Name: Direkte Visualisierung der Murine Rücken Cochlear Nucleus für optogenetische Stimulation der Hörbahn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Erfahren Sie eine chirurgische Methode zur direkten Visualisierung des dorsalen Cochlear-Kerns in Mäusen für optogenetische Stimulation. Dieses Protokoll ermöglicht präzisen Zugang für Neurophysiologie-Experimente im zentralen auditorischen System.

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Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch eine Stiftung Bertarelli Zuschuss (DJL), einem MED-EL Zuschuss (DJL) und ein National Institutes of Health Grants DC01089 (MCB) unterstützt.

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren sind in Übereinstimmung mit dem Animal Care und Verwenden Ausschuss der Massachusetts Eye and Ear Infirmary und der Harvard Medical School, die nationalen Tierpflege Richtlinien befolgen, einschließlich Public Health Service Politik über humane Pflege und Verwendung von Labortieren, die durchgeführt ILAR Guide, und das Tierschutzgesetz. Experimentelle Verfahren nachstehend im Detail Exposition der linken DCN aufgeführt. Verwenden Sie sterile Instrumente während der Durchführung Überleben Chirurgie. 1. Primär Kraniotomie und Rücken Cochlear Nucleus Belichtungs <ol><li> Anästhesie <ol><li> Anesthetize einer Maus im Alter von 8-12 Wochen mit einem Gewicht von 18-24 g, Xylazin 20 mg / kg Ketamin 100 mg / kg über eine intraperitoneale Verabreichung. Überprüfen Sie die Anästhesie durch die Überwachung der Herzfrequenz, Atemfrequenz, sowie toe Prise Rückzug Reflex. Platz Tierarzt Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Sobald ausreichend unter Narkose, Rasur Haarüberlagert ter Kopfhaut, um ungehinderten Zugang zu der Operationsstelle zu schaffen. </li></ol></li><li> Chirurgische Positionierung <ol><li> Platzieren Sie die Maus sicher in einer Kleintierstereotaktischen Halterung, an Ort und Stelle durch eine Schnauze Klammer gehalten. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Schnauze Klemme locker genug, um für eine ausreichende Atmung aber fest genug, lassen den Kopf der Maus vollständig zu immobilisieren. Wenn die Maus den Kopf locker ist, ist das Tier wahrscheinlich während der Kraniotomie Teil der Verfahren des Kopfhalters fallen. </li><li> Zeigen auditorischen Hirnstamm-Implantat Elektroden in üblicher Weise, die für die Überwachung der Herzfrequenz ermöglicht. Die Atemfrequenz sollte durch Visualisierung überwacht werden. Beachten Sie, dass die normale Herzfrequenz und die Atemfrequenz wird in Abhängigkeit vom Alter des Maus variieren. </li><li> Ein Thermometer ist auf einer homeothermic Heizdecke platziert und über die Platzierung euthermia gewährleistet ist. </li></ol></li><li> Hautschnitt und Exposition der interparietal und occipital Knochen des Schädels <ol><li> Unter einem Microscopa, stellen ein vertikaler Schnitt durch die Haut ausgehend von der Mittellinie, direkt zwischen der Ohrmuschel und sich bis zum Schwanzteil des Hinterhauptbein. Nach der Mittellinie Hautschnitt, verdrängen die Haut seitlich. Visualisieren Sie die Muskeln für den verließ den hinteren Teil des Schädels. </li><li> Entfernen Muskel über dem linken Scheitel, interparietal und occipital Knochen des Schädels durch Exartikulation der Muskelansätze an ihre jeweiligen Knochen mit einem Skalpell oder Iris Schere. Beachten Sie ein kleines Maß an Blutungen entlang der Schnittmuskel Kanten. Minimieren Sie dies durch sanften Druck mit einem Wattestäbchen für 10-15 Sek. </li></ol></li><li> Kraniotomie darüberliegenden Cochlear Nucleus <ol><li> Identifizieren Sie relevanten Nahtlinien, einschließlich sagittalen und Lambdanähte Linien (Abbildung 1, links). </li><li> Mit Rongeure, machen Sie eine Kraniotomie über die Inkabein, links von der Mittellinie, ~ 2 mm kaudal der Lambda-Naht. Diese Region liegt über dem DCN. </li><li> Following Kraniotomie, beachten Sie eine dünne Schicht der Dura, die das Kleinhirn überlagert. Mit einem Skalpell, entfernen Sie die Dura. (Bild 1, Mitte). HINWEIS: Das Entfernen der Dura kann ein kleines Maß an Blutungen. Dieses Verfahren der Verwendung der Skalpellklinge, um die Dura zu entfernen, ist beabsichtigt, um die Menge des Blutverlustes während der Cerebellum Aspiration, die auf der Hirnoberfläche und undurchsichtig Identifizierung des DCN Pool wird reduzieren. Gesamtblutvolumen von Maus ist ~ 1,5 ml nicht überschreiten soll&gt; als 15%. Wenn die Blutung diesen Betrag übersteigt, sollte die Maus mit mit Flüssigkeit Ergänzung zur Verfügung gestellt werden. </li><li> Entfernen geronnenem Blut überlagert das Kleinhirn mit dem Wattestäbchen. Optional sanft tropfen Kochsalzlösung mit einem Zahnpunkt auf das Kleinhirn, um Blut zu Blut entfernt. </li></ol></li><li> Kleinhirn-Aspiration <ol><li> Verwendung eines 5 Französisch Saug absaugen seitlichen äußersten Abschnitt der linken Cerebellum über der DCN bis der DCN visBuchs (Abbildung 1, rechts). Entfernen etwa 1/4 bis 1/3 des linken Kleinhirn. Das Wahrzeichen neben dem DCN ist die Ampulle des oberen Bogenganges. HINWEIS: Aspiration des Kleinhirns ist der entscheidende Schritt des Protokolls. Gerichtete Streben des Cerebellum meisten erfolgreich durchgeführt, wenn es in einem einzigen Versuch auftritt und nicht mit Mehrfachdurchgänge des Saug da dies zu Blutungen führen. In Ansaugen zu unterstützen, setzen die Brennebene des Mikroskops an der erwarteten Tiefe des CN, die geringfügig distal der Oberfläche der Kleinhirn wird. Einstellen der Brennebene mit dem CN wird Visualisierung verbessern und ein scharfes Bild. </li><li> Nach Aspiration, weitere Blutungen, Liquor (CSF) Aufbau und Kleinhirn Verschiebung auf der DCN erwartet. Vermitteln 0,5 cc steriler Kochsalzlösung schnell in die Kraniotomie Blutgerinnung verhindern. Eine Kombination aus sanften Abtupfen mit einem Zahnpunkt und Absaugung kann dannverwendet, um abzuräumen einen Weg für die direkte Visualisierung des DCN. Nicht direkt an die Oberfläche des DCN. </li></ol></li></ol> 2. Druckmikroinjektion für Virus-vermittelte Gentransfer und chirurgische Wiederherstellung <ol><li> Nachdem der DCN ist frei von überlagernden Blut und CSF und ist deutlich sichtbar, machen Druck Mikroinjektionen in das DCN mit einem 10 &amp; mgr; l Hamilton-Spritze über einen Zeitraum 2 min. </li><li> Einführung der Nadel mit einem Mikromanipulator, bis die Spitze nicht mehr unter der Oberfläche des DCN sichtbar. </li><li> Für eine optimale Leistung verwenden Sie eine 33 oder 34 Gauge-Nadel (verwenden Sie eine gasdichte Spritze mit der 34-Gauge-Nadel) mit einem flachen Kegel, wie 45 °, um stumpfes Trauma zu minimieren und zu lokalisieren, das Injektionsvolumen im DCN, der ein dünner ist und seichten Hirnstruktur (&lt;300 &amp; mgr; m dick). Hinweis: andere Mikroinjektionsinstrumente genutzt basieren. Idealerweise sollte die Injektions Instrument flexibel sein, um für einige geringfügige ben ermöglichend, wenn nötig, direkt gezielt die DCN. Ferner ist, wie die Maus bewegt sich geringfügig, während des gesamten Verfahrens durch die Atmung, sollte das Gerät robust genug sein, um geringe Mengen an Bewegung zu widerstehen. </li></ol> 3. Chirurgische Wieder <ol><li> Unmittelbar nach der Injektion wieder anzunähern, die Haut und lassen Sie die Maus, um per Standard Recovery-Verfahren zu erholen. Verbleibende Cerebellum und Narbengewebe in den Hohlraum durch Absaugen des Kleinhirns verursacht füllen. Ständig Tiere zu überwachen, bis genügend Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Überwachen Sie Herzfrequenz, Atemfrequenz, sowie die Fähigkeit zu ernähren. HINWEIS: Kein Tier, das einer Operation unterzogen wurde, wird in einen Käfig mit anderen Tieren zurückgegeben, bis vollständig erholt. </li><li> Wenn eine Maus fängt an, im Kreis nach der Operation zu gehen (&lt;5% der Fälle), in der Regel 2-4 Stunden nach der Schließung der Hautschnitt, sofort opfern Sie die Maus, wie es würde wahrscheinlich eine schwierige Zeit Fütterung. Tseine Nebeneffekt ist durch Aspiration des Kleinhirns wahrscheinlich. Das Tier sollte bei Schmerzen nach der Operation überwacht und entsprechende Betäubungsmittel sollte der besseren Tier Komfort auf Grund institutioneller Normen werden. Antibiotika kann notwendig sein, wenn Anzeichen einer Infektion. </li></ol> 4. Sekundäre Kraniotomie und Cochlear Nucleus Belichtungs <ol><li> Nach 2-4 Wochen der Heilung und virusvermittelten Gentransfer Inkubation erneut anästhesiert eine vorher injizierten Maus und Schritt 1,1-1,5 optimale Inkubationszeit hängt von der Art des Gens überführt. </li><li> Entfernen Narbengewebe über die Kraniotomiestelle durch eine Kombination von Pinzette, Skalpell und Knochenzangen. </li><li> Nach der Visualisierung der Kraniotomie, identifizieren eine Kombination aus Rest über der DCN Kleinhirn und Narbengewebe. Verwenden Sie einen 5 Französisch Ansaugen darüber liegenden Kleinhirn / Narbengewebe (ähnlich wie das vorherige Kleinhirn Aspiration) anzusaugen. </li><li> Nach Aspiration, erwarten weitere Blutungen, CSF build-up, und die verbleibenden Bits des Kleinhirns. Schnell einzuführen Salzlösung in die Kraniotomie, um die Blutgerinnung zu verhindern. Verwenden Sie eine Kombination aus sanften Zahnpunkt Abtupfen und Absaugung, um den Weg für die direkte Visualisierung des DCN löschen. </li><li> Beachten Sie die Oberfläche des DCN. Führen Optogenetik basierte Physiologie Experimente wie DCN ist jetzt zugänglich. Einführung eines Lichtreizes, zum Beispiel mit einer optischen Faser (2), um eine Optogenetik basierenden Experiment fahren. </li></ol> 5. Histologie <ol><li> Nach Abschluss der Experimente, einschläfern die Maus mit einer Überdosis von Ketamin. Perfundieren der Maus mit normaler Salzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd. </li><li> Entpacken Sie die Hirnstamm aus dem Schädel und Post-fix für 2 Stunden. Cryoprotect den Hirnstamm in 30% Saccharose für 24-48 Std. Abschnitt der Hirnstamm mit einem Standard-Kryostaten mit 60 um-Schnitte. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Papier beschreibt die Technik der direkten Visualisierung des DCN im Mausmodell für die Manipulation des zentralen auditorischen Systems. Das skizzierte Ansatz der direkten Visualisierung bietet erhebliche Vorteile gegenüber dem Haupt Alternative, die stereotaktische Ansätze sind. In erster Linie die direkte Visualisierung des DCN ermöglicht sofortige Bestätigung der Website des Hirnstamms, während stereo Ansätze nicht direkte Visualisierung leisten. In Experimenten, die längere Inkubationszeiten erforderlich mac...

Der Virus-vermittelte Gentransfer zur Umkehrung von Hörverlust konzentrierte sich weitgehend auf das periphere Hörsystem. 1 Für die Cochlea haben die Forscher eine Vielzahl von Verabreichungswegen untersucht, darunter die osmotische Minipumpeninfusion2, mit dem Vektor-Transgen-Komplex getränktes Gelfoam®2 oder der Gelatineschwamm3, die direkte Mikroinjektion4; zahlreiche Gentransfervektoren, darunter Adeno-assoziierte virale Vektoren5,6, lentivirale Vektoren7 und kationische Liposomen2; und die Verbreitung von Gentransfervektoren über das Zielgewebe hinaus2. In jüngster Zeit wurde das Adeno-assoziierte Virus (AAV)-1 in die Cochlea eingeführt, um Taubheit bei Mäusen aufgrund des Verlusts des vesikulären Glutamattransporters-3 zu behandeln. 8 Darüber hinaus wurde kürzlich die Anwendung der Optogenetik im peripheren Gehör beschrieben. 9
Nur wenige Studien haben jedoch den Gentransfer in das zentrale auditorische System untersucht. Der dorsale Cochlea-Kern (DCN) des Hirnstamms enthält Neuronen zweiter Ordnung der Hörbahn. Während Gentransfertechniken im Cochlea-Kern (CN) für eine Vielzahl von Untersuchungen eingesetzt werden können, kann auch der Gentransfer von Opsinen, lichtempfindlichen Proteinen, zum DCN genutzt werden, um optogenetikbasierte experimentelle Techniken zu ermöglichen. Nach dem virusvermittelten Gentransfer eines Opsins, wie z.B. Channelrhodopsin-2 (ChR2), werden die Neuronen des DCN empfindlich gegenüber Lichtreizen. Optogenetischer Gentransfer wurde bereits in mehreren Hirnstammregionen versucht, darunter im retrotrapezoiden Nucleus der Ratte, im Locus coeruleus der Maus, im Colliculus superior des Affen und im ventralen tegmentalen Bereich der Maus. 10-14 Uhr
Kürzlich haben Forscher die Verwendung von Optogenetik im DCN untersucht. 15,16 Das DCN ist der Ort für die Platzierung von auditorischen Hirnstammimplantaten beim Menschen, was es zu einem attraktiven Teil des auditorischen Systems macht, um für translationale Studien an auditorischen Neuroprothesen zu studieren. Angesichts der Lage des DCN ist die chirurgische Exposition jedoch eine Herausforderung. Die hierin beschriebene Technik stellt ein Protokoll für die maximale Exposition des DCN über den Ansatz der hinteren Schädelgrube bereit, um einen viralen Vektorgentransfer und optogenetikbasierte Experimente in einem Mausmodell zu ermöglichen. Frühere Studien verwendeten stereotaktische Mikroinjektion in das DCN mit Channelrhodopsin-2. 16 Stereotaktische Injektionen sind jedoch potenziell weniger genau als Injektionen, die durch direkte Visualisierung durchgeführt werden, insbesondere in einem Zellkern, der so klein und tief entlang des Hirnstamms ist wie der DCN. Transgene Mäuse, die gewebespezifische Proteine im ZNA exprimieren, sind ebenfalls eine attraktive Option und würden einen Gentransfer überflüssig machen. Unser Protokoll für die Exposition des DCN würde auch bei transgenen Mäusen funktionieren, da das DCN für die optische Stimulation direkt exponiert werden müsste. Diese Technik zur chirurgischen Exposition des DCN wurde von früheren Protokollen übernommen, bei denen Aufzeichnungen aus dem Hörnerv und dem Cochlea-Kern in Maus- und Rattenmodellen durchgeführt wurden. 15,17-20 Uhr
Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, eine direkte Exposition gegenüber dem ZN zu ermöglichen, um Gentransfertechniken zu ermöglichen. Genauer gesagt ist der Ansatz sowohl mit der Akut- als auch mit der Überlebenschirurgie kompatibel, und die Vorbereitung kann am selben Tier für nachfolgende neurophysiologische Tests wiederholt werden. Die direkte Veröffentlichung des DCN-Protokolls hat Auswirkungen auf optogenetik- und virusvermittelte Gentransfer-basierte Experimente in anderen Kernen des Hirnstamms.

<table><tbody><tr><td>Stereotaktischer Halter</td><td>Stoelting</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Homöotherme Decke</td><td>Harvard</td><td>507214</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge #11</td><td>Feine chirurgische Instrumente</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Irisschere</td><td>Feine chirurgische Instrumente</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>5 französische Absaugung</td><td>Symmetrie Chirurgische</td><td>2777914</td><td></td></tr><tr><td>Zahnpunkte</td><td>Henry Schein</td><td>100-8170</td><td></td></tr><tr><td>Knochenrongeur</td><td>Feinchirurgische Instrumente</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>10 & micro; l Hamilton Spritze</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>34 Gauge, Nadel</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td>207434</tr><tr><td>Rongeurs</td><td>feine chirurgische Instrumente</td><td>16021-14</td><td></td></tr></tbody></table>

direkte visualisierung der murine rücken cochlear nucleus für optogenetische stimulation der hörbahn

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Untersuchung über die Verwendung von virusvermittelten Gentransfer zu verhaften oder rückwärts Hörverlust hat sich weitgehend auf die Umfangs Hörsystem verbannt worden. Nur wenige Studien haben den Gentransfer mit dem zentralen auditorischen Systems untersucht. Dorsalen cochlearen Nukleus (DCN) des Hirnstamms, die Neuronen zweiter Ordnung der Hörbahn enthält, ist eine potentielle Stelle für einen Gentransfer. In diesem Protokoll wird ein Verfahren zur direkten und maximale Exposition des murinen DCN über einen posterioren Fossa Ansatz demonstriert. Dieser Ansatz ermöglicht entweder akut oder das Überleben der Operation. Nach direkten Visualisierung des DCN, eine Vielzahl von Experimenten sind möglich, einschließlich Injektion in die Opsinen Cochleariskern und nachfolgende Stimulation durch eine optische Faser zu einer Blaulicht-Laser gekoppelt ist. Andere Neuro Experimenten wie elektrische Stimulation und neuronalen Injektor Kurven sind denkbar. Die Höhe der Visualisierungstion und die Dauer der Stimulation erreichbar machen diesen Ansatz für eine Vielzahl von Experimenten.

Teilweise Cerebellar Aspiration den Zugang zu der Cochlear Nucleus Nachdem die Haut und Muskeln, die über dem Schädel sind, Schädeloberfläche Sehenswürdigkeiten wie den koronaren und lamda Nahtlinien entfernt, zeigen die ungefähre Lokalisierung der Kraniotomie. Nach Kraniotomie mit Rongeure wird das Kleinhirn visualisiert. Sorgfältige Absaugung der kleinen Teil des Kleinhirns zeigt Visualisierung des CN, die dann injiziert werden kann (Abbildung 1). <p class="jo...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen chirurgischen Ansatz zu skizzieren, um einen direkten Zugang zum dorsalen Cochlea-Kern in einem Mausmodell zu ermöglichen.

Direkte Visualisierung der Murine Rücken Cochlear Nucleus für optogenetische Stimulation der Hörbahn

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, chirurgisch auf den Cochlearkern in einem Mausmodell zuzugreifen, um auf Optogenetik basierende Experimente durchführen zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst die Maus für eine Kraniotomie vorbereitet und die Haut, das Weichgewebe und der Muskel über der Kopfoberfläche seitlich zurückgezogen werden. Als zweiter Schritt erfolgt eine Kraniotomie am linken Interparietalknochen, etwa zwei Millimeter kaudal zur Lambda-Nahtlinie.Dieser Bereich liegt über dem Cochlearkern. Saugen Sie anschließend mit einem fünf French starken Saugrohr den am weitesten lateral gelegenen Teil des linken Kleinhirns über dem DCN ab. Das Ergebnis zeigt einen freien Blick auf den DCN.Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu unterstützenden Verfahren wie stereotaktischer Führung bestehen darin, eine direkte Visualisierung des Nucleus cochlearis zu erreichen und einen neurologischen Stimulator, beispielsweise eine Lichtquelle oder eine Elektrodenanordnung, auf der Oberfläche des Hirnstamms zu platzieren. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen in den Bereichen der Optogenetik und der Hörphysiologie zu beantworten. Keine Prothese, wie etwa ein Gentherapieansatz, könnte es ermöglichen, den auditorischen Hirnstamm mit ausreichender räumlicher und zeitlicher Auflösung durch Licht zu stimulieren.Nach der Anästhesie einer Maus mit Ketamin und Xylazin über eine intraperitoneale Applikation überprüfen Sie den Zehenquetschreflex und überwachen die Herzfrequenz und Atemfrequenz, um eine ausreichende Anästhesie zu bestätigen. Tragen Sie anschließend Tierarztsalbe auf beide Augen auf, um Austrocknung zu verhindern. Rasieren Sie danach das über der Kopfhaut liegende Haar, um ungehinderten Zugang zur Operationsstelle zu gewährleisten.Danach das Tier in einen stereotaktischen Halter für Kleintiere platzieren. Die Schnauzenklemme so justieren, dass sie locker genug ist, um eine ausreichende Atmung zu ermöglichen, aber fest genug, um den Kopf der Maus vollständig zu immobilisieren. Unter einem Mikroskop einen vertikalen Schnitt durch die Haut führen, beginnend an der Mittellinie direkt zwischen den Ohrmuscheln und bis zum kaudalen Bereich des Okziputs verlaufend.Danach die Haut lateral verschieben. Entfernen Sie mit einem Skalpell oder einer Iris-Schere die Muskeln, die den linken Parietal-, Interparietal- und Okzipitalknochen des Schädels überlagern. Minimieren Sie in der Zwischenzeit Blutungen, indem Sie mit einem mit Watte überzogenen Applikator sanften Druck für 10 bis 15 Sekunden ausüben.Als Nächstes identifizieren Sie die sagittale Naht und die Lambda-Nahtlinie. Verwenden Sie dazu eine Ron-Präzisionspinzette. Führen Sie eine Kraniotomie am linken Schuppenbein etwa zwei Millimeter lateral zur Lambda-Nahtlinie durch.Dieser Bereich liegt über der DCN nach Kraniotomie. Eine dünne Dura-Schicht, die das Kleinhirn bedeckt, sollte sorgfältig beobachtet und mit einer Skalpellklinge entfernt werden. Entfernen Sie das koagulierte Blut mit Wattestäbchen oder tropfen Sie vorsichtig Kochsalzlösung auf das Kleinhirn, um das Blut zu entfernen.Verwenden Sie dann einen fünf French messenden Saugrohr, um den am weitesten lateral gelegenen Teil des linken Kleinhirns über der DCN zu aspirationsunterstützen. Stellen Sie beim Aspirieren die Fokusebene des Mikroskops auf die erwartete Tiefe des Cochlearkerns ein, um die Visualisierung zu verbessern und ein scharfes Bild sicherzustellen. Entfernen Sie etwa ein Viertel bis ein Drittel des linken Kleinhirns.Das Hauptmerkmal neben dem DCN ist das AM des oberen Bogengangs. Nach der Aspiration treten weitere Blutungen, Ansammlung von zerebrospinaler Flüssigkeit und Verschiebung des Kleinhirns am DCN auf; geben Sie schnell Salzlösung in die Kraniotomie ein, um die Blutgerinnung zu verhindern. Verwenden Sie eine Kombination aus vorsichtigem Abtupfen mit einem Zahnarztspitzenpolster und Absaugen, um den Weg zur direkten Sichtbarmachung des DCN freizulegen.Nachdem der DCN deutlich sichtbar ist und frei von überlagerndem Blut und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) ist, führen Sie eine Druckmikroinjektion des Vektors mit einer gasdichten Hamilton-Spritze mit einem Fassungsvermögen von fünf Mikrolitern durch. Verwenden Sie eine Nadel mit 34 Gauge und einer flachen Abschrägung, um stumpfe Traumata zu minimieren und das Injektionsvolumen im DCN zu lokalisieren. Führen Sie die Nadel dann langsam mit einem Mikromanipulator ein, bis die Spitze unterhalb der Oberfläche des DCN nicht mehr sichtbar ist.Beginnen Sie mit der Injektion von 1,5 µL des Vektors. Danach entziehen Sie die Nadel langsam, nähen anschließend die Haut wieder zu und lassen die Maus gemäß dem standardmäßigen Erholungsverfahren genesen. Nach zwei bis vier Wochen Heilung und Inkubation der virusvermittelten Genübertragung, betäuben Sie die vektorinjizierte Maus erneut und entfernen Sie das Narbengewebe über der Kraniotomiestelle.Danach eine Kombination aus verbleibendem Kleinhirn und Narbengewebe identifizieren, die über dem DCN liegt. Mit einer fünf-French-Saugkanüle das darüberliegende Kleinhirn und Narbengewebe absaugen. Nach der Absaugung.Geben Sie Salzlösung schnell in die Kraniotomie ein. Um eine Blutgerinnung zu vermeiden, verwenden Sie eine Kombination aus vorsichtigem Abtupfen mit einem dentalen Punkt und Absaugen, um den Weg für die direkte Visualisierung des DCN freizulegen. Der DCN ist nun zugänglich für die hier gezeigten optogenetischen physiologischen Experimente, bei denen eine Laserfaser direkt auf der Oberfläche des DCN platziert wird. Dadurch ist eine optische Stimulation der Opsin-infizierten DCN mittels einer Serie blauer Lichtpulse an der Oberfläche des infizierten DCN möglich, was zu einer optisch induzierten auditorischen Hirnstammantwort führt.Mithilfe eines Mikromanipulators wird eine mit einem blauen Laserlicht gekoppelte optische Faser direkt auf die Oberfläche des Cochlearkerns platziert und eingeschaltet. Hier können wir gepulstes blaues Licht auf der Oberfläche des Cochlearkerns identifizieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die elektrische Stimulation des Kerns durchgeführt werden, wodurch wir nicht nur akustisch hervorgerufene, sondern auch elektrisch hervorgerufene neuronale Antworten direkt mit den durch optische Stimulation hervorgerufenen vergleichen können.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Kraniotomie und die Aspiration des Kleinhirns vorbereitet und durchführt, um das endgültige Ziel der direkten Visualisierung und Zugänglichkeit des Cochlearkerns zu erreichen.

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Forschung

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Neurowissenschaften

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