser Test erfolgreich zur Quantifizierung von mehr als fünftausend Tacrolimus Trockenblut-Proben für die Einhaltung Überwachung in klinischen Studien eingesetzt.

<table><tbody><tr><td>Tacrolimus</td><td>U.S. Pharmacopeial Convention</td><td>1642802</td><td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td></td><td></td>F370002</tr><tr><td>Rote Blutkörperchen</td><td>University of Colorado Hospital</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>University of Colorado Hospital</td><td>W2017130556300Q</td><td></td></tr><tr><td>Aceton CHROMASOLV, HPLC, &ge; 99,9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439126-4 L</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol 99.9%, HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol Optima LC/MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Wasser Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 &ndash; 10 & Mikro; l Pipette, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf Tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash; 100 & micro; l Pipette, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l Pipettenspitzen mit Filter, steril</td><td>Neptune</td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 &ndash; 1.000 &micro; l Pipette, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l Pipettenspitzen mit Filter, steril</td><td>Neptune</td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &mu; l Pipettenspitzen mit Filter, steril</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash; 20 & micro; l Pipette, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf Tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash; 200 &micro; l Pipette, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l Pipettenspitzen mit Filter, steril</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipettenspitzen mit Filter</td><td>Multimax</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipettenspitzen mit Filter, steril</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu; l Einsätze für HPLC-Fläschchen</td><td>Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>Balance PR2002</td><td>Mettler Toledo</td><td>1117050723</td><td></td></tr><tr><td>Waagen AX205 Delta Range</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Homogenizer</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Biofuge Fresco</td><td>Heraeus</td><td>290395</td><td></td></tr><tr><td>Einwegtücher</td><td>PDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>Glasvläschchen, 4 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>Glasfläschchen, 20 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe, Nitril</td><td>Titan Brand Gloves</td><td>44-100S</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Fläschchen, 9 mm, 2 ml, klar</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 9921-13</td><td></td></tr><tr><td>Deckel für HPLC-Fläschchen</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>Nadel, 18 G 1,5</td><td>Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Gestell für Eppendorf Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>Gestell für HPLC-Fläschchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>Stahlperlen 0,9 &ndash; 2 mm</td><td>Weiter Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Aufbewahrungsboxen für Gefrierschränke / Kühlschränke</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Mehrrohr-Vortexer</td><td>VWR Scientific Products</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td><td>GE Whatman&nbsp;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>CTC PAL</td><td>Freund. HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>Binärpumpe, Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Binärpumpe, Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Vakuum-Entgaser, Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G13798</td><td></td></tr><tr><td>Säulenofen&nbsp; Agilent 1290 mit 2 Positionen&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>Thermostatisiertes Säulenfach mit integriertem 6-Wege-Schaltventil</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Vorsäulenpatrone, Zorbax XDB C8 (5 & Mikro; m Partikelgröße), 4,6 & Middot; 12,5 mm</td><td>Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Analysesäule, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 & Mikro; m Partikelgröße), 4,6 & Middot; 150 mm</td><td>Phenomenex</td><td>993967-906</td><td></td></tr><tr><td>Tandem-Massenspektrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>API5000 MS/MS mit TurboIonspray-Quelle</td><td>AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>Massenspektrometrie-Software</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr></tbody></table>

die quantifizierung des immunsuppressivums tacrolimus auf getrocknetes blut mittels lc-ms / ms

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Die Calcineurin-Inhibitor Tacrolimus ist der Eckpfeiler der meisten immunsuppressiven Behandlungsprotokolle nach Organtransplantation in den Vereinigten Staaten. Tacrolimus ist eine geringe therapeutische Droge und als solche erfordert therapeutischen Drug-Monitoring und Dosisanpassung basierend auf seiner Vollblut-Talspiegel. Nach Hause zu therapeutischen Drug-Monitoring und die Einhaltung zu erleichtern, ist die Sammlung von getrockneten Blutflecken ein attraktives Konzept. Nach einer Finger-Stick, sammelt der Patient einen Bluttropfen auf Filterpapier zu Hause. Nachdem das Blut getrocknet ist, es an die analytischen Labor, in dem Tacrolimus wird mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie quantifiziert geschickt wird (HPLC-MS / MS) in Kombination mit einem einfachen Handproteinfällung Schritt und Online-Spaltenextraktion. Für Tacrolimus Analyse wird eine 6-mm-Scheibe aus dem gesättigten Zentrum der Blutfleck ausgestanzt. Der Blutfleck wird mit einer Kugel ein Mixer homogenisiertnd dann Proteine ​​werden mit Methanol / 0,2 M ZnSO 4, die den internen Standard D 2, 13 C-Tacrolimus fällt. Nach dem Vortexen und Zentrifugieren wird 100 ul Überstand in ein Online-Extraktionskolonne injiziert und mit 5 ml / min von 0,1 Ameisensäure / Acetonitril gewaschen (7: 3, v: v) für 1 min. Danach wird das Schaltventil aktiviert, und die Analyten rückgespült auf die analytische Säule (und getrennt unter Verwendung einer 0,1% Ameisensäure / Acetonitril-Gradient). Tacrolimus wird in der positiven Mehrreaktionsmodus (MRM) mit einem Tandem-Massenspektrometer quantifiziert. Der Test ist linear von 1 bis 50 ng / ml. Inter-Assay-Varianz (3,6% -6,1%) und Genauigkeit (91,7% -101,6%) als in 20 Tagen beurteilt treffen Akzeptanzkriterien. Durchschnittliche Extraktion Erholung ist 95,5%. Es gibt keine relevante Übertrag, Matrix-Interferenzen und Matrixeffekte. Tacrolimus ist in getrockneten Blutflecken bei RT und bei +4 ° C für 1 Woche stabil. Extrahierten Proben in derProbengeber sind bei +4 ° C für mindestens 72 Stunden stabil.

Vertreter Ionenchromatogramme einer Blindprobe, versetzt eine Probe, an der unteren Grenze der Quantifizierung und eine Patientenprobe werden in Abbildung 3 dargestellt. Kalibrierungskurven Die untere Detektionsgrenze lag bei 0,5 ng / ml, und die Untergrenze der Quantifizierung, betrug 1,0 ng / ml. Fünfzig ng / ml wurde als die höchste Kalibrator gewählt, da höhere Konzentrationen sind unwahrscheinlich, dass in der Klinik unter normalen Umständen...

Hier beschreiben wir einen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) Assay zur Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus in getrockneten Blutflecken mit einem einfachen manuellen Proteinfällungsschritt und Online-Säulenextraktion.

Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Tacrolimus in getrockneten Blutflecken zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Quantifizierung von Tacrolimus in Blutproben nach intravenöser Blutabnahme besteht darin, dass Patienten selbst Proben entnehmen können: minimalinvasive Probenentnahmestrategien mit geringem Volumen, wie z. B. getrocknete Blutflecken, erleichtern auch die therapeutische Arzneimittelüberwachung und pharmakokinetische Studien bei Kleinkindern. Nach einem einfachen Fingerstich sammelt der Patient einen Blutstropfen auf einer speziellen Filterpapierkarte, und nachdem der Blutfleck getrocknet ist, kann er zur Analyse von Tacrolimus und anderen Immunsuppressiva, die der Patient möglicherweise einnimmt, an ein Zentrallabor geschickt werden.Die Quantifizierung von Arzneimitteln an getrockneten Blutflecken ist durch die Entwicklung hochsensitiver und spezifischer LCM SM S-Assays für die Quantifizierung von Tacrolimus und anderen Immunsuppressiva in sehr kleinen Blutvolumina, wie z.B. getrockneten Blutflecken, möglich geworden. Zuerst werden Stammlösungen in reinem Methanol in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter für Tacrolimus und einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hergestellt. Für D zwei aliquote 13-C-Stammlösungen herstellen und an jedem Extraktionstag bei minus 70 Grad Celsius oder darunter lagern, ein Verhältnis von sieben zu drei Methanol und 0,2 molaren Zinksulfat in Wasser herstellen, um Proteine auszufällen und Tacrolimus zu extrahieren.Die interne Standard-Stammlösung wird in die Fällungslösung versetzt. Legen Sie das Ablaufdatum der Lösung auf 12 Stunden fest. Anschließend werden Stammlösungen von Tacrolimus hergestellt, indem die Stammlösung mit reinem Methanol entsprechend verdünnt wird, um Kalibratoren und Qualitätskontrollproben vorzubereiten.20 Mikroliter der entsprechend verdünnten Stammlösung in EDT geben. Ein Vollblut inkubiert bei 37 Grad Celsius unter sanftem Schütteln in einem Wasserbad für 20 Minuten, um eine homogene Verteilung von Tacrolimus in die zellulären Blutbestandteile zu ermöglichen. Um eine größere Menge an Kalibratoren und Qualitätskontrollproben herzustellen, werden 2000 Mikroliter der entsprechend verdünnten Stammlösung in EDT getaucht.Ein Vollblut inkubiert bei 37 Grad Celsius unter sanftem Schütteln in einem Wasserbad für 20 Minuten, um eine homogene Verteilung von Tacrolimus in die zellulären Blutbestandteile zu ermöglichen. Anschließend aliquotieren Sie die Proben in 1,5-Milliliter-Polypropylenröhrchen mit konischem Boden und aufsteckbaren Deckeln. Nach dem dreistündigen Trocknen der Blutflecken bei Raumtemperatur werden 50 Mikroliter des mit dotierten Vollbluts in die Mitte jedes Kreises auf Filterkarten gespritzt, nachdem die Blutflecken drei Stunden lang getrocknet wurden. Bereiten Sie Tacrolimus-Kalibrierstandards in humanem EDTA-Vollblut bei Tacrolimus-Konzentrationen von 2,5, 5, 10, 25 und 50 Nanogramm pro Milliliter vor.Bereiten Sie eine Blindprobe für die Extraktion vor, wie die Kalibrierstandards mit der Proteinfällungslösung, die nicht den internen Standard D zwei 13 C Tacrolimus enthält. Bereiten Sie anschließend Qualitätskontrollproben in humanem EDTA-Vollblut in Konzentrationen von 0, 2, 4, 20 und 40 Nanogramm pro Milliliter vor. Bereiten Sie auch eine leere Probe vor Nachdem Sie die getrockneten Blutflecken entnommen haben, überprüfen Sie jeden einzelnen visuell, um eine akzeptable Probenqualität und -menge sicherzustellen.Stanzen Sie dann die Mitte des Blutflecks auf der Filterkarte mit einem sechs Millimeter Locher. Legen Sie die Scheiben in 1,5-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden und schnappen Sie die Deckel auf. Geben Sie 20 bis 30 Kugeln in jedes Rohr.Geben Sie anschließend 500 Mikroliter der Proteinfällungslösung in jedes Röhrchen. Homogenisieren Sie die Scheiben in einem Bullet Mixer für eine Minute bei maximaler Geschwindigkeit. Wenn Sie fertig sind, schütteln Sie die Proben bei Raumtemperatur auf einem Mehrröhrenwirbel bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten.Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 GS und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation wird das SNAT in HPLC-Glasfläschchen überführt, die mit einem 300-Mikroliter-Einsatz ausgestattet sind. Zu diesem Zeitpunkt werden 100 Mikroliter des Supernats der extrahierten Probe mit einem Verhältnis von sieben zu drei von 0,1 % Ameisensäure in Wasser und saurem Nitril bei einem Durchfluss von fünf Millilitern pro Minute auf die Extraktionssäule C mit acht Patronen geladen.Danach wird das Schaltventil für eine Minute betätigt, was zu einer Rückspülung der Analyten aus dem Vorkalium auf die Analysesäule führt. Stellen Sie dann das Säulenthermostat auf 65 Grad Celsius ein. Eluieren Sie die Analyten aus der analytischen Säule mit den hier gezeigten Flussraten und dem Gradienten.Verbinden Sie die Analysesäule über die Turbo-Elektrospray-Ionisationsquelle mit einem Tandem-Massenspektrometer. Passen Sie die wichtigsten Parameter des Massenspektrometers gemäß der folgenden Tabelle an. Weisen Sie als Nächstes positive Ionen im Mehrfachreaktionsmodus nach.Um Tacrolimus in den getrockneten Blutflecken zu quantifizieren, vergleichen Sie ihn mit der Kalibrierkurve unter Verwendung der Massenspektrometrie-Software, repräsentative Ionenchromatogramme einer leeren Probe. Eine Probe, die an der unteren Bestimmungsgrenze aufgespießt wurde, und eine Patientenprobe sind hier dargestellt. Eine typische Kalibrierkurve ist hier dargestellt.Der mittlere Korrelationskoeffizient beträgt 0,9994. Die Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse werden hier im Detail dargestellt. Es wurden keine Hinweise auf eine signifikante Ionensuppression oder Ionenverstärkung beobachtet und es wurde keine relevante Verschleppung beobachtet, die zu einer Überschreitung der Peaks führte.15% des Signals an der unteren Bestimmungsgrenze wurden detektiert. Die Integrität der Verdünnung wurde durch Analyse von Proben untersucht, die in Konzentrationen über dem höchsten Kalibrator hergestellt und nach der Extraktion in Proteinfällungslösung verdünnt wurden, um die Zielkonzentrationen zu erreichen. Alle getesteten Verdünnungen erfüllten die Akzeptanzkriterien.Nach einer Woche Lagerung bei Raumtemperatur, einer Woche Lagerung bei vier Grad Celsius und nach einem Monat Lagerung bei minus 20 Grad Celsius waren keine Verluste erkennbar. Darüber hinaus wurden nach einem Monat Lagerung bei minus 80 Grad Celsius nach drei Gefrier- und Auftauzyklen und nach 72 Stunden extrahierter Proben im Autosampler bei vier Grad Celsius keine Verluste beobachtet. Einmal gemeistert, können 20 Proben in weniger als einer Stunde extrahiert werden.Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass der Schlüssel zu einer zuverlässigen Quantifizierung die Qualität des getrockneten Blutflecks ist und dass die Scheibe aus einem vollständig gesättigten Bereich des Filterpapiers gestanzt wird. Die Techniken und der Assay, die in diesem Video gezeigt werden, bieten eine Plattformtechnologie zur Quantifizierung anderer Immunsuppressiva und Medikamente in getrockneten Blutflecken.

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