Name: EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Messung infektiöser Viren in Wasserproben mittels EPA-Methode 1615. Dieses Protokoll nutzt Buffalo-Green-Monkey-Nierenzellen und organische Flockung zur Quantifizierung von Viren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, für die Bereitstellung des in dieser Studie verwendeten Sabin-Poliovirus-Serotyps 3; Mary Jean See, Nancy Schable und Jenifer Jones von der Dynamac Corporation für die Vorbereitung von BGM-Kulturen; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar und Larry Wymer für ihre Beiträge zur Gesamtbewertung der USEPA-Methode 1615; Gretchen Sullivan für technische Hilfe; und lokale private Brunnenbesitzer und Versorgungsunternehmen, die es uns ermöglicht haben, Wasserproben zu sammeln. Obwohl diese Arbeit von der USEPA geprüft und zur Veröffentlichung freigegeben wurde, muss sie nicht unbedingt die offizielle Politik der Agentur widerspiegeln. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten stellt keine Billigung oder Empfehlung zur Verwendung dar.

HINWEIS: Bitte beachten Sie zusätzliche Materialien Abschnitt S1 für eine Liste von Definitionen. Die QS-Verfahren im Zusammenhang mit US-EPA-Methode 1615 sind in der ergänzenden Materialien Abschnitt S2 beschrieben. 1. Filter Elutionsverfahren <ol><li> Erste Elution <ol><li> Platzieren 500 ml gepufferter 1,5% Rindfleischextrakt, pH 9,0, auf Raumtemperatur erwärmt in einem Meßzylinder. Öffnen Sie die Filterpatronengehäuse und fügen Sie eine ausreichende Menge an Rindfleischextrakt die elektro Filter vollständig zu bedecken. Ersetzen Sie das Filtergehäuse Deckel und gießen Sie die verbleibenden Rindfleischextrakt in einen sterilen Becher. </li><li> Nach 1 min Kontaktzeit, vorbei an der Rindfleischextrakt-Lösung in dem Gehäuse zusammen mit dem in der sterilen Becherglas langsam durch den Filter verbleibende einen Druckbehälter oder peristaltische Pumpe. Sammeln Sie das Eluat in einen 2 l Becherglas. </li></ol></li><li> Zweite Elution <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1 zusätzlich 500 ml gepufferte 1,5% Rindfleischextrakt unter Verwendung von, Aber die Kontaktzeit bei Schritt 1.1.2 bis 15 min zu erhöhen. </li><li> Fügen Sie den Rindfleischextrakt aus der zweiten Elution mit dem 2-Liter-Becher, dass von der ersten Elution enthält. In einer sterilen Rührstab in den Becher. </li></ol></li></ol> 2. Organische Flockung Konzentrationsverfahren <ol><li> Sterilisieren eine Kombinationstyp pH-Elektrode mit 0,525% Natriumhypochlorit für mindestens 5 min. Spülen Sie die Elektrode mit sterilem dH 2 O und dann mit 0,05 M Natriumthiosulfat entchloren. Kalibrieren Sie den pH-Messgerät mit pH 4 und 7-Standards. </li><li> Das Becherglas, das Eluat auf einer Rührplatte enthält. Schalten Sie die Platte und erhöhen die Rührgeschwindigkeit bis ein Wirbel gebildet wird. </li><li> Der pH-Wert des Eluats auf 3,5 ± 0,1 langsam durch tropfenweise Zugabe von 1,2 M HCl zu dem Eluat. In der HCl tropfenweise, weil die schnelle Zugabe Virus inaktiviert. Während dieser Zeit wird das Eluat trüb wie ein Niederschlag zu bilden beginnt. </li><li> Reduzieren Sie die Misch speed zu einem langsamen Umrühren und dann weiter den pH-Wert des Eluats auf 3,5 ± 0,1 bei Raumtemperatur für 30 min zu überwachen und zu warten. </li><li> Gießen des ausgefällten Rindfleischextrakt Suspension in eine oder mehrere Zentrifugenflaschen und zentrifugieren für 15 min bei 2.500 × g bei 4 ° C. Entfernen der Flaschen aus der Zentrifuge und entweder ansaugen oder langsam der Überstand dekantiert, den Verlust des pelletierten Niederschlag zu verhindern. Überstand verwerfen. HINWEIS: Es kann unter Rindfleischextrakt viele in der Menge und Qualität der Niederschlag eine beträchtliche Variation sein. Der Niederschlag von einigen viel produziert wird sich auflösen schnell, während die aus anderen Chargen mit Schwierigkeiten löst. </li><li> 30 ml 0,15 M Natriumphosphat auf die Zentrifugenflasche den Niederschlag enthält. <ol><li> Verwenden 0,15 M Natriumphosphat, pH 9,0, für Ausscheidungen von Rindfleischextrakt viele, die innerhalb von 5 Minuten auflösen. Man rührt 10 min nach der Niederschlag vollständig aufgelöst ist, und dann gehen Sie sofort 2,7 Schritt. </li><li> Verwenden, 0,15 M Natriumphosphat, pH 7,0-7,5 für alle anderen Ausfällungen. Rühre 10-15 Minuten auflösen, oder schwieriger Niederschläge, brechen sie mit einem sterilen Spatel auf, indem wiederholt die Lösung nach oben ziehen und nach unten während des Rühren mit einer Pipette, durch den Niederschlag bei 160 Umdrehungen pro Minute auf einem Orbitalschüttler, oder durch eine Kombination dieser Verfahren. HINWEIS: Wenn mehr als eine Zentrifugenflasche verwenden, kombinieren die Niederschläge unter Verwendung von weniger als 30 ml Natriumphosphat und verwenden Sie dann den restlichen Teil der 30 ml, die Flaschen zu spülen, nachdem die Niederschläge in eine Flasche oder Becher zu kombinieren. </li><li> Wenn der kombinierte Niederschlag in einem flachen Boden Zentrifugenflasche ist, einen Rührstab in die Flasche hinzu. Gehen 2.6.5 zu Schritt. </li><li> Wenn der kombinierte Niederschlag in einer Zentrifuge Flasche mit einem konischen Boden ist, überträgt sie in ein kleines Becherglas und fügen Sie dem Becher mit einem Rührstab. </li><li> Stellen Sie die Flasche oder Becher auf einem Magnetrührer, und rühren, bis die precipitate vollständig gelöst hat. </li><li> Re-Sterilisieren einer Kombinationstyp pH-Elektrode mit 0,525% Natriumhypochlorit und entchloren mit 0,05 M Natriumthiosulfat, wie in Schritt 2.1 beschrieben. Kalibrieren Sie den pH-Messgerät mit pH 7 und 10 Standards. justieren langsam den pH-Wert des vollständig gelösten Niederschlag auf 9,0 mit 1 M NaOH und dann rühren für 10 min. </li></ol></li><li> Entfernen Sie den Rührstab und Zentrifuge des gelösten Niederschlag 10 min bei 4,000-10,000 xg und 4 ° C. </li><li> Füllen Sie vorsichtig den Überstand in ein Becherglas, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie einen Rührstab in den Becher und das Pellet verwerfen. </li><li> Das Becherglas auf einem Magnetrührer, und rühren Sie die Lösung. Mit 1,2 M HCl tropfenweise, um den pH-Wert auf 7,0 bis 7,5 einzustellen. </li><li> Filter sterilisieren den Überstand durch Hindurchleiten durch einen Sterilfilter enthält ein Vorfilter, das mit 15 ml von 1,5% Rinderextrakt vorbehandelt wurde, 0,05 M Glycin, pH 7,0-7,5. </li><li> Assayprobe Volume (S) Berechnungen: <ol><li> Verwenden Sie die Gleichung 1 S für alle Testproben mit Ausnahme der Lab Fortified Blank und dem Lab Reagenzblindwert zu berechnen, <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> Gleichung 1 wobei D (Volumen der ursprünglichen Wasseruntersuchende Probe) für das Grundwasser 500 L ist, TSV (Gesamtprobenvolumen) ist das Volumen des Feldes durch die 5-Zoll-elektropositiveren Patronenfilter geleitet Probe vom Labor erhalten und FCSV (Final Konzentrierte Probenvolumen) nach Filtration wird das Volumen in Schritt 2.10. Ein Beispiel ist in ergänzenden Materialien Abschnitt S4.1 gezeigt. </li><li> Berechnen S für das Labor Fortified Blank (LFB, dh eine positive Qualitätskontrolle mit gesäten analysenreinem Wasser) und dem Labor Reagenzblindwert (LRB, dh eine negative Qualitätskontrolle unter Verwendung von analysenreinem Wasser) durch die FCSV multipliziert mit 0,3. </li></ol></li><li> Teilen Sie die FCSV in dree subsamples. <ol><li> Bereiten subsamples 1 und 2 mit einem Volumen gleich dem 1,04 - fachen der Assay Probenvolumen. Gefriert diese Teilproben bei oder unter -70 ° C, wenn sie nicht die gesamte kultivierbare Virus-Assay analysiert werden können unter Verwendung von (Subsample 1, Schritt 4) oder verarbeitet für die molekulare Assays (nicht dargestellt) innerhalb von 24 h; Andernfalls halten bei 4 ° C. </li><li> Einfrieren des Restvolumens (Subsampling 3) bei oder unter -70 ° C. </li></ol></li><li> Berechnen Sie die Inokulum Volumen durch die S dividiert durch 10. </li></ol> 3. Gesamt kultivierbaren Virus Quantal Assay Hinweis: Für alle Schritte immer Lösungen hinzufügen sorgfältig Störung der Zellschicht zu vermeiden. <ol><li> Dekantieren oder absaugen Medien von Testgefäßen eine Monoschicht von BGM-Zellen bei 3-6 Tage nach der Spaltung enthält, und dann ein Volumen von ausgeglichener Salzlösung gleich den Medien entfernt hinzuzufügen. </li><li> Dekantieren oder die ausgewogene Salzlösung aus der Zellkultur te aspirierenst Gefäße verwendet werden und dann die Zellkultur-Testgefäße impfen <ol><li> Impfen 10 Testgefäße für jede Testprobe mit einem Volumen von Substichprobe 1 gleich dem Inokulum Volumen zusammen mit der gesamten kultivierbaren Virus quantal Testkontrollen (ergänzende Materialien Abschnitt S2.4). </li><li> Für die LFB und dem Lab Befestigte Probenmatrix (LFSM, dh ausgesät Wassermatrixprobe), bereiten 5-, 25- und 125-fachen Verdünnungen unter Verwendung von Unterabtastungs 3 und 0,15 M Natriumphosphat, pH 7,0-7,5 als Verdünnungsmittel. Ein Beispiel für ein Verfahren, um die Verdünnungen zur Herstellung wird in ergänzenden Materialien Abschnitt S3 gegeben. Impfen 10 gewaschen Zellkulturtestgefäße für jede Verdünnungsreihe 3.2.1 Inokulum Volume auf jedem Testgefäß zusätzlich zu den Gefäßen beimpft mit unverdünntem Subsample in Schritt 1 verwendet wird . </li><li> Für jede Testprobe von Schritt 3.2.1 (andere als die geimpft in Schritt 3.2.2), die CPE in allen 10 Wiederholungen nach 14 Tagen der Inkubation hat (siehe Schritt 3.3), prepare 5-, 25- und 125- und 625-fachen Verdünnungen von Substichprobe 3. Inoculate 10 gewaschen Zellkulturtestgefäße für jede Verdünnungsreihe ein Inokulum Volume auf jedem Testgefäß zusammen mit einem neuen Satz des gesamten kultivierbaren Virus quantal mit Testkontrollen (ergänzende Materialien Abschnitt S2.4). </li><li> das Inokulum über die Oberfläche der Zellmonolayern verteilen, indem die Gefäße hin und her kippen. Inkubieren Sie die Testgefäße bei Raumtemperatur für 80 bis 120 min auf einem mechanischen Schüttler bei 1-5 Schwingungen / min oder mit alle 15-20 min von den Gefäßen rocking jeder Virus zu ermöglichen anwesend Zellen zu adsorbieren. </li><li> In vorgewärmten Erhaltungsmedium, und dann brüten die Testgefäße bei 36,5 ± 1 ° C. </li></ol></li><li> Geben Sie für das Auftreten von CPE in jedem Testgefäß mit einem Mikroskop täglich für die ersten 3 d und anschließend untersuchen sie alle 2-3 Tage bis zum Tag 14. Übertragung alle Testgefäße, die ≥75% CPE zu einem Gefrierschrank zeigen auf oder eingestelltunter -70 ° C. Frieren Sie alle verbleibenden Kulturen und die gesamten kultivierbaren Virus quantal Testkontrollen bei oder unter -70 ° C, nachdem die Gefäße am letzten Tag der Prüfung. </li><li> Auftauen alle Kulturen und filtern ≥15% des Mediums aus jeder CPE-positiven Testgefäß durch ein 0,2 um Sterilfilter. Wenn das angegebene Volumen nicht durch den Filter aufgrund einer Verstopfung, zentrifugieren, das Medium für 10 min bei 1,500-18,000 xg und 4 ° C vor der Filtration übergeben werden. </li><li> Führen Sie einen zweiten Durchgang aller 1. Durchgang Testgefäße mit gewaschenen BGM Testgefäße. <ol><li> Impfen der neuen Testgefäße mit einer Impfung Volumen, das 10% des aufgetauten Medium von allen negativen Testgefäße und aus dem gefilterten Mediums aus positiven Gefäße darstellt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4-3.4.3, aber frieren jede Testgefäß , das am 1. Durchgang und positiv am 2. negativ war , wie in Schritt 3.3 beschrieben. Führen Sie einen 3. PassAlter als für den 2. Durchgang beschrieben nur die negativen Testkontrollen und Zellkulturen , die während des 1. Durchgang und positiv in der 2. Passage negativ waren. </li></ol></li><li> Identifizieren Sie einzelne Testgefäße als Virus positiv , wenn sie CPE zeigen sowohl in der 1. und 2. Passagen oder in dem Fall , in dem CPE erst in der 2. Passage auftritt, sowohl in der 2. und 3. Passagen. </li><li> Verwenden Sie USEPA Most Probable Number Rechner mit den Standard - Programmeinstellungen festgelegt , wie in Tabelle S2 gezeigt , um die Virus - Titer aller Testproben zu berechnen. <ol><li> Geben Sie die Anzahl der Virus positive Wiederholungs Prüfgefäßen aus Schritt 3.6 für jede Testprobe in den Rechner der MPN / ml Wert (M ml) und die obere (CL uml) und unteren (CL LML) 95% Vertrauensgrenzen / ml - Werte zu bestimmen . </li><li> Obtain der MPN / L - Wert (M L) des entsprechenden Testprobe 2 unter Verwendung der Gleichung. <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> Gleichung 2 M ml ist die MPN / ml Wert in Schritt 3.7, S ist der Assay Probenvolumen und D ist das Volumen der ursprünglichen Wasseruntersuchende Probe. </li><li> Berechnen Sie die obere Vertrauensgrenze / L durch den CL uml Wert für den M mL Wert ersetzt wird . Berechnen Sie die untere Vertrauensgrenze / L durch den CL LML Wert für den M mL Wert ersetzt wird . Eine Beispielrechnung wird in ergänzenden Materialien Abschnitt S4.2 gezeigt. </li><li> Bericht M mL Werte von 0 als ≤ 1 / D. Zum Beispiel, ≤ 0,002 MPN / L (≤ 1/500 L) für Grundwasserproben. </li><li> Berechnen Sie die MPN und 95% Vertrauens Grenzwerte für die einzelnen Lab Befestigte Blank und Lab ReAgent Blank , indem zuerst die Werte / ml in den Rechner durch S erhalten multipliziert und dann um 0,3 das Ergebnis geteilt wird . </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li>
<li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li>
<li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlass%2C+RI+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+surveillance--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Surveill.+Summ%22%5BJournal%5D)">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li>
<li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+infections%3A+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Pediatr.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li>
<li>Abzug, M. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbzug%2C+MJ+%22Hot+Topics+in+Infection+and+Immunity+in+Children%22">Hot Topics in Infection and Immunity in Children</a>. Finn, A., Pollard, A. J. , Springer. (2008).</li>
<li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths+from+norovirus+among+the+elderly%2C+England+and+Wales%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li>
<li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+J.+Med%22%5BJournal%5D)">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li>
<li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+murine+norovirus%2C+feline+calicivirus%2C+poliovirus%2C+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li>
<li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li>
<li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus%2C+Coxsackievirus%2C+Echovirus%2C+and+Murine+Norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li>
<li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W. 3rd, Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , U.S. Environmental Protection Agency, I. (1996).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li>
<li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J. Virus occurrence and health risks in drinking water . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+S+%22Information+Collection+Rule+Data+Analysis%22">Information Collection Rule Data Analysis</a>. McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. , AWWA Research Foundation and American Water Works Association. 437-462 (2002).</li>
<li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+RJ+%22Microbial+monitoring+of+vulnerable+public+groundwater+supplies%22">Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies</a>. , American Water Works Association. Denver, CO. (2002).</li>
<li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li>
<li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee%2C+wisconsin%2C+collected+august+1994%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li>
<li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

USEPA - Methode 1615 wurde während der ungeregelten Contaminant Überwachung Verordnung des dritten Überwachungszyklus (UCMR3) 17 und in erster Linie für den Einsatz entwickelt zur Messung der Virus Auftreten im Grundwasser. Es teilt sich eine Reihe gemeinsamer Schritte mit der Informationssammlungsregel (ICR) Methode, 15,18 aber hat zwei kleine Unterschiede. Beide verwenden quantal Assays Virus, das CPE produzieren auf BGM-Zellmonolayern mit Quantifizierung basiert auf Most Probable Number (MPN) Berechnungen zu messen. Verfahren 1615 erlaubt die Verwendung eines neueren elektro Filter für Virus aus verschiedenen Wasser Matrices konzentriert und reduziert die Anzahl von Zellkultur Prüfgefäß repliziert pro Verdünnung von 20 bis 10. Sowohl kleinere Änderungen Gesamtverfahren Kosten zu senken. Die Verringerung der Anzahl der Wiederholungen verringert Arbeit, sondern führt zu einer geringfügig niedrigeren Nachweisgrenze. Obwohl Grundwasser niedrigere Konzentrationen des Virus zu erwarten ist als die Oberflächengewässer, 19,20 the Menge getestet der Probe ist das Fünffache des Oberflächenwassers, für die Unterschiede teilweise kompensiert wird. Die Verwendung von weniger Wiederholungen wird für die meisten Oberflächengewässer angemessen sein, aber einige werden die Probenverdünnung erfordern. Methode 1615 hat mehrere kritische Schritte und Einschränkungen. Rindfleisch Extrakte variieren von Charge zu Charge. Jede Partie sollte für die Wirksamkeit des Virus Elution und die Fähigkeit zur Viruskonzentration durch die sekundären Konzentrationsstufen getestet werden, wie ergänzende Materialien Abschnitt S2.3 ist. Das Verfahren verwendet genaue Formeln für die Menge der Probe auf die Berechnung BGM-Zellkulturen zu inokulieren und Virustiter zu bestimmen. Ungenaue Ergebnisse werden erzeugt, wenn diese Formeln sind nicht streng befolgt. Eine aseptische Technik muss für die Aufrechterhaltung der Zellkulturen verwendet werden. Nicht infizierte BGM-Zellkultur-Steuerelemente, die Not während des Zeitraums von 14 Tagen Inkubation wahrscheinlich zeigen, weisen auf Probleme mit der Zellkultur Wartung. Große Sorgfalt muss auch taken während mit der Inokulation Schritte, das Pipettieren von und Medium neben Zellkulturflaschen Kreuzkontamination zu vermeiden. Die Qualitätskontrollen in ergänzenden Materialien Abschnitt S2 beschrieben sind, müssen streng befolgt werden. Abschnitt S2 bietet auch Ratschläge zur Fehlerbehebung für Qualitätsfragen. Der primäre Mechanismus der Virus Adsorptionsfilter zu elektropositiven ist eine auf die Stärke der positiven Ladung auf dem Filter und der Stärke der negativen Ladung &#39;Virus im Zusammenhang mit seinem isoelektrischen Punkt und dem pH - Wert des Wassers Belastung im Zusammenhang mit Interaktion 21 getestet. Elution von Filter wird auch durch die Stärke dieser Wechselwirkung beeinflusst. Weil sie unter den Virustypen und sogar zwischen Stämmen innerhalb derselben Art, die Elution von den Filtern unterschiedlich ist nicht einheitlich. Dies bedeutet, dass jedes Ergebnis kann die tatsächliche Höhe der Virus in Umwelt Gewässern unterschätzen. Die Verwendung der einzelnen BGM-Zelllinie unterschätzt auch Virus Auftreten. Die Reichweitevon Enterovirus , die CPE in dieser Zelllinie in erster Linie auf Polioviren und Enterovirus B Spezies Serotypen sowie einige Reoviren 14,15,22 begrenzt produzieren kann. Andere infektiöse Virustypen werden nicht erkannt. Poliovirus Einziehungen von Boden und Reagens - Qualität Wasser erfüllt die US - EPA - Methode 1615 Performance Akzeptanzkriterien für beide Leistungsbewertung (PE, dh Wasser ausgesät Reagenzqualität Proben mit Titern unbekannt einem Analysten, die die Leistung des Analytikers vor dem Start werden verwendet , um zu bewerten einer Studie) und LFB Proben (ergänzende Materialien Tabelle S1). Die 58% ige Rückgewinnung aus dem Grundwasser das Kulturverfahren unter Verwendung ist ähnlich wie die von anderen berichtet unter Verwendung von Leitungswasser 23,24. Die mittlere Rückgewinnung aus den LFB Proben von 111% mit einem Variationskoeffizienten (CV) von 100% erfüllt auch die Akzeptanz Verfahren Leistungskriterien, obwohl sie höher sind als die für PE-Proben beobachtet during der ICR. ICR bedeuten Ring Erholung 56% mit einem Variationskoeffizienten (CV) von 92%, während mittlere labor Einziehungen 36-85% variiert (CVs 58-131%; nicht veröffentlichte Daten aus der ICR-PE-Datenbank). Höhere Gewinnungsraten wurden in dieser Studie für niedrige Samen LFB Proben beobachtet als für höhere Samenproben (122 im Vergleich zu 42%). Zu der Zeit, dass die ICR geplant wurde, wurde erwartet, dass PE-Proben niedrigen Startwerte empfangen würden geringere Ausbeute haben, dass Bezieher hoher Samen. beobachtet hier für die LFB Proben, Erholung Poliovirus für ICR PE Proben waren 71% auf, die ähnliche (CV 100%), 54% (CV 69%) und 44% (71% CV) für Saatgut Werte ≤300 MPN, 300- 1500 MPN und&gt; 1500 MPN sind. Es gibt viele Methoden zur Messung infektiösen Virus in Wasserproben 25. Dieses Verfahren ist von Bedeutung in Bezug auf andere Verfahren, die in dem Grad der Standardisierung. Die Standardisierung umfasst nicht nur Qualität und Leistung steuert,sondern verwendet auch definierte Volumina und Formeln, um sicherzustellen, dass alle analytischen Laboratorien das Verfahren identisch durchführen. Ohne Standardisierung ist es schwierig, Ergebnisse in Laboratorien zu vergleichen und somit die Standardisierung ist wichtig, wenn, groß angelegte Studien in mehreren Analyselabors durchzuführen. Mit dem eingebauten in der Normung könnte diese Methode in Zukunft weiter ausgebaut werden, um zusätzliche Virustypen und Zelllinien umfassen. Forschungen im Gange Daten bereitzustellen für die Aufnahme von Adenoviren in die Methode.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Enteroviren sind eine heterogene Gruppe von Viren, die den menschlichen Darm-System zu infizieren, und die über die fäkal-oral übertragen werden. Diese Viren geben Oberflächen- und Grundwasser durch Kläranlage und Klärgrube Abwasser, nicht richtig konstruiert oder gebrochen Klärgruben, kaputte Abwasserleitungen, Mischwassereinleitungen und andere Punkt und Nicht-Punktquellen 1-4. Infektionen des Menschen und Krankheiten von Wasser Viren auftreten durch den Verzehr von kontaminierten oder unzureichend desinfizierte Wasser oder durch Freizeit-Wasserkontakt. Krankheitssymptome können leichte bis schwere Gastroenteritis einzubeziehen; Bindehautentzündung; Fieber; oberen Atembeschwerden; Hand, Maul- und Klauenseuche; Myokarditis; aseptische Meningitis; Enzephalitis; Lähmung; Sepsis 5-8 und Tod 9,10. USEPA-Methode 1615 sieht ein Verfahren vor infektiösen Partikel Enterovirus in der Umwelt- und trinken Wasser zu messen. Diese Gewässer kann ein enthaltenMischung von infektiösen und nicht-infektiösen Virionen, sondern nur die infektiösen Partikel stellen eine potentielle Gefahr für die Gesundheit. Infektiöse Viruspartikel verlieren Infektiosität im Laufe der Zeit in der Umwelt- und trinken Wasser aus dem Verlust von Protein - Kapsid Integrität, Schäden an Nukleinsäuren durch UV - Strahlung aus dem Sonnenlicht, und Schäden aufgrund irgendwelcher Desinfektionsmittel , die 11 bis 13 vorhanden sein können. Die gesamte Prozedur kultivierbaren Virus in dem Verfahren vorgesehen ist, bei der Herstellung von zytopathische Effekte (CPE) in der Buffalo Green Monkey Niere (BGM) Zelllinie basiert. Diese Zelllinie wurde aufgrund seiner weiten Verbreitung in der Umwelt virology Feld gewählt 14,15, obwohl der Bereich von infektiösen Virustypen erkannt werden 15 hauptsächlich auf bestimmte Enteroviren beschränkt. Der Zweck dieses Papiers ist es Methode 1615 die Verfahren zur Elution von fünf Zoll elektropositiveren Patronenfilter, sekundäre Konzentration und Messung der gesamten kultivierbaren Viren zu beschreiben. Eine Auswertung derGesamtverfahren wird in Cashdollar et al. 16 beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Rindfleischextrakt, getrocknetes Pulver</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>Kryoröhrchen</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s ausgewogene Salzlösung</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Mechanische Schaukelplattform</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisationsfilter mit Vorfilter</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisationsspritzenfilter</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>pH Standards</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 oder M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat, 7,5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

epa-methode 1615 messung von enterovirus und norovirus vorkommen in wasser durch kultur und rt-qpcr. ii. insgesamt kultivierbaren virus assay

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Eine standardisierte Methode ist erforderlich, wenn nationale Studien zum Vorkommen von Viren in Umwelt- und Trinkwassern mehrere analytische Laboratorien nutzen. Die Methode 1615 der U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) wurde mit dem Ziel entwickelt, einen solchen Standard für die Messung von Enteroviren und Noroviren in diesen Gewässern bereitzustellen. Das Virus wird mit einem elektropositiven Filter aus Wasser konzentriert, mit Rindfleischextrakt von der Filteroberfläche eluiert und dann durch organische Flockung weiter konzentriert. Hier stellen wir das Protokoll der Methode 1615 für die Filterelution, die Sekundärkonzentration und die Messung der gesamten kultivierbaren Viren vor. Ein Teil des konzentrierten Eluats aus jeder Probe wird auf zehn Replikkolben mit Buffalo Green Monkey-Nierenzellen geimpft. Die Anzahl der Kolben, die zytopathische Wirkungen zeigen, wird verwendet, um die wahrscheinlichste Anzahl (MPN) infektiöser Einheiten pro Liter zu quantifizieren. Die Methode verwendet eine Reihe von Qualitätskontrollen, um die Datenqualität zu erhöhen und Schwankungen zwischen und innerhalb von Laboratorien zu reduzieren. Laboratorien müssen definierte Leistungsstandards erfüllen. Methode 1615 wurde evaluiert, indem die Viruserholung aus Reagenzien und Grundwasser, das mit dem Sabin-Poliovirus Typ 3 besiedelt war, untersucht wurde. Die durchschnittliche Wiederfindung von Polioviren mit dem gesamten kultivierbaren Assay betrug 111 % in Wasser in Reagenzienqualität und 58 % im Grundwasser.

Das Virus wurde von der Quelle Grundwasser von drei Trinkwasseraufbereitungsanlagen konzentriert und ein eigener Brunnen mit elektro Filter. Zwei Probensätze, bestehend aus einem Feldprobe und LFSM Kontrolle wurden von den Kläranlagen zu verschiedenen Gelegenheiten gesammelt, und ein Probensatz wurde aus dem eigenen Brunnen gesammelt. Insgesamt Virus Erholung wurde von einer Pflanze und eine Probe von einem anderen aus der Berechnung ausgeschlossen wurden unter Verwendung von LFSM Proben aus zwei der Pflanzen und der privaten Brunnen (zwei Proben bestimmt, da der MPN-Wert des Saatguts mit jeder Probe verwendet nicht genau wegen ermittelt werden konnte abnorme CPE Ergebnisse unter Wiederholungs Kolben). Bedeuten Poliovirus Erholung von Grundwasserproben gemittelt 58% mit einem Variationskoeffizienten von 79% (2) 16. Kein kultivierbaren Virus wurde in einem der doppelten ungeimpfte Grundwasser Feldproben nachgewiesen. Leistungsmerkmale der Methode wurde auch unter Verwendung von LFB s gemessenspiele geändert durch zwei verschiedene Samen Ebenen verwenden. Es wurde ein &quot;low&quot; Titer von 300 MPN von Poliovirus verwendet wurde, die Leistung auf einem Niveau zu bewerten, weniger als die &quot;Standard&quot; 500 MPN LFB Ebene in USEPA Methode 1615. A &quot;hoch&quot; Titer von 1000 MPN von Poliovirus verwendet Leistung bei der zu testen Pegel der LFSM Kontrolle. Diese Kontrollen in ähnlicher Weise mit einer durchschnittlichen Wiedergewinnung von 111% und einem Variationskoeffizienten von 100% (Abbildung 2). Alle LRB Proben waren negativ , und alle LFB Proben innerhalb der Akzeptanzbereich (ergänzende Materialien Tabelle S1) durchgeführt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> Abbildung 1. Filter Elution. Ein Schema für die Verwendung eines Druckbehälters für Patronenfilter Elution gezeigt. Positive Luftdruck wird verwendet, um Rindfleischextrakt Lösung im Druckbehälter durch das Kassettengehäuse con drückenTaining die elektroPatronenFilter. Eine peristaltische Pumpe kann für den Druckbehälter ausgewechselt werden, wobei der Einlass der Pumpe in den Behälter des Rindfleischextrakt Lösungsaufnahme gelegt. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> Abbildung 2. Mittlere Poliovirus Recovery (%) von Boden und Reagenz-Grade Wasser. Die mittlere prozentuale Ausbeute für Poliovirus vom Boden gezeigt wird ( <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) und analysenreinem Wasser ( <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) Proben. Die zwölf Reagenzqualität Wasserproben umfasste sechs ausgesät mit 300 MPN und sechs ausgesät mit 1000 MPN des Poliovirus. Fehlerbalken stellen Standardfehler.

Hier stellen wir ein Verfahren zur Messung der gesamten kultivierbaren Viren anhand der Buffalo Green Monkey Nierenzelllinie vor. Das Verfahren stellt ein standardisiertes Instrument zur Messung des Vorkommens infektiöser Viren in Umwelt- und Trinkwassern zur Verfügung.

EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Protokolls besteht darin, die Menge infektiöser Viruspartikel in einer Wasserprobe zu bestimmen. Dazu wird eine alkalische Extraktionslösung verwendet, um negativ geladene Viruspartikel von einem elektropositiven Filter abzulösen, der zuvor mit Viren aus Trink- oder Umweltwasser angereichert wurde. Die Anreicherung von Viren auf einem elektropositiven Kartuschenfilter wird im ersten Teil dieser Serie beschrieben.Im zweiten Schritt wird der pH-Wert des Eluats langsam gesenkt, wodurch ein flockiger Niederschlag aus diesen extrahierten Proteinen und im Probenmaterial enthaltenem Virus entsteht. Anschließend wird der Niederschlag durch Zentrifugation gesammelt, in einem Natriumphosphatpuffer gelöst und filtriert, um Bakterien und Schimmelpilze zu entfernen. Danach wird das endgültig konzentrierte Eluat auf Buffalo-Grünaffen-Nierenzellen aufgeimpft, und die Zellen werden 14 Tage lang auf zytopathische Effekte (CPE) hin beobachtet, um eine Virusreplikation nachzuweisen.Um zellgebundene Viruspartikel freizusetzen, werden alle Zellkulturgefäße am Ende von 14 Tagen eingefroren oder sobald die zytopathische Wirkung (CPE) in einem Gefäß 75 % oder mehr beträgt. Nach einer zweiten und dritten Passage zur Bestätigung, dass die CPE auf Virusreplikation zurückzuführen ist, wird ein Programm zur Berechnung der wahrscheinlichsten Zahl (Most Probable Number, MPN) verwendet, um die wahrscheinlichste Zahl pro Liter jeder analysierten Probe zu bestimmen. Letztendlich liefert die gesamte kultivierbare Virusfraktion der EPA-Methode 1615 ein Maß für die Konzentration infektiöser Viruspartikel in der Wasserprobe.Dieser Gesamt-Virus-Test ist nur eine Komponente der EPA-Methode 1615. Die vollständige Methode misst das Vorkommen von Enteroviren und Noroviren in Trink- und Umweltwasser. Alle Virusbefunde können anschließend als Eingabedaten zur Risikobewertung bei der Exposition gegenüber diesen Viren im Trink- und Badewasser verwendet werden.Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es einen einzigen standardisierten Ansatz zur Bestimmung von Viren im Wasser bietet. Der Ansatz basiert tatsächlich auf der 1996 veröffentlichten „Information Collection Rule“-Methode. Das Hauptproblem, das Neueinsteiger bei dieser Methode haben, ist die Aufrechterhaltung einer kontaminationsfreien BGM-Zelllinie und die Deutung von CPE, also zytopathischen Effekten.Shay Fout und ich werden die Illusions- und die organische Flockungsprozeduren demonstrieren, gefolgt von der Zellkultivierungstechnik. Für die erste Elution geben Sie 500 Milliliter gepufferten Rinderextrakt mit 1,5 % bei Raumtemperatur, pH 9,0, in einen Messzylinder. Öffnen Sie dann das Filterkartuschengehäuse und fügen Sie eine ausreichende Menge Rinderextrakt hinzu, um den elektropositiven Filter vollständig zu bedecken.Geben Sie den restlichen Rinderextrakt in ein Becherglas. Setzen Sie den Deckel des Filtergehäuses wieder auf. Nach einer Einwirkzeit von einer Minute leiten Sie mithilfe einer peristaltischen Pumpe und steriler Schläuche die Rinderextraktlösung im Gehäuse sowie die im Becherglas verbleibende langsam durch den Filter.Sammeln Sie das Eluat in einem sterilen 2-Liter-Glaskolben auf. Wiederholen Sie diese Schritte mit weiteren 500 Millilitern gepuffertem 1,5 %igen Rinderextrakt, wobei eine Kontaktzeit von 15 Minuten verwendet wird. Geben Sie den Rinderextrakt aus der zweiten Elution zu dem 2-Liter-Kolben mit dem aus der ersten Elution und fügen Sie einen sterilen Rührstab zum Kolben hinzu.Stellen Sie das Becherglas mit dem Eluat auf ein Rührgerät. Schalten Sie das Gerät ein und erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit, bis sich ein Wirbel bildet. Stellen Sie den pH-Wert des Eluats langsam auf 3,5 ± 0,1 ein, indem Sie 1,2 molare Salzsäure oder HCL tropfenweise hinzufügen.Fügen Sie die Säure tropfenweise hinzu, da eine schnelle Zugabe das Virus inaktivieren würde. Während dieses Vorgangs wird das Eluat trüb, da sich ein Niederschlag bildet. Verringern Sie die Rührgeschwindigkeit auf ein langsames Rühren und überwachen Sie weiterhin den pH-Wert des Eluats, der bei Raumtemperatur 30 Minuten lang bei 3,5 ± 0,1 gehalten werden muss.Danach die ausgefällte Rinderextrakt-Suspension in ein oder mehrere Zentrifugenröhrchen geben und 15 Minuten bei 2.500 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Die Röhrchen aus der Zentrifuge nehmen und das Überstandsvolumen langsam abgießen, um einen Verlust des pelletierten Niederschlags zu vermeiden. Der Überstand kann verworfen werden.Für Rinderextraktchargen, die innerhalb von 5 Minuten löslich sind, 30 Milliliter 0,15 molarer Natriumphosphatlösung, pH 9,0, in die Zentrifugenflasche mit dem Niederschlag geben. Siehe Textprotokoll für Anweisungen zum Auflösen von Niederschlägen, die sich nicht innerhalb von fünf Minuten auflösen. Nach vollständigem Auflösen des Niederschlags 10 Minuten lang umrühren.Entfernen Sie anschließend den Rührstab und zentrifugieren Sie das gelöste Präzipitat 10 Minuten lang bei 4.000 bis 10.000 × g und vier Grad Celsius. Gießen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig in ein Glasbecherglas, ohne den Pellet zu stören. Geben Sie einen Rührstab in das Becherglas und entsorgen Sie den Pellet.Stellen Sie das Becherglas auf einen magnetischen Rührer und rühren Sie die Lösung. Geben Sie 1,2 molar HCL tropfenweise hinzu, um den pH-Wert auf einen Bereich zwischen 7,0 und 7,5 einzustellen. Filtrieren Sie den Überstand steril durch ein Sterilfilter, das ein Vorfiltrelement enthält, das zuvor mit 15 Milliliter gepuffertem 1,5 %igen Rinderextrakt, pH 7,0 bis 7,5, vorbehandelt wurde.Siehe Textprotokoll zur Berechnung des Assay-Probenvolumens oder S für alle Testproben. Berechnen Sie anschließend das Inokulumvolumen, indem Sie S durch 10 teilen. Teilen Sie anhand dieser Berechnungen das endgültige konzentrierte Probenvolumen, also die Probe nach der Filtrationsterilisation, wie im Textprotokoll beschrieben in drei Teilproben auf.Inokulieren Sie 10 Testgefäße, die eine Monolayer von BGM-Zellen enthalten, für jede Testprobe mit dem Volumen der Teilprobe eins, entsprechend dem Inokulumvolumen, zusammen mit den Kontrollen für den quantitativen kultivierbaren Virusnachweis. Für die im Labor angereicherte Blindprobe und die im Labor angereicherte Probenmatrix stellen Sie Verdünnungen im Verhältnis 5-, 25- und 125-fach her, indem Sie Teilprobe drei und 0,15 molares Natriumphosphat, pH 7,0 bis 7,5, als Verdünnungsmittel verwenden. Zusätzlich zu den Gefäßen, die mit der unverdünnten Teilprobe eins inokuliert wurden, inokulieren Sie jeweils 10 gewaschene Zellkultur-Testgefäße für jede Verdünnungsreihe unter Verwendung eines Inokulumvolumens pro Testgefäß.Verteilen Sie das Inokulum über die Oberfläche der Zellmonolagen, indem Sie die Gefäße vor und zurück kippen. Inkubieren Sie die Testgefäße bei Raumtemperatur 80–120 Minuten lang auf einer mechanischen Schüttelplattform mit einer bis fünf Oszillationen pro Minute oder durch Schwenken der Gefäße alle 15 bis 20 Minuten, um eine Adsorption eventuell vorhandener Viren an die Zellen zu ermöglichen. Anschließend fügen Sie den Testgefäßen vorgewärmtes Erhaltungsmedium hinzu, bevor Sie sie bei 36,5 ± 1 °C inkubieren. Suchen Sie in den ersten drei Tagen mit einem Mikroskop nach dem Auftreten von zytopathischen Effekten in jedem Testgefäß und untersuchen Sie diese anschließend alle zwei bis drei Tage bis zum Tag 14. Überführen Sie alle Testgefäße, die mehr als 75 % zytopathische Effekte aufweisen, in einen Gefrierschrank, der auf oder unter minus 70 Grad Celsius eingestellt ist. Nach der letzten Untersuchung der Gefäße am Endtag gefrieren Sie alle verbleibenden Kulturen sowie die Kontrollen des quantitativen kultivierbaren Virus-Assays auf oder unter minus 70 Grad Celsius ein.Dann tauen Sie alle Kulturen auf und filtrieren mehr als 15 % des Mediums aus jedem CPE-positiven Testgefäß durch einen 0,2-Mikron-Sterilfilter. Als nächster Schritt erfolgt eine zweite Passage aller Testgefäße der ersten Passage unter Verwendung von gewaschenen BGM-Nierenzell-Testgefäßen. Hierzu werden die neuen Testgefäße mit einem Inokulationsvolumen beimpft, das 10 % des aufgetauten Mediums aus allen negativen Testgefäßen sowie aus dem filtrierten Medium der positiven Gefäße darstellt.Wiederholen Sie die Schritte, die für die erste Passage durchgeführt wurden, und frieren Sie alle Testgefäße ein, die bei der ersten Passage negativ und bei der zweiten positiv waren. Führen Sie anschließend eine dritte Passage wie bei der zweiten Passage beschrieben durch, wobei ausschließlich die negativen Assay-Kontrollen sowie Zellkulturen verwendet werden, die bei der ersten Passage negativ und bei der zweiten Passage positiv waren. Identifizieren Sie einzelne Testgefäße als viruspositiv, wenn sie in der ersten und zweiten Passage zytopathische Effekte zeigen, oder – falls der zytopathische Effekt erst in der zweiten Passage auftritt – in der zweiten und dritten Passage. Verwenden Sie den Most-Probable-Number-Rechner der U.S. Environmental Protection Agency mit den im Textprotokoll festgelegten Standardprogrammeinstellungen, um die Virustiter aller Testproben zu berechnen. Verwenden Sie anschließend die erhaltenen Werte für die Most Probable Number infektiöser Einheiten pro Milliliter sowie die oberen und unteren Konfidenzgrenzen pro Milliliter, um die Most Probable Number infektiöser Einheiten pro Liter und die entsprechenden Konfidenzgrenzen wie im Textprotokoll beschrieben zu berechnen. Die mittlere prozentuale Rückgewinnung ist für Poliovirus aus Grundwasser- und Reagenzwasserproben angegeben.Die durchschnittliche Rückgewinnung von Poliovirus aus Grundwasserproben betrug 58 % bei einem Variationskoeffizienten von 79 %. In keiner der duplizierten unbesiedelten Grundwasser-Feldproben wurde ein kultivierbarer Virus nachgewiesen. Die Methodenleistung wurde ebenfalls anhand von Lab-Fortified-Blank-Proben ermittelt, modifiziert durch die Verwendung von zwei verschiedenen Besiedlungsstufen. Die zwölf Reagenzwasserproben umfassten sechs Proben, die mit 300 MPN infektiösen Einheiten, und sechs Proben, die mit 1.000 MPN infektiösen Einheiten von Poliovirus besiedelt wurden.Diese Kontrollen zeigten eine ähnliche Leistung mit einer mittleren Wiederfindungsrate von 111 % und einer Variationskoeffizienten von 100 %. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, aseptische Techniken und gute Laborpraktiken anzuwenden, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden. Ebenso wichtig ist es zu beachten, dass bei der Arbeit mit viralen Pathogenen Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Handschuhen getroffen werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Viren verdünnt, elektropositive Filter verwendet und organische Flockungs- sowie Zellkultur-Assays durchführt.Zusätzlich zu diesem Verfahren können Sie auch molekularbiologische Tests durchführen, um weitere Virustypen zu identifizieren und nachzuweisen.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA-Methode 1615 verwendet einen elektropositiven Filter, um Enteroviren und Noroviren in Umwelt- und Trinkwasser zu konzentrieren. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren zur Entnahme von Proben für Analysen nach Methode 1615.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser von Kultur und RT-qPCR. I. Sammlung von Virenproben

Hier stellen wir ein Verfahren zur Quantifizierung von Enteroviren und Noroviren in Umwelt- und Trinkwassern mittels reverser Transkriptions-quantitativer PCR vor. Die mittlere Virusrückgewinnung aus dem Grundwasser mit diesem standardisierten Verfahren der EPA-Methode 1615 betrug 20 % für Polioviren und 30 % für murine Noroviren.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

Es wurde eine auf Makroschaum basierende Probenahmemethode für den Nachweis und die Quantifizierung von Noroviren auf harten Umweltoberflächen entwickelt und evaluiert.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Es wurde ein Ansatz entwickelt, um optimale Viruskonzentrationsbedingungen für Wasserproben mit kleinem Volumen unter Verwendung von Spikes des humanen Adenovirus zu identifizieren. Die hier beschriebenen Techniken werden verwendet, um Konzentrationsparameter für andere virale Ziele zu identifizieren, und werden auf groß angelegte Experimente zur Viruskonzentration angewendet.

Ein kleines Volumen Verfahren für Viral Konzentration von Wasser

Diese Handschrift beschreibt eine Duplex digitalen PCR Assay , die gleichzeitig verwendet werden können , um Enterococcus spp quantifizieren. Und die HF183 genetischen Markern als Indikatoren für allgemeine und menschlichen assoziiertes fäkale Verunreinigung in Erholungsgewässern.

Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

Wir stellen das VacuSIP vor, eine einfache, unaufdringliche und zuverlässige Methode zur sauberen und genauen Punktprobenahme von Wasser. Das System wurde für die gleichzeitige Sammlung des ein- und ausgeatmeten Wassers durch benthische Suspensionsdosierer in situ entwickelt und evaluiert, um die Entfernung und Ausscheidung von partikulären und gelösten Verbindungen sauber zu messen.

VACUSIP eine verbesserte Inex Methode für<em&gt; In Situ</em&gt; Messung von partikulären und gelösten Verbindungen, die durch Active Suspension Feeders Verarbeitet

Dieses Papier berichtet das Protokoll für eine schnelle Identifizierung Assay für Tabak Tabaci basierend auf Loop-vermittelten isothermen (Lampe)-Verstärkungstechnologie. Das Protokoll erfordert minimal Labor Ausbildung und kann, daher, an Grenzübergangsstellen für Pflanze Importe wie Seehäfen und Flughäfen vor Ort umgesetzt werden.

Ein Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Assay für schnelle Identifizierung von Tabak tabaci

Dieses Protokoll Diagnosen Tilapia See Virus (TiLV) in Tilapia Gewebe mit RT-PCR-Methoden. Die gesamte Methode ist von Gewebe Dissektion nach insgesamt RNA-Extraktion, gefolgt von cDNA Synthese und Erkennung von TiLV durch konventionelle PCR oder quantitative PCR mit DsDNA verbindlich einen Farbstoff Fluoreszenz Bindung beschrieben.

Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR

Ein Mikroplot-Design für 15N Tracer-Forschung wird beschrieben, um mehrere saisonale Pflanzen- und Bodenproben-Ereignisse zu berücksichtigen. Für die 15-N-Analyse werden Boden- 15und Pflanzenprobenentnahme- und -verarbeitungsverfahren, einschließlich Schleif- und Wägeprotokolle, durchgeführt.

Mikroplot-Design und Pflanzen- und Bodenprobenvorbereitung für 15Stickstoffanalysen

Erfahren Sie die Messung infektiöser Viren in Wasserproben mittels EPA-Methode 1615. Dieses Protokoll nutzt Buffalo-Green-Monkey-Nierenzellen und organische Flockung zur Quantifizierung von Viren.

EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay (Video) | JoVE Journal

EPA-Methode 1615 Messung von Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser durch Kultur und RT-qPCR. II. Insgesamt kultivierbaren Virus Assay

Weitere Videos entdecken