Direkte Visualisierung der Murine Rücken Cochlear Nucleus für optogenetische Stimulation der Hörbahn

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Cochlea-Kern in einem Mausmodell chirurgisch zu erreichen, um optogenetikbasierte Experimente zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem die Maus zunächst auf die Kraniotomie vorbereitet und das Weichgewebe und der Muskel der Haut über der Kopfhaut seitlich zurückgezogen werden. In einem zweiten Schritt wird eine Kraniotomie am linken interparietalen Knochen durchgeführt, der etwa zwei Millimeter an der Lambda-Nahtlinie liegt.

Diese Region liegt über dem Cochlea-Kern. Als nächstes wird mit einem fünffranzösischen Saugrohr der laterale größte Teil des linken Kleinhirns über dem DCN abgesaugt. Das Ergebnis zeigt eine freie Sicht auf das DCN.

Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber unterstützenden Methoden wie der stereotaktischen Führung bestehen darin, dass sowohl eine direkte Visualisierung des Cochlea-Kerns erreicht werden kann als auch ein Neuros-Simulator, wie z. B. eine Lichtquelle oder ein Elektrodenarray, auf der Oberfläche des Hirnstamms platziert werden kann. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen sowohl in der Optogenetik als auch in der auditiven Sprache zu beantworten. Keine Prothese, wie sie der Gentransfer kann, ermöglicht es, den auditorischen Hirnstamm mit ausreichender Gesichts- und Zeitauflösung durch Licht zu stimulieren.

Überprüfen Sie nach der Betäubung einer Maus mit Ketamin und Xylazin durch intraperitoneale Verabreichung den Zehenquetschreflex und überwachen Sie die Herzfrequenz und Atemfrequenz, um die richtige Anästhesie zu bestätigen. Tragen Sie dann Tierarztsalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden. Rasieren Sie anschließend das Haar über der Kopfhaut, um einen ungehinderten Zugang zur Operationsstelle zu ermöglichen.

Legen Sie danach die Maus in eine stereotaktische Halterung für kleine Tiere. Stellen Sie die Schnauzenklemme so ein, dass sie locker genug ist, um eine ausreichende Atmung zu ermöglichen, aber fest genug, um den Kopf der Maus vollständig zu fixieren. Machen Sie unter dem Mikroskop einen vertikalen Schnitt durch die Haut, der an der Mittellinie direkt zwischen der Ohrmuschel beginnt und sich bis zum verwöhnten Teil des Hinterhauptbeins erstreckt.

Verschieben Sie dann die Haut seitlich. Entferne die Muskeln, die über den linken Scheitelknochen, interparietalen und okzipitalen Knochen des Schädels liegen, mit einem Skalpell oder einer Irisschere. Minimieren Sie in der Zwischenzeit das Ausbluten, indem Sie mit einem Applikator mit Wattespitze 10 bis 15 Sekunden lang sanften Druck ausüben.

Identifizieren Sie als Nächstes die sagittalen und Lambda-Nahtlinien. Mit einem Paar Ron-Juwelen. Führen Sie eine Kraniotomie am linken interparietalen Knochen durch, die etwa zwei Millimeter an der Lambda-Nahtlinie liegt.

Diese Region liegt über dem DCN nach Kraniotomie. Eine dünne Duraschicht, die über dem Kleinhirn liegt, sollte vorsichtig beobachtet werden, um sie mit einer Skalpellklinge zu entfernen. Entfernen Sie das geronnene Blut mit Wattestäbchen oder tropfen Sie vorsichtig Kochsalzlösung auf das Kleinhirn, um das Blut zu entfernen.

Verwenden Sie dann ein Saugrohr mit fünf französischen Saugrohren, um den lateralen äußersten Teil des linken Kleinhirns zu aspirieren, das zur Unterstützung über dem DCN liegt. Stellen Sie die Brennebene des Mikroskops bei der Aspiration auf die erwartete Tiefe des Cochlea-Kerns ein, um die Visualisierung zu verbessern und ein scharfes Bild zu gewährleisten. Entfernen Sie etwa ein Viertel bis ein Drittel des linken Kleinhirns.

Das wichtigste Wahrzeichen neben dem DCN ist das AM des oberen halbkreisförmigen Kanals. Nach der Aspiration treten weitere Blutungen, die Ansammlung von zerebraler Rückenmarksflüssigkeit und eine Kleinhirnverlagerung auf dem DCN auf, die schnell Kochsalzlösung in die Kraniotomie einträufeln, um eine Blutgerinnung zu verhindern. Verwenden Sie eine Kombination aus sanftem Tupfen mit einer Zahnspitze und Absaugung, um einen Weg für die direkte Visualisierung des DCN freizumachen.

Nachdem das DCN deutlich sichtbar und frei von darüber liegendem Blut und Liquor ist, führen Sie eine Mikrodruckinjektion des Vektors mit einer gasdichten Hamilton-Spritze von fünf Mikrolitern durch. Verwenden Sie eine 34-Gauge-Nadel mit flacher Fase, um stumpfe Traumata zu minimieren und das Injektionsvolumen innerhalb des DCN zu lokalisieren. Führen Sie dann die Nadel langsam mit einem Mikromanipulator ein, bis die Spitze unter der Oberfläche des DCN nicht mehr sichtbar ist.

Beginnen Sie mit der Injektion von 1,5 Mikrolitern des Vektors. Nachdem dies abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel langsam zurück, nähern Sie sich anschließend wieder der Haut an und lassen Sie die Maus sich wie üblich erholen. Nach zwei bis vier Wochen der Heilung und der Inkubation des virusvermittelten Gentransfers wird die vektorinjizierte Maus erneut anästhesiert und dann das Narbengewebe über der Kraniotomiestelle entfernt.

Identifizieren Sie danach eine Kombination aus verbleibendem Kleinhirn- und Narbengewebe, das über dem DCN liegt. Verwenden Sie eine Fünf-French-Saugung, um das darüber liegende Kleinhirn und das Narbengewebe abzusaugen. Dem Anspruch folgend.

Tragen Sie schnell Kochsalzlösung in den Kraniotomie auf. Um Blutululation zu verhindern, verwenden Sie eine Kombination aus sanftem Abtupfen und Absaugen, um den Weg für eine direkte Visualisierung des DCN freizumachen. Das DCN ist nun für die optogenetikbasierten physiologischen Experimente zugänglich, die hier gezeigt werden: Die Platzierung einer Laserfaser direkt auf der Oberfläche des DCN, die eine optische Stimulation der opsin-infizierten DCNA-Blaulichtpulsreihe an der Oberfläche des infizierten DCN ermöglicht, führt zu einer optisch gesteuerten auditorischen Hirnstammreaktion.

Mit Hilfe eines Mikromanipulators wird eine optische Faser, die mit einem Blaulichtlaser gekoppelt ist, direkt auf die Oberfläche des Cochlea-Kerns aufgesetzt und eingeschaltet. Hier können wir gepulstes blaues Licht auf der Oberfläche des Cochlea-Kerns identifizieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die elektrische Simulation des Kerns durchgeführt werden, die es uns ermöglichen, nicht nur die akustisch evozierten, sondern auch die elektrisch evozierten neuronalen Reaktionen direkt mit denen der optischen Simulation zu vergleichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Kraniotomie und die Kleinhirnaspiration vorbereiten und durchführen, mit dem ultimativen Ziel der direkten Visualisierung und des Zugangs zum Cochlea-Kern