Name: Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 3 s
Description: Lernen Sie einen Fisch-Fütterungs-Bioassay zur Bewertung antiprädatorischer Aktivität von Sekundärmetaboliten aus marinen Geweben. Diese Methode liefert experimentelle Evidenz für ökologische Verteidigungsrollen.

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Wir danken James Maeda und Aaron Cooke für die Unterstützung beim Filmen und Bearbeiten dieses Videos. Die Finanzierung erfolgte durch die National Science Foundation (OCE-0550468, 1029515).

HINWEIS: Schritt 3 dieses Protokolls betrifft Wirbeltier Themen. Das Verfahren ist so konzipiert, dass die Tiere erhalten die humane Behandlung möglich und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der University of North Carolina Wilmington zugelassen. 1) Gewebeentnahme <ol><li> Verwenden Gewebe, das in seinem natürlichen Zustand der Flüssigkeitszufuhr und nicht gequetscht, ausgetrocknete oder übermäßig nass ist, da dies die Volumenkonzentration von Sekundärmetaboliten zu ändern. Geschnitten oder hacken Gewebe in Stücke oder Scheiben, die in ein 50 ml Zentrifugenrohr eingeschoben werden kann. Hinweis: Frisches Gewebe kann in einigen Fällen verwendet werden, aber es ist oft besser, schneiden oder hacken gefrorenem Gewebe, das nicht Gegenstand zu quetschen, wenn sie geschnitten. </li><li> Hinzufügen Gewebestücke zu 30 ml einer 1: 1 Mischung von Dichlormethan (DCM) und Methanol (MeOH) in einem graduierten Zentrifugenröhrchen bis zu einem Endvolumen von 40 ml erreicht wird. Achten Sie darauf, alle Schritte, die die Übertragung von durchführenLösungsmittel in einem Abzug bei ausreichender Belüftung verwenden. </li><li> Das Röhrchen verschließen und schwenken es mehrmals, dann während einer 4 Stunden Extraktionsdauer mehrmals schütteln. Hinweis: In dieser Zeit verbindet Wasser mit MeOH und der resultierende MeOH: Wasserphase trennt sich von der DCM-Phase. Das Gewebe wird wechselweise mit DCM und MeOH: Wasser als Emulsion wie die Röhren geschüttelt. </li><li> Übertragen der DCM-Extrakt in einen Rundkolben überführt und verdampft zur Trockne auf einem Rotationsverdampfer unter Verwendung niedriger Wärme (&lt;40 ° C). Mit minimalen Lösungsmittel, überweisen Sie den Trockenextrakt auf eine 20 ml Szintillationsfläschchen. Setzen Sie die Flasche mit einem Rotationsverdampfer Adapter und erneut zur Trockene verdampft auf einem Rotationsverdampfer mit geringer Hitze (&lt;40 ° C). Hinweis: Der nächste Schritt ist die Verwendung eines selbst gemachten Druckinstrument, das durch Einschrauben die folgenden Punkte der Reihe nach auf das Ende einer Gewindestange montiert werden können: (1) Mutter (2) Waschmaschine, und (3) Hutmutter. Die Scheibe muss entweder perforiert oderversehen, so dass er kleiner als der Innendurchmesser eines 50 ml Zentrifugenröhrchens ist. </li><li> Zurückkehrend zu dem graduierten Zentrifugenröhrchen, das Gewebe und das MeOH enthält: Wasserextrakt, quetschen das Extraktionsmittel aus dem Gewebe durch Kompression. Übertragen Sie die MeOH: Wasser-Extrakt auf den gleichen Rundkolben und speichern gekühlt (&lt;10 ° C). </li><li> In MeOH in den Messzentrifugenröhrchen, bis die nun entwässert Gewebe wird für eine zweite Extraktion von 2 bis 6 Stunden Dauer untergetaucht, dann übertragen die neue MeOH zu extrahieren, um den gekühlten Rundkolben mit dem MeOH: Wasser-Extrakt. Wenn es irgendeine Besorgnis, dass das Gewebe nicht vollständig entnommen worden ist, wiederholen die 2 bis 6 h MeOH Extraktion. </li><li> Trocknen Sie den MeOH am Rotationsverdampfer mit geringer Hitze (&lt;40 ° C). Die restliche wässrige Extrakt aus dem Rundkolben zur Szintillationsfläschchen, das das getrocknete unpolaren Extrakt, mit einem minimalen Volumen MeOH, den Rundbodenkolben zu spülen. </li><li> Evaporate des wässrigen Extrakts zur Trockne unter Verwendung niedriger Wärme (&lt;40 ° C) auf einem Vakuum-Konzentrator. Die Szintillationsfläschchen enthält nun die Gesamttrocken rohe organische Extrakt aus 10 ml Gewebe. Evakuieren Sie den Kopfraum der Flasche mit N2-Gas, um Oxidation zu verhindern, dicht schließen und Lagerung tiefgefroren (-20 ° C). </li></ol> 2) Nahrungszubereitung <ol><li> Bereiten gefriergetrockneten Tintenfisch Mantel-Pulver. Hinweis: Squid Mantel stellt eine Nahrungsquelle, die vergleichbar mit der von anderen Makrozoobenthos ist und wird als Bestandteil in den Teilschritten von 2,2 verwendet werden. <ol><li> Gefrorene Tintenfischringe Mantel in warmem deionisiertem (DI) Wasser, dann pürieren in einem High-Speed-Mixer. </li><li> Gießen Sie eine dünne Schicht aus pürierten Tintenfisch Mantel auf ein flaches Backblech und Einfrieren (-20 ° C), dann bricht das Blatt von gefrorenen Kalmaren Püree in kleine Stücke zu gefriergetrocknet werden. </li><li> Lyophilisieren die gefrorene Kalmare Mantel Püree im Anschluss an die Betriebsabläufe des freeze Trockner. </li><li> Pulverisierten das lyophilisierte Stücke squid Mantel Püree in einem Hochgeschwindigkeitsmischer, um ein Pulver zu bilden. </li><li> In einer Abzugshaube, gießen Sie das pulverisierte Tintenfisch Mantel in eine Dreh Mehlsieb und zu sichten, um große Teile des Gewebes aus dem feinen Pulver zu trennen. </li><li> Übertragen Sie die fein pulverisierte Tintenfisch Mantel an einen verschließbaren Behälter. Evakuieren Sie den Behälterkopfraum mit N2-Gas, um Oxidation zu verhindern und Lagerung tiefgefroren (-20 ° C). </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Futtermischung. Hinweis: Bei der Ausführung von mehreren aufeinander folgenden Assays praktisch ~ vorbereiten 100 ml Futtermischung ist es jedoch dieses Rezept kann auf kleinere Volumina skaliert werden, wenn nötig. <ol><li> Kombinieren einer Mischung von 3 g Alginsäure und 5 g gefriergetrocknete squid Mantel-Pulver mit 100 ml entionisiertem Wasser in einem 150 ml Becherglas. Rühre kräftig mit einem Mikrospatel für ein paar Minuten, bis das Pulver vollständig hydratisiert ist, und die Mischung homogen ist. Hinweis: Wenn gewünscht, Lebensmittelfarbe kann zu diesem st hinzugefügt werdenep: es ist einfacher, Farbstoff auf das Nahrungsmittelmischung, die sowohl behandelten und Kontrollmischungen erzeugen wird (Maskierung des natürlichen Pigments der Extrakt in dem Extrakt behandelten Mischung) hinzuzufügen, anstatt zu versuchen, die Farbe des Extraktes behandelten Mischung durch Zugabe überein Farbstoff auf das Kontrollgemisch. Eine grünliche oder bräunliche Lebensmittelfarbe ist oft wünschenswert, keine Pigmente im Rohextrakt zu maskieren. </li><li> Laden genau 10 ml Futtermischung in einen graduierten Spritze. Achten Sie darauf, um den Einschluss von Luftblasen während dieses Prozesses zu vermeiden. </li><li> Nehmen Sie die 20 ml Szintillationsfläschchen mit trockenen rohen organischen Extrakt aus der Tiefkühltruhe. Fügen Sie ein oder zwei Tropfen MeOH, dann rühren den Extrakt zu einer homogenen Mischung mit einem Mikrospatel. </li><li> Entnehmen Sie die eingesetzte 10-ml-Spritze von Lebensmittelmatrix in die 20 ml Szintillationsfläschchen und rühren mit einem Mikrospatel, um den Extrakt behandelten Futtermischung zu homogenisieren. Hinweis: Es kann helfen, die Spritze in kleineren Schritten (dh auswerfen auswerfen 2 ml und homogenisieren, dann r.EPEAT, bis alle 10 ml wurden homogenisiert wurde). </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Assay-Pellets. <ol><li> Lädt ein sehr kleines Volumen der Extraktmischung (~ 1 ml) in eine Spritze aufgezogen und tauchen die Spitze der Spritze in eine Lösung von 0,25 M CaCl 2. Werfen Sie den Inhalt der Spritze, um eine lange, spaghettiartigen Strang zu bilden. </li><li> Nach ein paar Minuten wird der gehärtete Strang, hacken sie in 4 mm lange Pellets auf ein Glas Schneidebrett mit einer Rasierklinge, dann spülen Sie im Meerwasser. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 und 2.3.2 ohne einschließlich Gewebeextrakt, die Kontrolle Pellets zu machen. Achten Sie darauf, die Kontrolle-Pellets mit einem äquivalenten Volumen des Lösungsmittels zu behandeln (siehe Zusatz von MeOH zu behandelnde Mischung in Schritt 2.2.3) bis zur Lösungsmittelzugabe steuern. Wenn eine negative Kontrolle gewünscht, um zu bestätigen, dass Test Fisch aus Fütterung abgeschreckt werden, fügen Denatoniumbenzoat in einer Konzentration von 2 mg ml -1 in die Rohkost Mischung 27. </li></ol></li></ol> 3) Die SchmackhaftigkeitBioassays <ol><li> Führen Fütterungstests mit wild gefangenen Gelbphase bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, gehalten in Dreiergruppen in undurchsichtigen seitige Fächer von Labor Aquarien. </li><li> Liefern Futterpellets aus einem Becherglas von Meerwasser mit einer Glaspipette mit einem Gummiball. Hinweis: Es kann ein paar Tage dauern, um Fische zu trainieren, um Essen auf diese Weise erhalten. Ein Anlage Stimulus (zB ein paar Hähne der Pipette auf die Aquarienscheibe), die die Lieferung von Lebensmitteln voran kann hilfreich sein, um die Fische zu trainieren, um die Zugabe von Futterpellets erwarten. </li><li> Scoring-Pellets. Betrachten wir ein Pellet akzeptiert, wenn ohne weiteres durch den Fisch verzehrt. Betrachten wir ein Pellet verworfen wird, wenn nicht nach einer mindestens drei Versuchen durch ein oder mehrere Fische, um sie in ihrer Mundhöhle nehmen gegessen oder wenn das Pellet wird angefahren und nach einer solchen Versuch ignoriert. </li><li> Scoring Proben. Hinweis: Das Testverfahren ist als Flußdiagramm in Figur 1 dargestellten Gruppen von Fischen, die Futteraufnahme verweigern.Steuer Pellets bei jedem Schritt im Protokoll werden nicht weiter berücksichtigt. Es gibt zwei mögliche Ergebnisse von einem einzigen Durchlauf des Tests: Die Probe wird entweder angenommen oder abgelehnt. <ol><li> Beginnen Sie mit einer Steuer Pellet, um zu bestätigen, dass die Gruppe der Fische ist kooperativ. Bieten Sie einen behandelten Pellets. Wenn die Fische nehmen die behandelten Pellets, punkten die Probe als angenommen. Wenn die Fische weisen die behandelten Pellets bieten eine anschließende Kontrolle Pellet zu bestimmen, ob die Fische Fütterung eingestellt. Wenn die Fische nehmen die anschließende Kontrolle Pellet, punkten die Probe als abgelehnt. </li></ol></li><li> Replication. Wiederholen Sie den Testverfahren mit zehn unabhängige Gruppen von Fisch für jeden Extrakt. </li></ol> 4) Bewertung der Bedeutung <ol><li> Bewerten Sie die Signifikanz der Unterschiede in den Konsum von Steuer vs behandelten Pellets mit einer modifizierten Version des Fisher-Test 26. Ändern Sie den Test, so dass die Randsummen für Kontroll- und behandelten Pellets Fest, Behandeln sie beide als Stichproben. Hinweis: Diese bietet p = 0,057 bei 7 Pellets gegessen; daher wird jeder Extrakt als Abschreckung, wenn 6 oder weniger Pellets werden gegessen und schmackhaft, wenn 7 oder mehr Pellets werden gegessen. </li><li> Um die relative Schmackhaftigkeit zwischen Gruppen von Extrakten zu vergleichen sind die mittlere Anzahl von Pellets in jeder Gruppe gegessen. Halten Sie eine Schwelle von 6 Pellets so eine Gruppe von Wiederholungs Extrakte werden als abschreckend, wenn die mittlere Anzahl von Pellets gegessen + Standardfehler (SE) ≤6. Hinweis: In den repräsentativen Ergebnissen, ist die Gruppenzuordnung Arten, so replizieren Auszüge stammen aus verschiedenen Individuen und die relative Schmackhaftigkeit bei den einzelnen Spezies verglichen werden. </li></ol>

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<li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+II.+Assays+with+sea+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).</li>
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<li>Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+for+defensive+synergy+in+Caribbean+sponges%3A+Bad+taste+or+glass+spicules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67(2005).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Das hier beschriebene Verfahren stellt ein relativ einfaches, ökologisch relevanten Laborprotokoll für die Bewertung antipredatory chemische Abwehr in Meeresorganismen. Hier beschreiben wir die wichtigsten Kriterien, die von diesem Satz von Methoden erfüllt werden: (1) Geeignete Raubtier. Das Fütterungstest verwendet den bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, einer der am häufigsten vorkommenden Fische auf Korallenriffe in der Karibik. Die bluehead ist ein Generalist ...

Chemische Ökologie durch die Zusammenarbeit von Chemikern und Ökologen entwickelt. Während der Teildisziplin der terrestrischen chemischen Ökologie gibt es schon seit einiger Zeit, dass der Meeres chemische Ökologie ist nur ein paar Jahrzehnte alt, hat aber wichtige Einblicke in die Evolutionsökologie und Gemeinschaftsstruktur von Meeresorganismen 8.1 zur Verfügung gestellt. Sie profitieren von den neuen Technologien von Tauchen und NMR-Spektroskopie, Organiker schnell erzeugt eine große Anzahl von Veröffentlichungen, die neuartige Stoffwechselprodukte von benthischen wirbellosen Meerestieren und Algen in den 1970er und 1980er Jahren 9. Unter der Annahme, dass sekundäre Pflanzenstoffe muss einen Zweck haben viele dieser Publikationen ist ohne empirische Beweise zugeschrieben ökologisch wichtigen Eigenschaften, neue Verbindungen zu dienen. Etwa zur gleichen Zeit wurden Ökologen auch die Vorteile der Einführung von Tauchen und Beschreibung der Verteilungen und Häufigkeiten von Bodentieren und Pflanzen früher her bekanntbin relativ unwirksam Probenahmeverfahren wie Baggerarbeiten. Die Annahme dieser Forscher war, dass nichts festsitzenden und weichen Körper muss chemisch verteidigt werden Verbrauch von Raubtieren 10 zu vermeiden. In dem Bemühen, den Empirismus zu dem, was sonst beschreibende Arbeiten an Arten Häufigkeiten einzuführen, begannen einige Ökologen Extrapolation chemische Abwehr von Toxizitätstests 11. Die meisten Toxizitätstests ging es um die Exposition der ganze Fische oder andere Organismen, um wässrige Suspensionen von rohen organischen Extrakte der wirbellosen Gewebe, mit anschließender Bestimmung der Trockenmasse Konzentrationen von Extrakten für die Tötung der Hälfte der Testorganismen verantwortlich. Allerdings sind Toxizitätstests nicht emulieren die Art, in der potenzielle Räuber wahr Beute unter natürlichen Bedingungen, und nachfolgende Studien haben keinen Zusammenhang zwischen Toxizität und Schmackhaftigkeit 12-13 gefunden. Es überrascht, dass Publikationen in renommierten Fachzeitschriften verwendet Techniken, die wenig oder gar keine ecological Relevanz 14-15 und dass diese Studien sind immer noch weit zitiert heute. Es ist noch alarmierender zu beachten, dass Studien, die auf Toxizitätsdaten weiterhin veröffentlicht 16-18 werden. Die hier beschriebene Bioassay-Methode wurde in den späten 1980er Jahren entwickelt, um eine ökologisch relevanten Ansatz für die Meeres chemischen Ökologen sorgen zu antipredatory chemische Abwehr zu bewerten. Das Verfahren erfordert ein Modell Raubtier, um eine rohe organische Extrakt aus den Zielorganismus zu einem natürlichen Konzentration in einer ernährungs vergleichbaren Lebensmittelmatrix probieren und bietet Schmackhaftigkeit Daten, die ökologisch sinnvoller als Toxizitätsdaten. Der allgemeine Ansatz zur Bewertung der antipredatory Aktivität der Gewebe von Meeresorganismen enthält vier wichtige Kriterien: (1) eine angemessene Generalist Räuber müssen in Fütterungstests verwendet werden, (2) Bio-Stoffwechselprodukte aller Polaritäten müssen erschöpfend aus dem Gewebe der extrahiert werden Zielorganismus, (3) die Metaboliten muss be an der gleichen Volumenkonzentration in einer ernährungs geeigneten experimentellen Nahrung vermischt als in dem Organismus, aus dem sie entnommen wurden, und (4) das experimentelle Design und statistische Ansatz müssen einen sinn Metrik relativ distastefulness hindeuten. Die unten aufgeführten Verfahren ist speziell auf antipredatory chemische Abwehr in der Karibik wirbellose Meerestiere zu bewerten. Wir beschäftigen die bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, als Modell Raubfische, weil diese Art häufig auf karibischen Korallenriffe und ist dafür bekannt, ein breites Sortiment von Makrozoobenthos 19 kosten. Gewebe aus dem Zielorganismus wird zuerst extrahiert, dann kombiniert mit einer Futtermischung, und schließlich, um Gruppen von T. angeboten bifasciatum zu beobachten, ob sie den Extrakt behandelten Lebensmitteln abzulehnen. Assay-Daten mit dieser Methode haben wichtige Einblicke in die Defensive Chemie mariner Organismen 12,20-21, l bereitgestelltife Geschichte Kompromisse 22-24 und Gemeinschaftsökologie 25-26.

<table><tbody><tr><td>Dichlormethan</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A41220</td><td></td></tr><tr><td>Wasserfreies Calciumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool Wärmeträgerflüssigkeit</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-548-146</td><td>Für Vakuumkonzentrator</td></tr><tr><td>Alginsäure Natriumsalz Hohe Viskosität</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td>154723</tr><tr><td>Tintenfischmantelringe</td><td>N/A</td><td>N/A</td> Kann <td>im Lebensmittelgeschäft gekauft</td></tr><tr><td>werden Denatoniumbenzoat</td><td>Aldrich</td><td>D5765</td><td></td></tr><tr><td>50 ml graduiertes Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Szintillationsfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Gummiknollen für Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Rote Kügelchen für die Pelletabgabe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-27</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Rundkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-067E</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchenadapter für Rotavap</td><td>Fisher Scientific</td><td>K747130-1324</td><td></td></tr><tr><td>Hantelboote</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopspatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Messspritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-53</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Messspritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr></tbody></table>

ein fisch-fütterung labor bioassay die antipredatory aktivität von sekundärmetaboliten aus dem gewebe mariner organismen beurteilen

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Die chemische Ökologie des Meeres ist eine junge Disziplin, die in den 1980er Jahren aus der Zusammenarbeit von Naturstoffchemikern und Meeresökologen hervorgegangen ist, mit dem Ziel, die ökologischen Funktionen von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen zu untersuchen. Das Ergebnis war eine Weiterentwicklung von Protokollen, die die ökologische Relevanz des experimentellen Ansatzes zunehmend verfeinert haben. Hier präsentieren wir die aktuellste Version eines Labor-Bioassays für die Fischfütterung, der es Forschern ermöglicht, die antiprädatorische Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe von Meeresorganismen zu beurteilen. Organische Metaboliten aller Polaritäten werden erschöpfend aus dem Gewebe des Zielorganismus extrahiert und in natürlichen Konzentrationen in einer ernährungsphysiologisch angemessenen Lebensmittelmatrix rekonstituiert. Experimentelle Futterpellets werden einem generalistischen Räuber in Laborfütterungstests präsentiert, um die antiprädatorische Wirkung des Extrakts zu beurteilen. Das hier beschriebene Verfahren verwendet den Blaukopf, Thalassoma bifasciatum, um die Schmackhaftigkeit von karibischen wirbellosen Meerestieren zu testen; Das Design kann jedoch problemlos an andere Systeme angepasst werden. Die mit diesem Laborassay erzielten Ergebnisse sind ein wichtiger Auftakt für Feldexperimente, die sich auf die Fressreaktionen einer ganzen Reihe potenzieller Räuber stützen. Darüber hinaus kann dieser Bioassay verwendet werden, um die Isolierung von fütterungshemmenden Metaboliten durch Bioassay-gesteuerte Fraktionierung zu steuern. Dieser Fütterungs-Bioassay hat unser Verständnis der Faktoren erweitert, die die Verteilung und Häufigkeit von wirbellosen Meerestieren in karibischen Korallenriffen steuern, und kann Untersuchungen in verschiedenen Forschungsbereichen unterstützen, darunter Pharmakologie, Biotechnologie und Evolutionsökologie.

Hier berichten wir über Ergebnisse der biologischen Tests für sechs Arten von gemeinsamen karibischen Schwämmen (Abbildung 2). Diese Daten wurden ursprünglich im Jahr 1995 von Pawlik et al. 12 veröffentlicht und zeigen, die Macht dieser Ansatz für die Unterschiede in der chemischen Abwehrstrategien unter Co-auftretende Taxa Umfrage. Die Ergebnisse wurden als mittlere Anzahl von Futterpellets Standardfehler (SE) für die einzelnen Arten gegessen + wiesen. Fast keine Pellets wurden in T...

Dieser Bioassay verwendet ein Modell Raubfische, die Anwesenheit von Futter Abschreckung Metaboliten aus organischen Extrakte der Gewebe von Meeresorganismen auf natürlichen Konzentrationen mit einem ernährungsphysiologisch vergleichbaren Lebensmittelmatrix zu bewerten.

Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die anti-prädatorische Aktivität sekundärer Metabolite aus den Geweben mariner Organismen zu bewerten. Hallo, ich bin Dr. Joseph Pollock von der University of North Carolina Wilmington, und gemeinsam mit dem Doktoranden Michael Marty, der als Teamleiter bei der Erstellung dieses Videos über die Durchführung von Bioassays zur Prüfung chemischer Abwehrstoffe in den Geweben mariner Organismen fungiert hat, begrüße ich Sie. Wir begannen mit der Entwicklung der Methoden, die Sie gleich sehen werden, Ende der 1980er Jahre.Zu dieser Zeit wiesen Naturstoffchemiker sekundären Metaboliten ökologische Funktionen zu, ohne über experimentelle Belege zu verfügen. Gleichzeitig übertrugen Ökologen Abwehrfunktionen auf Ergebnisse von Toxizitätsprüfungen, die keine ökologische Relevanz besaßen. Hier stellen wir einen Ansatz vor, der darauf ausgelegt ist, die anti-prädatorische Aktivität sekundärer Metaboliten aus Geweben mariner Organismen zu bewerten.Dieser Ansatz erfüllt vier wichtige Kriterien für Fütterungs-Bioassays. Erstens verwenden wir einen geeigneten universellen Räuber. Zweitens extrahieren wir vollständig organische Metaboliten aller Polaritäten aus dem Gewebe.Drittens geben wir diese Metaboliten in ein experimentelles Futter in der gleichen volumetrischen Konzentration wie im Organismus vorgefunden. Und viertens liefert unser experimenteller Ansatz und statistische Vorgehen eine aussagekräftige Metrik, um die relative Geschmacklosigkeit anzuzeigen. Bei diesen Fütterungsversuchen verwenden wir den blauköpfigen Thoma by fossum, einen modellhaften räuberischen Fisch, der für Assays mit Gewebeproben karibischer mariner Wirbelloser geeignet ist, da diese Fischart auf karibischen Korallenriffen verbreitet ist und dafür bekannt ist, eine breite Vielfalt benthischer Wirbelloser zu probieren.Jetzt wird Michael das Protokoll im Detail beschreiben. Zuerst muss das Gewebe extrahiert werden. Geben Sie eine 1:1-Mischung aus Dichlorid, Methan und Methanol in ein graduiertes Zentrifugenröhrchen, bis ein Endvolumen von 30 Milliliter erreicht ist.Schneiden Sie dann Gewebeproben von Ihrem Zielorganismus. Dies kann mit frischem oder gefrorenem Gewebe erfolgen. Wir arbeiten mit Schwämmen, daher zeigt diese Filmdemonstration den orangefarbenen Elefantenohrschwamm, Alus, Plet Roadies.Möglicherweise müssen Sie sehr kleine Gewebestücke schneiden, um das korrekte Volumen zu erhalten. Mithilfe der volumetrischen Verdrängung können Sie exakt 10 Milliliter Gewebe entnehmen, das Gefäß verschließen und umdrehen, dann vier Stunden lang schütteln. Während dieses Zeitraums vermischt sich Wasser mit dem Methanol, und die resultierende Methanol-Wasser-Phase trennt sich von der Dichlormethan-Phase. Das Gewebe wird abwechselnd beiden Extraktionsmedien ausgesetzt, während die Gefäße geschüttelt werden.Nach dieser Extraktionszeit werden sich zwei deutliche Phasen abzeichnen. Die polare Phase aus Methanol und Wasser liegt über der unpolaren Phase aus Chlormethan und wird mittels einer Passerpipette übertragen. Überführen Sie den Dichlormethan-Extrakt aus dem graduierten Zentrifugenröhrchen in einen Rundkolben; das graduierte Zentrifugenröhrchen sollte im Kühlschrank aufbewahrt werden.Befestigen Sie für die nächsten Schritte den Rundkolben an einem Rotationsverdampfer für alle Arbeitsschritte am Rotationsverdampfer. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des Wasserbades unter 40 Grad Celsius bleibt. Trocknen Sie gemäß den grundlegenden Bedienungsanweisungen für den Rotationsverdampfer das Di-chlormethan im Rundkolben und resuspendieren Sie den getrockneten unpolaren Extrakt mit einer sehr geringen Menge Di-chlormethan.Ein leichtes Schütteln oder Schwenken kann helfen, getrocknete Rückstände von den Wänden des Rundkolbens zu lösen. Anschließend wird der Chloromethan-Extrakt vom Rundkolben in ein 20-Milliliter-Scintillationsfläschchen überführt. Statt den Verschluss auf das Scintillationsfläschchen zu setzen, wird ein Rotationsverdampfer-Adapter am Scintillationsfläschchen befestigt und der Inhalt erneut am Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingedampft. Das Scintillationsfläschchen mit dem getrockneten unpolaren Extrakt kann während der nächsten Schritte im Kühlschrank aufbewahrt werden.Zurück zur graduierten Zentrifugenprobe, die das Gewebe und den Methanol-Wasser-Extrakt enthält, verwenden wir ein selbstgebautes Gerät, das das Extraktionsmedium durch Kompression aus dem Gewebe herauspresst. Danach überführen Sie den Methanol-Wasser-Extrakt in den Rundkolben und lagern ihn gekühlt im Kühlschrank. Geben Sie Methanol in die graduierte Zentrifugenprobe, bis das Gewebe bedeckt ist, um eine zweite Extraktion über einen Zeitraum von zwei bis sechs Stunden durchzuführen.Nach Abschluss der zweiten Methanol-Extraktion wird der gek&uuml;hlte Rundkolben aus dem K&uuml;hlschrank entnommen, der Inhalt des Messzentrifgenrohrs wird zusammengepresst, und dieser neue Methanolextrakt in den urspr&uuml;nglichen Rundkolben &uuml;berf&uuml;hrt, der bereits den zuvor gewonnenen Methanol-Wasser-Extrakt enth&auml;lt. Sollte nun die Bef&uuml;rchtung bestehen, dass das Gewebe nicht vollst&auml;ndig extrahiert wurde, kann der zweist&uuml;ndige bis sechsst&uuml;ndige Methanol-Extraktionsschritt wiederholt werden. Der Rundkolben wird anschlie&szlig;end an einen Rotationsverdampfer angeschlossen, und das Methanol wie zuvor abgedampft.Beachten Sie, dass die Temperatur des Wasserbades unter 40 Grad Celsius gehalten werden muss. Der Rundkolben enthält einen wässrigen Extrakt, der mit dem getrockneten unpolaren Extrakt in der 20-Milliliter-Scintillationsflasche vereinigt werden muss. Überführen Sie daher den Inhalt des Rundkolbens in die 20-Milliliter-Scintillationsflasche.Falls erforderlich, das Rundkolben mit einer kleinen Menge Methanol ausspülen, um den restlichen Extrakt vollständig aufzunehmen. Das Szintillationsgefäß enthält nun den getrockneten unpolaren Extrakt sowie den polaren Extrakt. Der polare Extrakt befindet sich jedoch in einem kleinen Flüssigkeitsvolumen in Suspension.Verdampfen Sie den wässrigen Extrakt unter Verwendung eines Vakuumkonzentrators bei geringer Wärmezufuhr bis zur Trockne. Das Szintillationsgefäß enthält nun einen trockenen, rohen organischen Extrakt aus 10 Milliliter Gewebe; blasen Sie das Gefäß mit farblosem Stickstoffgas ab und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius im Gefrierschrank. Um die Schmackhaftigkeit dieser Gewebeextrakte zu testen, müssen diese zunächst in einer Nahrungsgrundlage rekonstituiert werden, die ernährungsphysiologisch vergleichbar mit dem Zielorganismus ist.Ringe aus Tintenfischarm sind eine geeignete Proteinquelle für Bioassays von Wirbellosengewebe und können leicht zu einem lyophilisierten Pulver verarbeitet werden. Um mit diesem Bioassay zu beginnen, gefrorene Ringe aus Tintenfischarm in warmes deionisiertes Wasser geben. Nach dem Auftauen etwas Wasser abgießen und die Ringe in einen Mixer füllen.Mischen Sie gründlich auf hoher Stufe, bis das Tintenfischmantel zu einer viskosen Flüssigkeit wird. Geben Sie Wasser hinzu, falls das Material zu dickflüssig zum Mischen ist. Gießen Sie eine dünne Schicht der verflüssigten Tintenfischhülle auf ein flaches Backblech und verteilen Sie sie gleichmäßig. Legen Sie das Backblech bei minus 20 Grad Celsius in die Gefriertruhe. Die gefrorene Tintenfischplatte muss in kleinere Stücke zerbrochen werden, um den Lyophilisierungsprozess zu erleichtern. Kleinere Stücke sind besser, da sie schneller austrocknen.Im Gefriertrockner. Geben Sie die zerbrochenen Stücke des gefrorenen Tintenfischs in die Kammer und befolgen Sie die Bedienungsanweisungen für den Gefriertrockner. Nach der Lyophilisierung müssen die Tintenfischstücke pulverisiert werden.Dies kann mit einem Mixer erfolgen. Geben Sie die getrockneten Tintenfischstücke in den Mixer und mixen Sie bei hoher Stufe, bis das Material als einheitliches Pulver erscheint. Der nächste Schritt sollte in einer Abzugshaube durchgeführt werden, um die Einatmung von partikulärem Tintenfischstaub zu reduzieren.Geben Sie das gefriergetrocknete Tintenfischpulver in einen rotierenden Blütensieb. Halten Sie ein Behältnis unter dem Sieb, um das durch die Siebmasche fallende Pulver aufzufangen. Drehen Sie den Kurbelgriff, um das gefriergetrocknete Tintenfischmaterial zu sieben.Große Stränge aus Bindegewebe, die in vorherigen Schritten nicht ausreichend zerkleinert wurden, verbleiben im Sieb, wodurch ein feineres Pulver erhalten wird. Falls erforderlich, unter Verwendung eines Trichters das gefriergetrocknete Tintenfischpulver in einen verschließbaren Behälter überführen, mit farblosem Stickstoffgas spülen und bei minus 20 Grad Celsius eingefroren lagern. Nachdem das gefriergetrocknete Tintenfischmantelpulver hergestellt wurde, können wir nun eine Charge der Testnahrungsmischung ansetzen. Bei der Durchführung mehrerer aufeinanderfolgender Assays am selben Tag ist es praktisch, eine größere Menge der Nahrungsmischung anzurühren.Hier demonstrieren wir den Herstellungsprozess für eine Mischung mit einem Volumen von 100 Millilitern, wobei mit einem sauberen Waageschiffchen drei Gramm Alginsäure und fünf Gramm gefriergetrocknetes Tintenfisch-Mantel-Pulver abgewogen werden. Diese trockenen Bestandteile in ein 150-Milliliter-Becherglas geben und anschließend Wasser hinzufügen. Die trockenen Zutaten mit einem Mikrospatel vorsichtig umrühren, um die Vermischung zu erleichtern.Gebe 100 Milliliter deionisiertes Wasser hinzu und rühre kräftig um. Es kann einige Minuten dauern, bis das Pulver vollständig hydratisiert ist. Stellen Sie sicher, dass eine homogene Mischung vorliegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.Wenn Sie die Nahrungsmatrix einheitlich einfärben möchten, fügen Sie zu diesem Zeitpunkt den Farbstoff hinzu. Befüllen Sie eine kalibrierte Spritze exakt mit 10 Milliliter der Nahrungsmischung. In diesem Schritt ist die volumetrische Genauigkeit von größter Bedeutung, weshalb Sie äußerst sorgfältig darauf achten sollten, die Einschließung von Luftblasen zu vermeiden.Entfernen Sie die 20-Milliliter-Scintillationsflasche mit trockenem, rohem organischen Extrakt aus dem Gefrierschrank und geben Sie einen oder zwei Tropfen Methanol hinzu. Geben Sie nicht zu viel Methanol hinzu. Dies verhindert, dass die Lebensmittelmatrix aushärtet.Unter Verwendung eines Mikrospatels und minimalem Lösungsmittel den Extrakt zu einer homogenen Mischung resuspendieren. Dabei sicherstellen, dass die Wände des Gefäßes abgekratzt werden, um eine vollständige Resuspension des gesamten Extrakts zu gewährleisten. Die Spritze mit 10 Milliliter Nahrungsmatrix in das 20-Milliliter-Scintillationsgefäß mit dem resuspendierten homogenisierten Extrakt injizieren.Rühren Sie diese Mischung mit dem Mikrospatel, bis sie homogen ist. Geben Sie ein sehr geringes Volumen der Extraktmischung auf. Ein Milliliter ist ausreichend in eine Spritze. Stellen Sie die Spritzenkuppe in eine Lösung aus 0,25 molarer Calciumchloridlösung und pressen Sie den Inhalt der Spritze aus, um einen langen, spaghettiförmigen Strang zu bilden. Der Strang härtet in dieser Lösung aus. Nach einigen Minuten entfernen Sie den gehärteten Strang und legen ihn auf ein Glas-Schneidebrett.Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Strang in vier Millimeter lange Pellets zu zerkleinern. Sammeln Sie die mit Extrakt behandelten Pellets und spülen Sie sie mit Meerwasser ab. Zur Herstellung von Kontrollpellets.Verfolgen Sie dieses Verfahren ohne Zugabe eines Gewebepulvers. Die Zugabe von Lebensmittelfarbe kann erforderlich sein, um die Farbe der Kontroll- und behandelten Pellets anzugleichen. Um eine negative Kontrolle herzustellen, die die Fische mit Sicherheit nicht fressen werden.Fügen Sie Deton- und Benzoylpulver der Rohkostmischung in einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter hinzu, wie von Miller und Pollock 2013 beschrieben. Fütterungsassays werden mit wildgefangenen gelbphasigen Blaukopf-RAs Thala durchgeführt; Fum-Fische werden in Gruppen von jeweils drei Tieren in undurchsichtigen Kammern von Laboraquarien gehalten. Ein geeignetes Hilfsmittel zur Verabreichung von Futterpellets ist eine Glaspipette mit Gummibalg.Ein Pellet gilt als akzeptiert, wenn es von den Fischen leicht aufgenommen wird. Ein Pellet gilt als abgelehnt, wenn es nach mindestens drei Versuchen eines oder mehrerer Fische, es in die Mundhöhle aufzunehmen, nicht gefressen wird oder wenn es angeflogen, aber nach einem solchen Versuch ignoriert wird.Ungewillige Fischgruppen, die sich weigern, Kontrollpellets zu fressen, dürfen bei Assays nicht berücksichtigt werden. Dieses Flussdiagramm zeigt das Assay-Verfahren, das in allen Fällen mit einem Kontrollpellet beginnt, um zu bestätigen, dass die Fischgruppe kooperativ ist. Bieten Sie ein behandeltes Pellet an.Wenn die Fische das behandelte Pellet akzeptieren, wird diese Probe als akzeptiert gewertet. Wenn die Fische das behandelte Pellet ablehnen, muss ein anschließendes Kontrollpräparat angeboten werden, um zu bestätigen, ob die Fische mit dem Fressen aufgehört haben. Wenn die Fische das anschließende Kontrollpellet akzeptieren, wird die Probe als abgelehnt gewertet.Jede Probe muss mit 10 unabhängigen Gruppen von Fischen durchgeführt werden. Hier ist ein Beispiellauf dieses Fütterungsassays. Zuerst wird eine Kontrolltablette angeboten, die die Fische akzeptieren.Zweitens wird ein behandeltes Pellet angeboten. In diesem Fall lehnen die Fische das behandelte Pellet ab. Daher muss anschließend ein Kontrollpellet angeboten werden.Die Fische akzeptieren die anschließende Kontrolle, und die Probe kann als abgelehnt bewertet werden. Jede Probe muss mit 10 unabhängigen Fischgruppen durchgeführt werden. Die Signifikanz der Unterschiede im Verzehr von Kontroll- gegenüber behandelten Pellets sollte mit einer modifizierten Version des exakten Fisher-Tests bewertet werden, wie sie von Low und Pollock 2014 vorgestellt wurde.Der Test wird so modifiziert, dass die Randsummen für Kontroll- und behandelte Pellets als festgelegt gelten, wobei beide als Zufallsstichproben betrachtet werden. Dies ergibt einen P-Wert von 0,057, wenn sieben Pellets gefressen werden. Daher gilt ein Extrakt als abschreckend, wenn sechs oder weniger Pellets gefressen werden, und als schmackhaft.Wenn sieben oder mehr Pellets gefressen werden. Bei dem Vergleich der Schmackhaftigkeit zwischen Gruppen von Extrakten sollte die mittlere Anzahl gefressener Pellets verwendet werden, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt wird. Hier berichten wir über die Ergebnisse dieses Bioassays für sechs Arten häufig vorkommender karibischer Schwämme.Diese Daten wurden ursprünglich von Pollock et al. 1995 veröffentlicht und zeigen die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes auf, um Unterschiede in den chemischen Abwehrstrategien zwischen gemeinsam vorkommenden Taxa aufzuklären. Jede Kategorie auf der Y-Achse repräsentiert Extrakte einer einzelnen Schwammart. Mehrere Individuen jeder Art wurden beprobt, extrahiert und getestet, angegeben durch die Zahl in Klammern nach dem Artname.Die Ergebnisse werden als mittlere Anzahl konsumierter Futterpellets angegeben, zusätzlich zum Standardfehler für jede Art. In Assays mit rohem organischen Extrakt aus Alus, Pleth, Pheon, Compressor und Lycine, genannt Foris, wurden fast keine Pellets verzehrt. Im Gegensatz dazu wurden Pellets, die mit Extrakt aus Cali schwammig von Vais hergestellt wurden, konsumiert.Geo Osa und Michel lavis wurden im Assay leicht aufgenommen. Weniger als sechs Pellets wurden für die ersten drei Arten gefressen, sodass diese als signifikant abschreckend angesehen werden können. Im Gegensatz dazu unterschieden sich die nächsten drei Arten nicht signifikant von den Kontrollen und können als schmackhaft betrachtet werden.Die gerade demonstrierten Methoden bieten einen leistungsfähigen Ansatz, um chemische Abwehrmechanismen gegen Prädatoren gemeinsam mit manipulativen Freilandexperimenten und Erhebungen zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Bioassays haben meiner Forschungsgruppe geholfen, die Faktoren zu verstehen, die die Verbreitung und Häufigkeit mariner Wirbelloser auf karibischen Korallenriffen steuern. Wichtig ist, dass diese Methode das Erfordernis ökologischer Relevanz in der Chemischen Ökologie über die Chemische Ökologie hinaus erfüllt.Die Ergebnisse dieser Bioassays können Untersuchungen in verschiedenen Forschungsbereichen beeinflussen, darunter Pharmakologie, Biotechnologie und evolutionäre Ökologie.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

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Letalität Bioassay mit Artemia salina L.

Hier stellen wir eine umfassende Verhaltenstestbatterie vor, einschließlich der neuartigen Aquarien-, Schwarm- und Sozialpräferenztests, um die potenziellen neurotoxischen Wirkungen von Chemikalien (z. B. Methamphetamin und Glyphosat) auf erwachsene Zebrafische mit einem einzigen Tank effektiv zu bestimmen. Diese Methode ist für die Neurotoxizität und die Umweltforschung relevant.

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

Wir beschreiben den Arbeitsablauf und die Datenanalyse eines Screening-Systems zur Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen basierend auf der Vibrationsschreckreaktion des Zebrafischembryos. Das System zeichnet die Bewegungen von Zebrafischembryonen bei Exposition gegenüber einem Vibrationsreiz auf und ermöglicht eine integrierte Bewertung der allgemeinen Toxizität/Letalität und der neuromuskulären Toxizität.

Bewertung der Toxizität von Chemikalien mit einem Zebrafisch-Vibrations-Startle-Response-Screening-System

In dem Artikel wird eine neuartige In-vitro-Methode zur schnellen und sensitiven Bewertung der Toxizität und Ökotoxizität von Schadstoffen vorgeschlagen, die auf der Motilität von Mytilus galloprovincialis-Hämozyten basiert. Die Methode soll zur Entwicklung ethischerer und empfindlicherer toxikologischer und ökotoxikologischer Expositionstests beitragen.

Ein toxikologischer und ökotoxikologischer Assay auf der Grundlage der Beweglichkeit der Hämozyten von Muscheln (Mytilus galloprovincialis)

Lernen Sie einen Fisch-Fütterungs-Bioassay zur Bewertung antiprädatorischer Aktivität von Sekundärmetaboliten aus marinen Geweben. Diese Methode liefert experimentelle Evidenz für ökologische Verteidigungsrollen.

Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen (Video) | JoVE Journal

Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen

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