Name: Synthese von Indoxyl-Glykoside zum Nachweis von Glycosidase Aktivitäten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie die neuartige Synthese von Indoxyl-Glykosiden mit verbesserten Ausbeuten für Enzymaktivitätstests. Diese Methode nutzt Indoxylsäureester als Zwischenprodukte und ermöglicht die effiziente Herstellung chromogener Substrate.

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Allgemeine Bemerkungen:
Alle Reaktionen wurden mit einem Abzug und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt. Alle Reagenzien und Lösungsmittel (p.a.; Wassergehalt für trockene Lösungsmittel: MeCN <50 ppm; Et2O <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) wurden von gewerblichen Quellen bezogen und wie erhalten verwendet. Die TLC wurde an Merck Kieselgel 60 F254 Platten durchgeführt. Die Verbindungen wurden durch UV-Strahlung und/oder durch Behandlung mit EtOH/H2SO4 (9:1) und anschließender Erhitzung nachgewiesen. Die Säulenchromatographie wurde mit Merck/Fluka Kieselgel 60 (230-400 mesh) durchgeführt. Die Filtration erfolgte mit Büchner-Trichter und Aspiratorpumpe. Die Entfernung der Lösungsmittel erfolgte mit Hilfe eines Rotationsverdampfers (40 °C, ~200 U/min). Die Produkte wurden im Hochvakuum getrocknet (Drehschieberpumpe). Reaktionen, die trockene Lösungsmittel erforderten, wurden unter Argonatmosphäre durchgeführt.
Im Folgenden wird die Synthese von X-Gal (16) unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-indoxylsäure-Allylester (12) beschrieben. Für weitere Verbindungen mit unterschiedlichen Substitutionsmustern sowie Methylester, die gemäß dieser Synthesesequenz hergestellt wurden, siehe Ref.17-19.
1. Akzeptor: Synthese von 5-Brom-4-chlor-indoxylsäure-Allylester18 (12)
<ol>
	<li>N-Acetylierung: Synthese von N-(4-Brom-3-chlor-2-methylphenyl)-acetamid (6)
	<ol>
		<li>10,0 g (45,7 mmol) 4-Brom-3-chlor-2-methylanilin werden in 30 ml Dichlormethan gelöst. 
		Vorsicht! Dichlormethan ist schädlich und kühlt die Lösung in einem Eisbad ab.</li>
		<li>6,50 ml (68,7 mmol) Essigsäureanhydrid tropfenweise zugeben und die Mischung auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Die Mischung kann 8 Stunden oder über Nacht gerührt werden. Vorsicht! Essigsäureanhydrid ist ätzend und brennbar.</li>
		<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel und rekristallisieren Sie aus 9:1 Ethylacetat/Methanol (Ausbeute: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), farbloser Feststoff). 
		Vorsicht! Ethylacetat ist reizend und brennbar. Vorsicht! Methanol ist giftig und brennbar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oxidation: Synthese von N-Acetyl-5-brom-6-chloranthranilsäure (7)
	<ol>
		<li>Reflux ein Gemisch aus 2,30 g (8,76 mmol) aus 6 (Erzeugnis aus Schritt 1.1) und 2,10 g (8,52 mmol) MgSO4•7H2O in 40 ml Wasser in einem 3-Hals-Rundkolben mit Kühler und Tropftrichter.</li>
		<li>50 ml gesättigteKMnO 4-Lösung in Wasser über einen Zeitraum von 3 Stunden tropfenweise zum Reaktionsgemisch geben. Anschließend weitere 2 Std. unter Rückfluss, ca. 135 °C Ölbad erhitzen. Vorsicht! Kaliumpermanganat ist schädlich und oxidierend.</li>
		<li>Auf Raumtemperatur abkühlen und das Pyrolusit (MnO2), das bei der Reaktion entsteht, filtrieren. 
		Vorsicht! Pyrolusit ist schädlich.</li>
		<li>Salzsäure (37%) bis zum pH-Wert 1 zum Filtrat geben, dann das Produkt filtrieren und im Vakuum trocknen (Ausbeute: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), farbloser Feststoff). 
		Vorsicht! Salzsäure ist ätzend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deacetylierung: Synthese von 5-Brom-6-chloranthranilsäure (8)
	<ol>
		<li>3,90 g (13,3 mmol) von 7 (Erzeugnis aus Schritt 1.2) in 70 ml 1 N wässriger Natronlauge auflösen und 5 Std. bei ca. 100 ΰC (Ölbad) erhitzen< />
		Vorsicht! Natriumhydroxid ist korrosiv.</li>
		<li>Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und Salzsäure (37%) bis pH 1 zugeben, dann das Produkt mit einem Büchner-Trichter filtrieren und im Vakuum trocknen (Ausbeute: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Anhydridbildung: Synthese von 5-Brom-6-chlorisatosäureanhydrid (9)
	<ol>
		<li>8,17 g (32,6 mmol) von 8 (Erzeugnis aus Schritt 1.3) werden in 33 ml trockenem Acetonitril suspendiert. 
		Vorsicht! Acetonitril ist schädlich und brennbar.</li>
		<li>Bei Raumtemperatur umrühren und 5,3 ml und eine Lösung von 3,22 g (10,8 mmol) Triphosgen in 18,5 ml trockenes Dichlormethan tropfenweise gleichzeitig über einen Zeitraum von 30 min hinzufügen. Anschließend 3 Std. bei 50 °C (Ölbad) erhitzen. Vorsicht! Pyridin ist gesundheitsschädlich und brennbar. 
		Vorsicht! Triphosgen ist giftig und kann Phosgen freisetzen.</li>
		<li>Entfernen Sie etwa 75 % des Lösungsmittels und löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser und filtrieren Sie Ihr Produkt. Mit einer kleinen Menge kaltem Dichlormethan waschen.</li>
		<li>Trocknen Sie das Produkt im Vakuum (Ausbeute: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-Alkylierung: Synthese von 5-Brom-6-chlor-N-[(methoxycarbonyl)allyl]-isatosäureanhydrid (10)
	<ol>
		<li>25 g (90 mmol) von 9 (Erzeugnis aus Schritt 1.4) werden in 250 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und mit einem Eisbad abgekühlt 
		Vorsicht! Dimethylformamid ist schädlich und brennbar</li>
		<li>Portionsweise 1,15 Äquivalente Natriumhydrid (60 % Paraffin) zugeben. 
		Vorsicht! Natriumhydrid ist ätzend und brennbar; Starke Reaktion mit Wasser/Eis.</li>
		<li>Nach 30 min Rühren bei 0 °C auf Raumtemperatur erwärmen lassen und 1,2 Äquivalente Allylbromoacetat tropfenweise zugeben.</li>
		<li>Nach 5-stündigem Rühren löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von 500 ml destilliertem Wasser ab und filtrieren Sie Ihr Produkt.</li>
		<li>Waschen Sie das Produkt mit Wasser (3 Mal, 100 ml) und trocknen Sie es im Vakuum (Ausbeute: 93 % (31,5 g, 84,1 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Anhydrid-Öffnung: Synthese von 5-Brom-6-chlor-N-(methoxycarbonylallyl)-anthranilsäure-Allylester (11)
	<ol>
		<li>10 g (27 mmol) von 10 (Erzeugnis aus Schritt 1.5) werden in 100 ml Allylalkohol gelöst. 
		Vorsicht! Allylalkohol ist schädlich und gefährlich für die Umwelt.</li>
		<li>Fügen Sie portionsweise 350 mg (8,70 mmol) Natriumhydrid (60% Paraffin) hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie nach 6,5 Stunden oder über Nacht das Lösungsmittel.</li>
		<li>Das Rohprodukt wird einer Säulenchromatographie unterzogen (Säule 30 x 6 cm; 240 g Kieselsäure), Petrolether/Ethylacetat 2:1; RF = 0,66), (Ausbeute: 80% (8,30 g, 21,3 mmol), gelbes Öl). 
		Vorsicht! Petrolether ist brennbar, reizend und gefährlich für die Umwelt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dieckmann-Kondensation: Synthese von 5-Brom-4-chlor-indoxylsäure-Allylester (12)
	<ol>
		<li>3,0 g (7,7 mmol) von 11 (Erzeugnis aus Schritt 1.6) und 1,75 g (15,6 mmol) Kalium-tert-butoxid in 100 ml Trockendiethylether mischen 
		Vorsicht! Kalium-tert-butoxid ist korrosiv und brennbar. 
		Vorsicht! Diethylether ist gesundheitsschädlich und hochentzündlich.</li>
		<li>Die Mischung unter Rückfluss (Kühler) 2 Std. bei 40-45 °C erhitzen.</li>
		<li>Entfernen Sie etwa 75 % des Lösungsmittels und fügen Sie verdünnte Salzsäure (100 ml, 1 M) hinzu. 
		Vorsicht! Nicht vollständig trocknen, es kann zu Zersetzungen kommen.</li>
		<li>Das Produkt filtrieren und im Vakuum trocknen (Ausbeute: 84% (5,14 g, 15,5 mmol), farblos bis leicht grün fest).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indoxyl-Glykosid: Synthese von X-Gal17
<ol>
	<li>Phasentransfer-Glykosylierung: Synthese von (5-Brom-4-chlor-indox-3-ylsäure-allylester) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-galactopyranosid (14)
	<ol>
		<li>400 mg (1,21 mmol) der Indoxylsäure Allylester 12 (Erzeugnis aus Schritt 1.7), 410 mg (1,21 mmol) Tetrabutylammoniumhydrogensulfat und 500 mg (1,21 mmol) des Spenders 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-ᴅ-galactopyranosylbromid (α-Acetobromogalactose) in 10 ml Dichlormethan mischen. Vorsicht! Tetrabutylammoniumhydrogensulfat ist schädlich.</li>
		<li>10 ml einer wässrigen Lösung von Kaliumcarbonat (1 M) zugeben. 
		Vorsicht! Kaliumcarbonat ist ätzend.</li>
		<li>Bei Raumtemperatur bis zum vollständigen Verzehr des Spenders (TLC: Petrolether/Ethylacetat) rühren.</li>
		<li>Die organische Phase (Scheidetrichter) abtrennen, über Na2SO4 trocknen und das Lösungsmittel entfernen.</li>
		<li>Das Rohprodukt wird einer Säulenchromatographie unterzogen (Erdölether/Ethylacetat 1:1; RF = 0,33). (Ausbeute: 86% (690 mg, 1,04 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Esterspaltung und Decarboxylierung: Synthese von (N-Acetyl-5-brom-4-chlorindol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-galactopyranosid (15)
	<ol>
		<li>600 mg (0,908 mmol) von 14 (Erzeugnis aus Schritt 2.1) werden in 15 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst. 
		Vorsicht! Tetrahydrofuran ist gesundheitsschädlich und brennbar.</li>
		<li>800 μl Morpholin und 105 mg (9,09 μmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) zugeben und über Nacht bei Raumtemperatur umrühren. 
		Achtung! Morpholin ist brennbar und ätzend.</li>
		<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel.</li>
		<li>400 mg (2,40 mmol) Silberacetat, 800 mg (5,79 mmol) Kaliumcarbonat und 10 ml Essigsäureanhydrid zugeben. 
		Vorsicht! Silberacetat ist reizend und gefährlich für die Umwelt.</li>
		<li>Bei 90-100 °C 20 min erhitzen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur mit Dichlormethan verdünnen.</li>
		<li>Waschen Sie die Mischung zweimal mit Wasser und einmal mit einer verdünnten NaHCO3-Lösung (10%). 
		Vorsicht! Natriumbicarbonat ist ätzend.</li>
		<li>Die organische Phase über Na2SO4 (Filter) trocknen und das Lösungsmittel entfernen.</li>
		<li>Das Rohprodukt einer Säulenchromatographie (PE/EA 1:1; RF = 0,24), (Ausbeute: 88% (495 mg, 8,00 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zemplén-Deacetylierung: Synthese von (5-Brom-4-chlor-indol-3-yl)-β-ᴅ-galactopyranosid (16)
	<ol>
		<li>396 mg (0,436 mmol) 15 (Erzeugnis aus Schritt 2.2) werden in 10 ml Methanol gelöst.</li>
		<li>Eine katalytische Menge Natriummethanolat zugeben und über Nacht bei Raumtemperatur umrühren. 
		Vorsicht! Natriummethanolat ist brennbar und korrosiv.</li>
		<li>Neutralisieren Sie mit Amberlite IR-120 H+ (Filter) und Konzentrat. 
		Vorsicht! Amberlite IR-120 H+ ist reizend.</li>
		<li>Trocknen Sie das Produkt im Vakuum (Ausbeute: 87% (170 mg, 0,416 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Veranschaulichung des Modellexperiments: Aktivitätsnachweis von β-Galactosidase mit X-Gal
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine 0,5 mM Lösung von X-Gal in 500 μl Puffer (Tris-HCl 20 mM; pH 7,4; 50 mM NaCl, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure; oder einen anderen geeigneten Puffer für Ihr Enzym) in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor (X-Gal kann in einigen μl Dimethylsulfoxid gelöst werden).</li>
	<li>1 μl β,1-3-Galactosidase (EC 3.2.1.23 10.000 U/ml) oder eine andere geeignete β-Galactosidase) zugeben und bei 37 °C schütteln (600 rps).</li>
	<li>Verfolgen Sie die Reaktion. Der indigoartige Farbstoff bildet sich nach kurzer Zeit.</li>
</ol>

<ol><li>Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigo%2C+Woad%2C+and+Tyrian+Purple%3A+Important+Vat+Dyes+from+Antique+to+the+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present.</a> Endeavour. 17, 191-199 (1993).</li>
<li>Hunger, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunger%2C+K+%22Industrial+Dyes%3A+Chemistry%2C+Properties%2C+Applications%22">Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications</a>. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigogenic+Substrates+for+Detection+and+Localization+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechn.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes.</a> Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).</li>
<li>Barnett, R. J., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Esterases+by+Production+of+Indigo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo.</a> Science. 114, 579-582 (1951).</li>
<li>Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Mammalian+Glucosidase+by+Means+of+3-%285-Bromoindolyl%29-%CE%B2-%E1%B4%85-glucopyranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside.</a> Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).</li>
<li>Anderson, F. B., Leaback, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+the+Histochemical+Localization+of+some+Glycosidases%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases.</a> Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).</li>
<li>Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosynthesis+and+Evaluation+of+5-%5B125I%5DIodoindolyl-3-yl-%CE%B2-%E1%B4%85-galactopyranoside+%28%5B125I%5DIBDG%29+as+a+%CE%B2-Galactosidase+Imaging+Radioligand%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand.</a> Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).</li>
<li>Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Halogen+Substituted+%CE%B2-%E1%B4%85-Glucuronides+and+Their+Hydrolysis+by+Rabbit+Liver+%CE%B2-Glucoronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase.</a> Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).</li>
<li>Horwitz, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+Cytochemical+Demonstartion+of+Enzyme+Activity+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-glycopyranosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li>
<li>Eschenfelder, V., Brossmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromo-indol-3-yl+5-Acetamido-3%2C5-dideoxy-%CE%B1-%E1%B4%85-glycero-%E1%B4%85-galactononulopyranosidic+Acid%2C+a+Novel+Chromogenic+Substrate+for+the+Staining+of+Sialidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity.</a> Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).</li>
<li>Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Neu5Ac%3A+A+Novel+Substrate+for+Chromogenic+Assay+of+Neuraminidase+Activity+in+Bacterial+Expression+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems.</a> Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).</li>
<li>Berlin, W., Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Color+Detection+of+%CE%B1-%CA%9F-Arabinofuranisodase%2C+a+%26%2334%3BNo-Background%26%2334%3B+Reporter+Gene%2C+with+5-Bromo-3-indolyl-%CE%B1-%CA%9F-arabinofuranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a &#34;No-Background&#34; Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside.</a> Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).</li>
<li>Marmuse, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Chromogenic+Substrates+for+Feruloyl+Esterases%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).</li>
<li>Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+4-Methylumbelliferyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+and+5-Bromo-3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+for+Sensitive+Detection+of+Xylanase+Activity+on+Agar+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).</li>
<li>Robertson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Glucosides.+Part+I.+The+Synthesis+of+Indican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican.</a> Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).</li>
<li>Robertson, A., Waters, R. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthese+of+Glucosides.+Part+VII.+The+Synthesis+of+6-Bromoindican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican.</a> Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoxylic+Acid+Esters+as+Convenient+Intermediates+Towards+Indoxyl+Glycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides.</a> Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).</li>
<li>Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Efficient+Routes+to+Indoxyl+Glycosides+for+Monitoring+Glycosidase+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities.</a> Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+Preparation+of+Indoxyl-+and+Nitrophenyl+Glycosides+of+Lactosamine+and+Isolactosamine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine.</a> RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Aufgrund schlechter Ausbeuten und Limitierungen, insbesondere für glukoseartige Strukturen und komplexere Saccharide, wurde ein neuartiger synthetischer Ansatz für Indoxylglykoside entwickelt. Indoxylsäureester erwiesen sich als wertvolle wichtige Zwischenprodukte und wurden auf einem modularen, skalierbaren Weg gewonnen. Alle Schritte sind ergiebig und durch billige Ausgangsmaterialien und einfache Aufarbeitung sind Multi-Gramm-Synthesen möglich. Der Vorteil des Allylester-Ansatzes ist die Blockierung der reaktiven 2-Po...

Über lange Zeit war die Herstellung von Indigo ein wirtschaftlich sehr wichtiger Prozess. Bevor großtechnische chemische Synthesen kostengünstigen Zugang zu Indigo ermöglichten, wurden die Vorläuferstoffe bereits vor christlicher Zeitrechnung aus natürlichen Quellen gewonnen. Der Anbau indigoproduzierender Pflanzen (natürliches Indigo) in Europa wurde im 17th Jahrhundert unrentabel, da der Gehalt an Indigovorläufern in der indischen Indigopflanze (0,2–0,8 %) etwa 30-mal höher ist. Gegen Ende des 19. Jahrhunderts verdrängte die chemische Synthese von Indigo den herkömmlichen Anbau1,2.
Natürlicherweise in Pflanzen vorkommende Indigovorstufen umfassen Indican (1), Insatan A (2) und Isatan B (3) (Abbildung 1). Alle bestehen aus einem mit einer glycosylierten Restgruppe verbundenen Indoxyl-Motiv. Der Abbau der glycosidischen Bindung, beispielsweise durch enzymatische Hydrolyse, führt zur Freisetzung von Indoxyl (4). Indoxyl selbst ist nahezu farblos, kann aber rasch zu einem Indigofarbstoff (5) oxidiert werden. Diese empfindliche Reaktion wurde in der Biochemie, Histochemie, Bakteriologie und Molekularbiologie zur Überwachung enzymatischer Aktivitäten angepasst. Eine Aktivitätsprüfung in vivo, ohne Isolierung oder Reinigung der Enzyme, sowie schnelle Tests auf Agarplatten oder in Lösung (z. B. Blau-Weiß-Screening, Mikrogefäße) sind möglich. Abhängig von der mit der Indoxyl-Einheit verknüpften Restgruppe (z. B. Ester, Glycoside, Sulfate) wurden geeignete Substrate für verschiedene Enzymklassen (z. B. Esterasen, Glycosidasen, Sulfatasen) entwickelt3. Im Folgenden steht die Bildung und Anwendung von Indoxylglycosiden im Mittelpunkt.
<img alt="Diagramm des Indican-Hydrolyseprozesses mit Darstellung von Indolderivaten und der Bildung von Indigofarbstoff." src="/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Natürliche Indigovorstufen und Bildung des Indigofarbstoffs durch Hydrolyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Das Substitutionsmuster des Indoxylrests bestimmt die Farbe und die physikalischen Eigenschaften des resultierenden Indigofarbstoffs. Die gebräuchlichsten Substitutionsmuster sind 5-Bromo-4-chloro (abgekürzt mit X; grünlich-blau), 5-Bromo (blau) und 5-Bromo-6-chloro (magenta), da diese die kleinsten Farbstoffpartikel bilden, keine Granula ausbilden und die geringste Diffusion von den Hydrolysestellen aufweisen. Letztere Eigenschaft ist besonders wichtig für in vivo-Experimente3.
Der erste Bericht über ein indigogenes Verfahren zur Nachweisung der Esteraseaktivität wurde 1951 von Barrnett und Seligman veröffentlicht, die Indoxylacetat und Indoxylbutyrat verwendeten4. Etwa ein Jahrzehnt später wurde das indigene Prinzip für die Lokalisierung von Säuger-Glucosidasen angepasst5. Bis heute wurden mehrere Indoxylglycoside entwickelt, obwohl sich ihre Synthese als schwierig erwiesen hat. Die meisten Synthesen basieren auf der Verwendung eines N-acetylierten Indoxyls als Akzeptor und des jeweiligen glycosylierten Halid-Donors6–14. Die Glycosylierung wird in Aceton mit Natriumhydroxid durchgeführt. Unter diesen Bedingungen treten zahlreiche Nebenreaktionen auf, die die Ausbeute erheblich verringern. Insbesondere für Glucose-ähnliche Strukturen wurden sehr niedrige Glycosylierungsausbeuten berichtet (z. B. 15 % für (N-Acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranosid6 und 26 % für (N-Acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetyl-β-ᴅ-xylobiosid14 in einem jüngeren Beispiel). Durch einen neuartigen Ansatz unter Verwendung von Indoxylsäureestern wurden eine beträchtliche Anzahl an Indoxylglycosiden in guten Ausbeuten hergestellt (z. B. (N-Acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranosid mit 57 % Ausbeute).
Das folgende Protokoll beschreibt die einfache Synthese des Allylesters der Indoxylsäure (5-Brom-4-chlor) und darauf basierend die Synthese eines Indoxylglycosids (X-Gal). Ein einfaches Modellexperiment zeigt die Enzymaktivität von β-Galactosidase unter Verwendung von X-Gal.

<table><tbody><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10298</td><td>Ätzendes, entzündliches</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608-001-00-3</td><td>Gesundheitsschädlicher, entzündbarer</td></tr><tr><td>Allylalkohol</td><td>Aldrich</td><td>453021</td><td>Gesundheitsschädlich, umweltschädlich</td></tr><tr><td>Amberlite IR-120 H+</td><td>Fluka</td><td>06428</td><td>Reizend</td></tr><tr><td>Bromolessigsäure</td><td>Merck</td><td>802260</td><td>Ätzend, giftig, gefährlich für die Umwelt</td></tr><tr><td>4-Brom-3-chlor-2-methylanilin</td><td>ABCR</td><td>AB 171687</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>ACROS</td><td>326850010</td><td>Schädlicher</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10274</td><td>gesundheitsschädliches, hochentzündliches</td></tr><tr><td>Dimethylformamid</td><td>ACROS</td><td>348430010</td><td>gesundheitsschädliches, entzündliches</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>607-022-00-5</td><td>Reizend, entzündbar</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>AppliChem</td><td>A1103.0500</td><td>Reizend</td></tr><tr><td>&beta; 1,3-Galactosidase, rekombinant, E. coli</td><td>Calbiochem</td><td>345795</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>VWR</td><td>20252.290</td><td>Korrosives</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfathydrat</td><td>Merck</td><td>105885</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ACROS</td><td>326950010</td><td>Giftiges, entzündliches</td></tr><tr><td>Morpholin</td><td>Janssen Chimica</td><td>15.868.57</td><td>Ätzend, entzündlich</td></tr><tr><td>Erdölether</td><td>Azelis</td><td>111053</td><td>Entzündlich, reizend, gefährlich für die Umwelt</td></tr><tr><td>Kaliumcarbonat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12005</td><td>Ätzendes</td></tr><tr><td>Kaliumpermanganat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12056</td><td>gesundheitsschädliches, oxidierendes</td></tr><tr><td>Kalium-tert-butoxid</td><td>Merck</td><td>804918</td><td>ätzendes, entzündliches</td></tr><tr><td>Pyridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>613-002-00-7</td><td>gesundheitsschädliches, entzündliches</td></tr><tr><td>Silberacetat</td><td>Fluka</td><td>85140</td><td>Reizend, umweltschädlich</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12144</td><td>Korrosives</td></tr><tr><td>Natriumhydrid</td><td>Merck</td><td>814552</td><td>Ätzendes, entzündliches</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Riedel-de H&auml; en</td><td>S181200</td><td>Ätzendes</td></tr><tr><td>Natriummethanolat</td><td>Merck</td><td>806538</td><td>Ätzendes, entzündliches</td></tr><tr><td>Natriumsulfat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12175</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabutylammoniumhydrogensulfat</td><td>Lancaster</td><td>5438</td><td>gesundheitsschädliches</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87371</td><td>gesundheitsschädliches, entzündliches</td></tr><tr><td>Tetrakis (Triphenylphosphin)palladium(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td></td></tr><tr><td>Triphosgen</td><td>Fluka</td><td>15217</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Tris (Hydroxymethyl)aminomethan Hydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td>Reizend</td></tr></tbody></table>

synthese von indoxyl-glykoside zum nachweis von glycosidase aktivitäten

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl Glykoside erwies sich als wertvolle und vielseitige Werkzeuge zur Überwachung Glycosidase Aktivitäten. Indoxyle durch enzymatische Hydrolyse freigesetzt und werden schnell oxidiert, beispielsweise durch Luftsauerstoff, um Farbstoffe Indigo. Diese Reaktion ermöglicht eine schnelle und einfache Screening in vivo ohne Isolierung oder Reinigung von Enzymen sowie Schnelltests auf Agarplatten oder in Lösung (zB blau-weiß Screening, Mikrovertiefungen) und ist in der Biochemie verwendet, Histochemie, Bakteriologie und molekularen Biologie. Leider ist die Herstellung solcher Substrate als schwierig erwiesen, aufgrund verschiedener Nebenreaktionen und die geringe Reaktivität des Indoxyl Hydroxylfunktion. Speziell für Glukose artigen Strukturen geringe Ausbeuten beobachtet. Unser neuartiger Ansatz beschäftigt indoxylic Ester als Schlüssel-Zwischenprodukte. Indoxylic Estern mit unterschiedlichen Substitutionsmuster wurden auf skalierbare Wege vorbereitet. Phasentransfer Glycosylierungen mit den Akzeptoren und peracetyliertenGlycosylhalogeniden kann unter herkömmlichen Bedingungen in hohen Ausbeuten durchgeführt werden. Esterspaltung und nachfolgende milde Silber vermittelt Glykosylierung ergibt die peracetylierten indoxyl Glycoside in hohen Ausbeuten. Schließlich Entschützung nach Zemplén geführt.

Die ersten Synthesen von Indican und 5-Brom-indican wurden bereits 1927 und 1929 von Robertson veröffentlicht15,16. Durch die Verwendung von Methylester des Indoxylsäuremethylesters als Akzeptor wurde die reaktive 2-Position blockiert, wodurch Nebenreaktionen teilweise unterbunden wurden. Die Glykosylierung in Aceton/Natriumhydroxid, gefolgt von der Entschützung und Decarboxylierung (160 °C, Essigsäureanhydrid, 1 Stunde) sowie abschließend der Deacetylierung, führte zur Gewinnung von Indican und 5-Brom-indican...

Indoxylglykoside sind etablierte und weit verbreitete Werkzeuge für das Enzymscreening und die Überwachung der Enzymaktivität. Insbesondere für glukoseartige Strukturen erwiesen sich frühere Synthesen als schwierig und ergiebig. Unser neuartiger Ansatz verwendet Indoxylsäureester als wertvolle Zwischenprodukte, um eine beträchtliche Anzahl von Indoxylglykosiden in guten Ausbeuten zu erhalten.

Synthese von Indoxyl-Glykoside zum Nachweis von Glycosidase Aktivitäten

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen neuartigen synthetischen Ansatz für Endo-Glycoside vorzustellen, einschließlich solcher mit komplexen Kohlenhydratstrukturen in guten Ausbeuten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein inic-saures allo-Ester-Acceptor aus Methyl lene synthetisiert wird. Der zweite Schritt beinhaltet die Glycosylierung dieses Acceptors mit einem acetylierten glycosylen Hali-Donor.Anschließend wird das Allel-Ester durch einen Palladiumkatalysator gespalten, und eine nachfolgende, silbervermittelte Decarboxylierung dient zur Herstellung des acetylierten Inox-Glycosids. Der letzte Schritt ist die Deacetylierung mittels Zeplan, um das nicht geschützte Inox-Glycosid zu erhalten. Letztendlich wird das hergestellte chromogene Substrat für einen qualitativen Enzymaktivitätstest verwendet.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass glykosidische Verbindungen komplexer und labiler Kohlenhydratstrukturen leicht hergestellt werden können. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir eine Veröffentlichung von Alexander Robertson aus dem Jahr 1927 lasen, der die erste Synthese von Inca-Employ-inic-Säure-Methylester en

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Mit Hilfe spezifischer Glycosidasen um Zucker aus Glykoproteinen, die durch SDS-PAGE gefolgt zu entfernen, ist eine wertvolle Methode, um glycan Modifikationen am Protein-Proben erkannt und ist eine gute Wahl für die erste Glykobiologie Studien. Veränderungen nach Deglykosylierung kann als Verschiebungen in Gel-Mobilität oder durch Färbung mit glycan empfindliche Reagenzien nachgewiesen werden.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Dieses Video beschreibt einen spektrophotometrischen Assay zur Abschätzung der Glykogensynthase-Aktivität. Die Methode beruht auf der Verringerung der Absorption von NADH mit der Zeit und zeigt die Aktivität der Glykogensynthase an.

Spektrophotometrischer Assay zur Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität

Eine Reihe von kolorimetrischen Assays wird zum schnellen Unterscheidungsmerkmal Protein, RNA, DNA und Reduk-tion Zuckern in potentiell heterogenen biomolekularen Proben beschrieben.

Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

Wir präsentieren eine automatisierte modulare Hochdurchsatzmethode zur Identifizierung und Charakterisierung von mikrobiellen Exopolysacchariden in kleinem Maßstab. Diese Methode kombiniert eine schnelle Vorselektion zur Analyse der Gesamtmenge an sezernierten Polysacchariden mit einem detaillierten Kohlenhydrat-Fingerabdruck, um ein schnelles Screening von neu isolierten Bakterienstämmen oder ganzen Stammsammlungen zu ermöglichen.

Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt

Dieses Protokoll beschreibt die spezifischen Techniken, die für die strukturelle Charakterisierung von Glykosylsequenz(en) im reduzierenden Endbereich (RE) und Glykosylsequenz(en) im internen Bereich von Heteroxylanen verwendet werden, indem das RE vor der enzymatischen Hydrolyse (Endoxylanase) mit 2 Aminobenzamid markiert und dann die resultierenden Oligosaccharide mittels Massenspektrometrie (MS) und Kernspinresonanz (NMR)  analysiert werden.

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Ein Hochdurchsatz-Assay für das Enzym-Screening wird beschrieben. Dieses gebrauchsfertige Multiplex-Assay-Kit besteht aus vorausgewählten C-hromogenen P-Olymer-H-Ydrogel-Substraten (CPH) und komplexenI-nlöslichen C-hromogenen B-iomasse(ICB)-Substraten. Zielenzyme sind Polysaccharid-abbauende Endoenzyme und Proteasen.

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Verfälschung von Diesel mit Kerosin mit Teststreifen beschichtet mit einer fluoreszierenden Viskosität Sonde zusammen mit einer Smartphone-basierte Analyse-System zu erkennen.

Fluoreszierende Papierstreifen zur Detektion von Diesel Verfälschung mit Smartphone auslesen

Die Bergmeyer-Glukosequantifizierung ist eine spektrophotometrische enzymatische Technik, die hauptsächlich für klinische Tests verwendet wird, bei denen die Glukosemenge genau und empfindlich gemessen wird. Im Folgenden stellen wir ein Protokoll für die Anwendung dieser Methode für mikrobiologische Proben vor.

Bergmeyer Glukosequantifizierung für mikrobiologische Proben

Jüngste Studien unterstreichen die Rolle der Enzyme der menschlichen Darmmikrobiota bei der Verstoffwechselung von C-Glykosiden. In dieser Arbeit stellen wir eine umfassende Methodik vor, die Techniken der analytischen Chemie (LC-MS/MS und NMR) mit strukturbiologischen Ansätzen integriert, um die strukturellen und enzymatischen Reaktionsketten dieser C-Glykosid-metabolisierenden Enzyme systematisch zu charakterisieren.

Strukturbiologie und analytische Chemie: Ansätze zur Charakterisierung von C-Glykosid-Stoffwechselenzymen in der menschlichen Darmmikrobiota

Dieses Protokoll beschreibt eine kolorimetrische Methode, um den Einfluss von Chemikalien auf die Deiodinase-1 (DIO1)-Aktivität in menschlichen Lebermikrosomen mithilfe der Sandell-Kolthoff-Reaktion zuverlässig zu bewerten. Sie enthält vordefinierte Akzeptanzkriterien und statistische Leistungskennzahlen und unterstützt laufende Bemühungen zur Einbeziehung von OECD-Testrichtlinien.

Kolorimetrische Bewertung der Deiodinase-1-Aktivität in menschlichen Lebermikrosomen mittels der Sandell-Kolthoff-Reaktion

Erfahren Sie die neuartige Synthese von Indoxyl-Glykosiden mit verbesserten Ausbeuten für Enzymaktivitätstests. Diese Methode nutzt Indoxylsäureester als Zwischenprodukte und ermöglicht die effiziente Herstellung chromogener Substrate.

Synthese von Indoxyl-Glykoside zum Nachweis von Glycosidase Aktivitäten

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