Entwicklung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch REPLACE: Anwendung auf die Konzeption und Entwicklung Nicht ATP Competitive CDK-Inhibitoren

Das übergeordnete Ziel der Strategie ist es, ein wirksames niedermolekulares arzneimittelähnliches Therapeutikum durch Umwandlung eines Peptidinhibitors einer Protein-Protein-Wechselwirkung zu generieren. Dies wird erreicht, indem in einem zweiten Schritt eine Struktur-Wirkungs-Beziehung für die gewünschte Peptidprotein-Interaktion hergestellt wird, um zu verstehen, welche Teile effektiv ersetzt werden können. Computerchemie wird verwendet, um praktikable Fragmentalternativen für die bekannten Peptiddeterminanten zu identifizieren, die dann zur Synthese einer Bibliothek von Fragmentpeptidhybriden verwendet werden können.

Als nächstes wird eine Bibliothek von Hybriden zwischen diesen Fragmenten und dem verkürzten Peptid synthetisiert, um Moleküle zu erzeugen, die in einem In-vitro-Assay getestet werden können, um Moleküle zu identifizieren, die medikamentenähnlicher sind und die Aktivität des nativen Peptids rekapitulieren. Die Ergebnisse zeigen, dass mit der Methodik mehr wirkstoffähnliche Verbindungen identifiziert werden können, und diese stellen effektive Ausgangspunkte für die Wirkstoffforschung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen dar. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Hochdurchsatz-Screening besteht also darin, dass die Traktion von Proteinen aus Sicht der Wirkstoffforschung eine große Herausforderung darstellt und herkömmliche Methoden nicht gut funktionieren.

Die Ersetzungsstrategie beinhaltet den schrittweisen iterativen Ansatz und kann daher länger dauern oder ist auf lange Sicht effektiver. Heute werde ich die meisten Verfahren selbst demonstrieren, mit etwas Unterstützung von meiner Mitarbeiterin, Dr. Sandra Craig, die einige der Reaktionen und Verfahren einrichten wird. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Validierung des Andockprotokolls, gefolgt von der Vorbereitung der Rezeptorbindungsstelle und der Liganden, wie im Textprotokoll beschrieben, um die Liganden in die Cyclin-Rille anzudocken.

Wählen Sie zunächst die Ligandenanpassungsroutine aus dem Rezeptor-Liganden-Interaktionsprotokoll aus, das auf die Software eingestellt ist, und verwenden Sie den Rezeptor und die vorbereiteten Liganden als Eingabe für dieses Protokoll. Wählen Sie für diese Läufe PLP one als Energienetz aus. Das Energiegitter, das vom Andockprogramm verwendet wird, ist das Kraftfeld zur Erzeugung von Ligandenrezeptor-Wechselwirkungen und potenziellen Posen.

Plp eins ist ein friedensbezogenes lineares Potential, das speziell die Wechselwirkungen von Wasserstoffbrückenbindungen priorisiert. Geben Sie an, dass die Energie der Posen minimiert wird und die Anzahl der generierten Posen 10 beträgt. Belassen Sie alle anderen Parameter in der ersten Instanz auf den Standardwerten.

Zeigen Sie die Posen im Visualizer-Programm an und sortieren Sie dann nach absteigenden Werten der PLP one Score. Verwenden Sie Scoring-Funktionen wie plp, um die Bindungsaffinität eines angedockten Liganden basierend auf der Pose, der Geometrie und der nicht-kovalenten Interaktion mit der Zielrezeptorstruktur eines Liganden zu schätzen. Analysieren Sie visuell die besten 25% der bewerteten Posen auf Super-Unmöglichkeit mit der bekannten Capping-Gruppe.

Beobachten Sie auch, ob die Pose Wechselwirkungsfilter erfüllt hat, die so eingestellt sind, dass sie Atombeschränkungen enthalten, die intermolekulare Kontakte erfordern, von denen bekannt ist, dass sie für die Bindung entscheidend sind, und oder die erforderlich sind, um die potenzielle Deckungsgruppe in der richtigen Geometrie für die Bildung von Amidbindungen zu positionieren. Untersuchen Sie schließlich Posen auf visuelle Komplementarität, die definiert ist als eine effiziente Füllung der Bindungstasche in einer Weise, die mit der bekannten Strukturaktivität übereinstimmt. Beziehungen für die Synthese von Endkappengruppen, Verwendung aller kommerziellen Ausgangsmaterialien, Lösungsmittel und Reagenzien und Synthese durch konventionelle synthetische organische Chemie.

Führen Sie zur Überwachung von Reaktionen eine Dünnschichtchromatographie oder DC-Chromatographie oder DC-Chromatographie auf Kieselgel durch, indem Sie zuerst das Ausgangsmaterial und das Reaktionsgemisch in der mobilen Phase auflösen. Anschließend wird das gelöste Ausgangsmaterial und das Reaktionsgemisch mit Kapillarröhrchen auf die DC-Platte aufgetupft. Setzen Sie die DC-Platte in die Kammer ein, in der sich die mobile Phase befindet.

Sobald die mobile Phase 90 % der DC-Platte erreicht hat, entfernen Sie die Platte und trocknen Sie sie an der Luft. Verwenden Sie UV-Licht, um das Ausgangsmaterial und Reaktionsgemische als sichtbare Flecken zu erkennen. Berechnen Sie dann die HF jedes Spots, d. h. das Verhältnis der vom Spot zurückgelegten Strecke und der mobilen Phase.

Anschließend wird das Reaktionsgemisch in einen Scheidetrichter gegeben und gegebenenfalls mit wässriger Säure oder basischer Lösung gewaschen. Sammeln Sie das organische Lösungsmittel und verdampfen Sie es vor dem Trocknen in einem Rotationsverdampfer. Das unter Vakuum gewonnene Rohprodukt löst 500 Milligramm Rohprodukt in drei bis fünf Millilitern geeignetem Lösungsmittel auf und wird vor dem Trocknen an der Luft zu einer Kieselsäure- oder RP 18-Probe gegeben, eine Probe, die das Rohprodukt enthält, in Kieselsäure-Umkehrphasen-Schnapppatronen gelegt.

Reinigen Sie das Rohmaterial mit automatisierter Hochleistungs-Flash-Chromatographie. Verwenden Sie eine 100-Gramm-Säule mit einem Farbverlauf. Führen Sie mehr als 15 Spaltenvolumes aus.

Trocknen Sie das gereinigte Produkt, das aus der Flash-Chromatographie in Lösungsmittel gewonnen wurde, mit einem Rotationsverdampfer, indem Sie das gesamte Lösungsmittel bis zur Trockenheit verdampfen. Trocknen Sie das Produkt dann unter Vakuum weiter, um alle Lösungsmittelreste zu entfernen. Durchführung der Charakterisierung des gereinigten Produkts durch NMR, MS und analytische HPLC, wie im Textprotokoll beschrieben, um das endcaped Fragment, ligierte inhibitorische Peptide oder Flips zu synthetisieren.

Beendete peptische Verbindungen durch Standard-Festphasensynthesemethoden. Aktivieren Sie fünf Äquivalente der C-terminalen Aminosäure in 4,4 Äquivalenten HBTU in zwei Millilitern DIMETHYLFORMAMID oder DMF für fünf Minuten. Die Mischung wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit sechs Äquivalenten Di-Isopropylethylamin auf Eisbahnharz aufgebracht.

Entfernen Sie die FM-Schutzgruppe von den C-terminalen Rückständen mit 20 % INE in drei Millilitern DMF für 10 Minuten. Koppeln Sie die nachfolgenden Aminosäuren Schritt für Schritt bei jedem Schritt. Koppeln Sie fünf Äquivalente der nächsten Aminosäure mit sechs Äquivalenten DI-Isopropyl, Ethylamin und 4,4 Äquivalenten HBTU in zwei Millilitern DMF für eine Stunde.

Bei Raumtemperatur Waschzyklen nach der Aminosäurekopplung und FM D-Schutzschritte nach der Peptidassemblierung anwenden. Koppeln Sie N-Capping-Gruppen mit sechs Äquivalenten DI-Isopropyl, Ethylamin und 4,4 Äquivalenten HBTU in zwei Millilitern DMF für eine Stunde bei Raumtemperatur nach Abschluss der Peptidassemblierung. Behandeln Sie das Reaktionsgemisch über Nacht mit zwei Millilitern des Spaltgemisches, um Seitenkettenschutzgruppen und Cleve-Flips aus dem Harz zu entfernen, tritrieren Sie das resultierende Produkt mit kaltem Dathylether zur Ausfällung und konzentrieren Sie gegebenenfalls in einem Rotationsverdampfer, filtern Sie den entstehenden Feststoff und trocknen Sie ihn unter Vakuum oder gefriertrocknen Sie ihn unter Verwendung eines Lyophilisators.

Fahren Sie an diesem Punkt mit dem Fluoreszenzpolarisations-Bindungsassay fort, wie im Textprotokoll zur Bestimmung der kompetitiven Bindung beschrieben. Die Modellstruktur von H-A-K-R-R-L-I-F, gebunden an die Zyklon-Bindungsrinne, ist dargestellt. Die Radrille besteht aus zwei hydrophoben Taschen, einer größeren Primärtasche und einer kleineren Sekundärtasche, die von rot dargestellten sauren Rückständen überbrückt werden.

Weitere wichtige Wechselwirkungen sind Wasserstoffbrückenbindungskontakte des Peptidrückgrats und Ionenpaarungswechselwirkungen der drei basischen Reste des Peptids; hier ist der Bindungsmodus von drei fünf D-C-P-T-R-L-I-F dargestellt, dargestellt mit Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen mit Seitenkettenatomen von Tryptophan, zwei 17 und Glutamin 2,54 angedockt. Es sind Posen von drei repräsentativen und kappenden Gruppen dargestellt, wobei jede dieser Verbindungen Wasserstoffbrückenbindungen mit den Wechselwirkungsfilteratomen von Tryptophan zwei 17 und Glutamin 2 54 besitzt. Wie durch grün gestrichelte Linien dargestellt, bewirkt der Fenchelsubsistent die Wechselwirkungen der Vander-Wand mit der sekundären hydrophoben Tasche.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie ein besseres Verständnis dafür, wie Sie die Ersetzungsstrategie durchführen und anwenden, um einen bekannten Peptidinhibitor in ein arzneimittelähnlicheres Molekül umzuwandeln, das eine Proteintraktion hemmt und ein Ausgangspunkt für die therapeutische Entwicklung ist.