Name: Synthese von Indoxyl-Glykoside zum Nachweis von Glycosidase Aktivitäten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie die neuartige Synthese von Indoxyl-Glykosiden mit verbesserten Ausbeuten für Enzymaktivitätstests. Diese Methode nutzt Indoxylsäureester als Zwischenprodukte und ermöglicht die effiziente Herstellung chromogener Substrate.

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Allgemeine Bemerkungen:
Alle Reaktionen wurden mit einem Abzug und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt. Alle Reagenzien und Lösungsmittel (p.a.; Wassergehalt für trockene Lösungsmittel: MeCN <50 ppm; Et2O <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) wurden von gewerblichen Quellen bezogen und wie erhalten verwendet. Die TLC wurde an Merck Kieselgel 60 F254 Platten durchgeführt. Die Verbindungen wurden durch UV-Strahlung und/oder durch Behandlung mit EtOH/H2SO4 (9:1) und anschließender Erhitzung nachgewiesen. Die Säulenchromatographie wurde mit Merck/Fluka Kieselgel 60 (230-400 mesh) durchgeführt. Die Filtration erfolgte mit Büchner-Trichter und Aspiratorpumpe. Die Entfernung der Lösungsmittel erfolgte mit Hilfe eines Rotationsverdampfers (40 °C, ~200 U/min). Die Produkte wurden im Hochvakuum getrocknet (Drehschieberpumpe). Reaktionen, die trockene Lösungsmittel erforderten, wurden unter Argonatmosphäre durchgeführt.
Im Folgenden wird die Synthese von X-Gal (16) unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-indoxylsäure-Allylester (12) beschrieben. Für weitere Verbindungen mit unterschiedlichen Substitutionsmustern sowie Methylester, die gemäß dieser Synthesesequenz hergestellt wurden, siehe Ref.17-19.
1. Akzeptor: Synthese von 5-Brom-4-chlor-indoxylsäure-Allylester18 (12)
<ol>
	<li>N-Acetylierung: Synthese von N-(4-Brom-3-chlor-2-methylphenyl)-acetamid (6)
	<ol>
		<li>10,0 g (45,7 mmol) 4-Brom-3-chlor-2-methylanilin werden in 30 ml Dichlormethan gelöst. 
		Vorsicht! Dichlormethan ist schädlich und kühlt die Lösung in einem Eisbad ab.</li>
		<li>6,50 ml (68,7 mmol) Essigsäureanhydrid tropfenweise zugeben und die Mischung auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Die Mischung kann 8 Stunden oder über Nacht gerührt werden. Vorsicht! Essigsäureanhydrid ist ätzend und brennbar.</li>
		<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel und rekristallisieren Sie aus 9:1 Ethylacetat/Methanol (Ausbeute: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), farbloser Feststoff). 
		Vorsicht! Ethylacetat ist reizend und brennbar. Vorsicht! Methanol ist giftig und brennbar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oxidation: Synthese von N-Acetyl-5-brom-6-chloranthranilsäure (7)
	<ol>
		<li>Reflux ein Gemisch aus 2,30 g (8,76 mmol) aus 6 (Erzeugnis aus Schritt 1.1) und 2,10 g (8,52 mmol) MgSO4•7H2O in 40 ml Wasser in einem 3-Hals-Rundkolben mit Kühler und Tropftrichter.</li>
		<li>50 ml gesättigteKMnO 4-Lösung in Wasser über einen Zeitraum von 3 Stunden tropfenweise zum Reaktionsgemisch geben. Anschließend weitere 2 Std. unter Rückfluss, ca. 135 °C Ölbad erhitzen. Vorsicht! Kaliumpermanganat ist schädlich und oxidierend.</li>
		<li>Auf Raumtemperatur abkühlen und das Pyrolusit (MnO2), das bei der Reaktion entsteht, filtrieren. 
		Vorsicht! Pyrolusit ist schädlich.</li>
		<li>Salzsäure (37%) bis zum pH-Wert 1 zum Filtrat geben, dann das Produkt filtrieren und im Vakuum trocknen (Ausbeute: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), farbloser Feststoff). 
		Vorsicht! Salzsäure ist ätzend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deacetylierung: Synthese von 5-Brom-6-chloranthranilsäure (8)
	<ol>
		<li>3,90 g (13,3 mmol) von 7 (Erzeugnis aus Schritt 1.2) in 70 ml 1 N wässriger Natronlauge auflösen und 5 Std. bei ca. 100 ΰC (Ölbad) erhitzen< />
		Vorsicht! Natriumhydroxid ist korrosiv.</li>
		<li>Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und Salzsäure (37%) bis pH 1 zugeben, dann das Produkt mit einem Büchner-Trichter filtrieren und im Vakuum trocknen (Ausbeute: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Anhydridbildung: Synthese von 5-Brom-6-chlorisatosäureanhydrid (9)
	<ol>
		<li>8,17 g (32,6 mmol) von 8 (Erzeugnis aus Schritt 1.3) werden in 33 ml trockenem Acetonitril suspendiert. 
		Vorsicht! Acetonitril ist schädlich und brennbar.</li>
		<li>Bei Raumtemperatur umrühren und 5,3 ml und eine Lösung von 3,22 g (10,8 mmol) Triphosgen in 18,5 ml trockenes Dichlormethan tropfenweise gleichzeitig über einen Zeitraum von 30 min hinzufügen. Anschließend 3 Std. bei 50 °C (Ölbad) erhitzen. Vorsicht! Pyridin ist gesundheitsschädlich und brennbar. 
		Vorsicht! Triphosgen ist giftig und kann Phosgen freisetzen.</li>
		<li>Entfernen Sie etwa 75 % des Lösungsmittels und löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser und filtrieren Sie Ihr Produkt. Mit einer kleinen Menge kaltem Dichlormethan waschen.</li>
		<li>Trocknen Sie das Produkt im Vakuum (Ausbeute: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-Alkylierung: Synthese von 5-Brom-6-chlor-N-[(methoxycarbonyl)allyl]-isatosäureanhydrid (10)
	<ol>
		<li>25 g (90 mmol) von 9 (Erzeugnis aus Schritt 1.4) werden in 250 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und mit einem Eisbad abgekühlt 
		Vorsicht! Dimethylformamid ist schädlich und brennbar</li>
		<li>Portionsweise 1,15 Äquivalente Natriumhydrid (60 % Paraffin) zugeben. 
		Vorsicht! Natriumhydrid ist ätzend und brennbar; Starke Reaktion mit Wasser/Eis.</li>
		<li>Nach 30 min Rühren bei 0 °C auf Raumtemperatur erwärmen lassen und 1,2 Äquivalente Allylbromoacetat tropfenweise zugeben.</li>
		<li>Nach 5-stündigem Rühren löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von 500 ml destilliertem Wasser ab und filtrieren Sie Ihr Produkt.</li>
		<li>Waschen Sie das Produkt mit Wasser (3 Mal, 100 ml) und trocknen Sie es im Vakuum (Ausbeute: 93 % (31,5 g, 84,1 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Anhydrid-Öffnung: Synthese von 5-Brom-6-chlor-N-(methoxycarbonylallyl)-anthranilsäure-Allylester (11)
	<ol>
		<li>10 g (27 mmol) von 10 (Erzeugnis aus Schritt 1.5) werden in 100 ml Allylalkohol gelöst. 
		Vorsicht! Allylalkohol ist schädlich und gefährlich für die Umwelt.</li>
		<li>Fügen Sie portionsweise 350 mg (8,70 mmol) Natriumhydrid (60% Paraffin) hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie nach 6,5 Stunden oder über Nacht das Lösungsmittel.</li>
		<li>Das Rohprodukt wird einer Säulenchromatographie unterzogen (Säule 30 x 6 cm; 240 g Kieselsäure), Petrolether/Ethylacetat 2:1; RF = 0,66), (Ausbeute: 80% (8,30 g, 21,3 mmol), gelbes Öl). 
		Vorsicht! Petrolether ist brennbar, reizend und gefährlich für die Umwelt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dieckmann-Kondensation: Synthese von 5-Brom-4-chlor-indoxylsäure-Allylester (12)
	<ol>
		<li>3,0 g (7,7 mmol) von 11 (Erzeugnis aus Schritt 1.6) und 1,75 g (15,6 mmol) Kalium-tert-butoxid in 100 ml Trockendiethylether mischen 
		Vorsicht! Kalium-tert-butoxid ist korrosiv und brennbar. 
		Vorsicht! Diethylether ist gesundheitsschädlich und hochentzündlich.</li>
		<li>Die Mischung unter Rückfluss (Kühler) 2 Std. bei 40-45 °C erhitzen.</li>
		<li>Entfernen Sie etwa 75 % des Lösungsmittels und fügen Sie verdünnte Salzsäure (100 ml, 1 M) hinzu. 
		Vorsicht! Nicht vollständig trocknen, es kann zu Zersetzungen kommen.</li>
		<li>Das Produkt filtrieren und im Vakuum trocknen (Ausbeute: 84% (5,14 g, 15,5 mmol), farblos bis leicht grün fest).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indoxyl-Glykosid: Synthese von X-Gal17
<ol>
	<li>Phasentransfer-Glykosylierung: Synthese von (5-Brom-4-chlor-indox-3-ylsäure-allylester) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-galactopyranosid (14)
	<ol>
		<li>400 mg (1,21 mmol) der Indoxylsäure Allylester 12 (Erzeugnis aus Schritt 1.7), 410 mg (1,21 mmol) Tetrabutylammoniumhydrogensulfat und 500 mg (1,21 mmol) des Spenders 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-ᴅ-galactopyranosylbromid (α-Acetobromogalactose) in 10 ml Dichlormethan mischen. Vorsicht! Tetrabutylammoniumhydrogensulfat ist schädlich.</li>
		<li>10 ml einer wässrigen Lösung von Kaliumcarbonat (1 M) zugeben. 
		Vorsicht! Kaliumcarbonat ist ätzend.</li>
		<li>Bei Raumtemperatur bis zum vollständigen Verzehr des Spenders (TLC: Petrolether/Ethylacetat) rühren.</li>
		<li>Die organische Phase (Scheidetrichter) abtrennen, über Na2SO4 trocknen und das Lösungsmittel entfernen.</li>
		<li>Das Rohprodukt wird einer Säulenchromatographie unterzogen (Erdölether/Ethylacetat 1:1; RF = 0,33). (Ausbeute: 86% (690 mg, 1,04 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Esterspaltung und Decarboxylierung: Synthese von (N-Acetyl-5-brom-4-chlorindol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-galactopyranosid (15)
	<ol>
		<li>600 mg (0,908 mmol) von 14 (Erzeugnis aus Schritt 2.1) werden in 15 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst. 
		Vorsicht! Tetrahydrofuran ist gesundheitsschädlich und brennbar.</li>
		<li>800 μl Morpholin und 105 mg (9,09 μmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) zugeben und über Nacht bei Raumtemperatur umrühren. 
		Achtung! Morpholin ist brennbar und ätzend.</li>
		<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel.</li>
		<li>400 mg (2,40 mmol) Silberacetat, 800 mg (5,79 mmol) Kaliumcarbonat und 10 ml Essigsäureanhydrid zugeben. 
		Vorsicht! Silberacetat ist reizend und gefährlich für die Umwelt.</li>
		<li>Bei 90-100 °C 20 min erhitzen.</li>
		<li>Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur mit Dichlormethan verdünnen.</li>
		<li>Waschen Sie die Mischung zweimal mit Wasser und einmal mit einer verdünnten NaHCO3-Lösung (10%). 
		Vorsicht! Natriumbicarbonat ist ätzend.</li>
		<li>Die organische Phase über Na2SO4 (Filter) trocknen und das Lösungsmittel entfernen.</li>
		<li>Das Rohprodukt einer Säulenchromatographie (PE/EA 1:1; RF = 0,24), (Ausbeute: 88% (495 mg, 8,00 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zemplén-Deacetylierung: Synthese von (5-Brom-4-chlor-indol-3-yl)-β-ᴅ-galactopyranosid (16)
	<ol>
		<li>396 mg (0,436 mmol) 15 (Erzeugnis aus Schritt 2.2) werden in 10 ml Methanol gelöst.</li>
		<li>Eine katalytische Menge Natriummethanolat zugeben und über Nacht bei Raumtemperatur umrühren. 
		Vorsicht! Natriummethanolat ist brennbar und korrosiv.</li>
		<li>Neutralisieren Sie mit Amberlite IR-120 H+ (Filter) und Konzentrat. 
		Vorsicht! Amberlite IR-120 H+ ist reizend.</li>
		<li>Trocknen Sie das Produkt im Vakuum (Ausbeute: 87% (170 mg, 0,416 mmol), farbloser Feststoff).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Veranschaulichung des Modellexperiments: Aktivitätsnachweis von β-Galactosidase mit X-Gal
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine 0,5 mM Lösung von X-Gal in 500 μl Puffer (Tris-HCl 20 mM; pH 7,4; 50 mM NaCl, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure; oder einen anderen geeigneten Puffer für Ihr Enzym) in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor (X-Gal kann in einigen μl Dimethylsulfoxid gelöst werden).</li>
	<li>1 μl β,1-3-Galactosidase (EC 3.2.1.23 10.000 U/ml) oder eine andere geeignete β-Galactosidase) zugeben und bei 37 °C schütteln (600 rps).</li>
	<li>Verfolgen Sie die Reaktion. Der indigoartige Farbstoff bildet sich nach kurzer Zeit.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Aufgrund schlechter Ausbeuten und Limitierungen, insbesondere für glukoseartige Strukturen und komplexere Saccharide, wurde ein neuartiger synthetischer Ansatz für Indoxylglykoside entwickelt. Indoxylsäureester erwiesen sich als wertvolle wichtige Zwischenprodukte und wurden auf einem modularen, skalierbaren Weg gewonnen. Alle Schritte sind ergiebig und durch billige Ausgangsmaterialien und einfache Aufarbeitung sind Multi-Gramm-Synthesen möglich. Der Vorteil des Allylester-Ansatzes ist die Blockierung der reaktiven 2-Po...

Über lange Zeit war die Herstellung von Indigo ein wirtschaftlich sehr wichtiger Prozess. Bevor großtechnische chemische Synthesen kostengünstigen Zugang zu Indigo ermöglichten, wurden die Vorläuferstoffe bereits vor christlicher Zeitrechnung aus natürlichen Quellen gewonnen. Der Anbau indigoproduzierender Pflanzen (natürliches Indigo) in Europa wurde im 17th Jahrhundert unrentabel, da der Gehalt an Indigovorläufern in der indischen Indigopflanze (0,2–0,8 %) etwa 30-mal höher ist. Gegen Ende des 19. Jahrhunderts verdrängte die chemische Synthese von Indigo den herkömmlichen Anbau1,2.
Natürlicherweise in Pflanzen vorkommende Indigovorstufen umfassen Indican (1), Insatan A (2) und Isatan B (3) (Abbildung 1). Alle bestehen aus einem mit einer glycosylierten Restgruppe verbundenen Indoxyl-Motiv. Der Abbau der glycosidischen Bindung, beispielsweise durch enzymatische Hydrolyse, führt zur Freisetzung von Indoxyl (4). Indoxyl selbst ist nahezu farblos, kann aber rasch zu einem Indigofarbstoff (5) oxidiert werden. Diese empfindliche Reaktion wurde in der Biochemie, Histochemie, Bakteriologie und Molekularbiologie zur Überwachung enzymatischer Aktivitäten angepasst. Eine Aktivitätsprüfung in vivo, ohne Isolierung oder Reinigung der Enzyme, sowie schnelle Tests auf Agarplatten oder in Lösung (z. B. Blau-Weiß-Screening, Mikrogefäße) sind möglich. Abhängig von der mit der Indoxyl-Einheit verknüpften Restgruppe (z. B. Ester, Glycoside, Sulfate) wurden geeignete Substrate für verschiedene Enzymklassen (z. B. Esterasen, Glycosidasen, Sulfatasen) entwickelt3. Im Folgenden steht die Bildung und Anwendung von Indoxylglycosiden im Mittelpunkt.
<img alt="Diagramm des Indican-Hydrolyseprozesses mit Darstellung von Indolderivaten und der Bildung von Indigofarbstoff." src="/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1: Natürliche Indigovorstufen und Bildung des Indigofarbstoffs durch Hydrolyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.</a>
Das Substitutionsmuster des Indoxylrests bestimmt die Farbe und die physikalischen Eigenschaften des resultierenden Indigofarbstoffs. Die gebräuchlichsten Substitutionsmuster sind 5-Bromo-4-chloro (abgekürzt mit X; grünlich-blau), 5-Bromo (blau) und 5-Bromo-6-chloro (magenta), da diese die kleinsten Farbstoffpartikel bilden, keine Granula ausbilden und die geringste Diffusion von den Hydrolysestellen aufweisen. Letztere Eigenschaft ist besonders wichtig für in vivo-Experimente3.
Der erste Bericht über ein indigogenes Verfahren zur Nachweisung der Esteraseaktivität wurde 1951 von Barrnett und Seligman veröffentlicht, die Indoxylacetat und Indoxylbutyrat verwendeten4. Etwa ein Jahrzehnt später wurde das indigene Prinzip für die Lokalisierung von Säuger-Glucosidasen angepasst5. Bis heute wurden mehrere Indoxylglycoside entwickelt, obwohl sich ihre Synthese als schwierig erwiesen hat. Die meisten Synthesen basieren auf der Verwendung eines N-acetylierten Indoxyls als Akzeptor und des jeweiligen glycosylierten Halid-Donors6–14. Die Glycosylierung wird in Aceton mit Natriumhydroxid durchgeführt. Unter diesen Bedingungen treten zahlreiche Nebenreaktionen auf, die die Ausbeute erheblich verringern. Insbesondere für Glucose-ähnliche Strukturen wurden sehr niedrige Glycosylierungsausbeuten berichtet (z. B. 15 % für (N-Acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranosid6 und 26 % für (N-Acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetyl-β-ᴅ-xylobiosid14 in einem jüngeren Beispiel). Durch einen neuartigen Ansatz unter Verwendung von Indoxylsäureestern wurden eine beträchtliche Anzahl an Indoxylglycosiden in guten Ausbeuten hergestellt (z. B. (N-Acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranosid mit 57 % Ausbeute).
Das folgende Protokoll beschreibt die einfache Synthese des Allylesters der Indoxylsäure (5-Brom-4-chlor) und darauf basierend die Synthese eines Indoxylglycosids (X-Gal). Ein einfaches Modellexperiment zeigt die Enzymaktivität von β-Galactosidase unter Verwendung von X-Gal.

<table><tbody><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10298</td><td>Ätzendes, entzündliches</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608-001-00-3</td><td>Gesundheitsschädlicher, entzündbarer</td></tr><tr><td>Allylalkohol</td><td>Aldrich</td><td>453021</td><td>Gesundheitsschädlich, umweltschädlich</td></tr><tr><td>Amberlite IR-120 H+</td><td>Fluka</td><td>06428</td><td>Reizend</td></tr><tr><td>Bromolessigsäure</td><td>Merck</td><td>802260</td><td>Ätzend, giftig, gefährlich für die Umwelt</td></tr><tr><td>4-Brom-3-chlor-2-methylanilin</td><td>ABCR</td><td>AB 171687</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>ACROS</td><td>326850010</td><td>Schädlicher</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>10274</td><td>gesundheitsschädliches, hochentzündliches</td></tr><tr><td>Dimethylformamid</td><td>ACROS</td><td>348430010</td><td>gesundheitsschädliches, entzündliches</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>607-022-00-5</td><td>Reizend, entzündbar</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>AppliChem</td><td>A1103.0500</td><td>Reizend</td></tr><tr><td>&beta; 1,3-Galactosidase, rekombinant, E. coli</td><td>Calbiochem</td><td>345795</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>VWR</td><td>20252.290</td><td>Korrosives</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfathydrat</td><td>Merck</td><td>105885</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ACROS</td><td>326950010</td><td>Giftiges, entzündliches</td></tr><tr><td>Morpholin</td><td>Janssen Chimica</td><td>15.868.57</td><td>Ätzend, entzündlich</td></tr><tr><td>Erdölether</td><td>Azelis</td><td>111053</td><td>Entzündlich, reizend, gefährlich für die Umwelt</td></tr><tr><td>Kaliumcarbonat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12005</td><td>Ätzendes</td></tr><tr><td>Kaliumpermanganat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12056</td><td>gesundheitsschädliches, oxidierendes</td></tr><tr><td>Kalium-tert-butoxid</td><td>Merck</td><td>804918</td><td>ätzendes, entzündliches</td></tr><tr><td>Pyridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>613-002-00-7</td><td>gesundheitsschädliches, entzündliches</td></tr><tr><td>Silberacetat</td><td>Fluka</td><td>85140</td><td>Reizend, umweltschädlich</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12144</td><td>Korrosives</td></tr><tr><td>Natriumhydrid</td><td>Merck</td><td>814552</td><td>Ätzendes, entzündliches</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Riedel-de H&auml; en</td><td>S181200</td><td>Ätzendes</td></tr><tr><td>Natriummethanolat</td><td>Merck</td><td>806538</td><td>Ätzendes, entzündliches</td></tr><tr><td>Natriumsulfat</td><td>Gr&uuml; ssing</td><td>12175</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabutylammoniumhydrogensulfat</td><td>Lancaster</td><td>5438</td><td>gesundheitsschädliches</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87371</td><td>gesundheitsschädliches, entzündliches</td></tr><tr><td>Tetrakis (Triphenylphosphin)palladium(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td></td></tr><tr><td>Triphosgen</td><td>Fluka</td><td>15217</td><td>Giftiges</td></tr><tr><td>Tris (Hydroxymethyl)aminomethan Hydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td>Reizend</td></tr></tbody></table>

synthese von indoxyl-glykoside zum nachweis von glycosidase aktivitäten

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl Glykoside erwies sich als wertvolle und vielseitige Werkzeuge zur Überwachung Glycosidase Aktivitäten. Indoxyle durch enzymatische Hydrolyse freigesetzt und werden schnell oxidiert, beispielsweise durch Luftsauerstoff, um Farbstoffe Indigo. Diese Reaktion ermöglicht eine schnelle und einfache Screening in vivo ohne Isolierung oder Reinigung von Enzymen sowie Schnelltests auf Agarplatten oder in Lösung (zB blau-weiß Screening, Mikrovertiefungen) und ist in der Biochemie verwendet, Histochemie, Bakteriologie und molekularen Biologie. Leider ist die Herstellung solcher Substrate als schwierig erwiesen, aufgrund verschiedener Nebenreaktionen und die geringe Reaktivität des Indoxyl Hydroxylfunktion. Speziell für Glukose artigen Strukturen geringe Ausbeuten beobachtet. Unser neuartiger Ansatz beschäftigt indoxylic Ester als Schlüssel-Zwischenprodukte. Indoxylic Estern mit unterschiedlichen Substitutionsmuster wurden auf skalierbare Wege vorbereitet. Phasentransfer Glycosylierungen mit den Akzeptoren und peracetyliertenGlycosylhalogeniden kann unter herkömmlichen Bedingungen in hohen Ausbeuten durchgeführt werden. Esterspaltung und nachfolgende milde Silber vermittelt Glykosylierung ergibt die peracetylierten indoxyl Glycoside in hohen Ausbeuten. Schließlich Entschützung nach Zemplén geführt.

Die ersten Synthesen von Indican und 5-Brom-indican wurden bereits 1927 und 1929 von Robertson veröffentlicht15,16. Durch die Verwendung von Methylester des Indoxylsäuremethylesters als Akzeptor wurde die reaktive 2-Position blockiert, wodurch Nebenreaktionen teilweise unterbunden wurden. Die Glykosylierung in Aceton/Natriumhydroxid, gefolgt von der Entschützung und Decarboxylierung (160 °C, Essigsäureanhydrid, 1 Stunde) sowie abschließend der Deacetylierung, führte zur Gewinnung von Indican und 5-Brom-indican...

Indoxylglykoside sind etablierte und weit verbreitete Werkzeuge für das Enzymscreening und die Überwachung der Enzymaktivität. Insbesondere für glukoseartige Strukturen erwiesen sich frühere Synthesen als schwierig und ergiebig. Unser neuartiger Ansatz verwendet Indoxylsäureester als wertvolle Zwischenprodukte, um eine beträchtliche Anzahl von Indoxylglykosiden in guten Ausbeuten zu erhalten.

Synthese von Indoxyl-Glykoside zum Nachweis von Glycosidase Aktivitäten

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen neuartigen synthetischen Ansatz für Endo-Glycoside vorzustellen, einschließlich solcher mit komplexen Kohlenhydratstrukturen in guten Ausbeuten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein inic-saures allo-Ester-Acceptor aus Methyl lene synthetisiert wird. Der zweite Schritt beinhaltet die Glycosylierung dieses Acceptors mit einem acetylierten glycosylen Hali-Donor.Anschließend wird das Allel-Ester durch einen Palladiumkatalysator gespalten, und eine nachfolgende, silbervermittelte Decarboxylierung dient zur Herstellung des acetylierten Inox-Glycosids. Der letzte Schritt ist die Deacetylierung mittels Zeplan, um das nicht geschützte Inox-Glycosid zu erhalten. Letztendlich wird das hergestellte chromogene Substrat für einen qualitativen Enzymaktivitätstest verwendet.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass glykosidische Verbindungen komplexer und labiler Kohlenhydratstrukturen leicht hergestellt werden können. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir eine Veröffentlichung von Alexander Robertson aus dem Jahr 1927 lasen, der die erste Synthese von Inca-Employ-inic-Säure-Methylester entwickelte. Spätere Methoden verwendeten Occi-Inox-Zellakzeptoren aufgrund der besseren Zugänglichkeit, litten jedoch unter geringen Ausbeuten und Problemen bei der Reinigung. Um die Synthese zu beginnen, wird ein Satellit, ein halogen-substituiertes Lene, wie im Textprotokoll beschrieben, eingesetzt.Dann unter Rückfluss in einem Dreihals-Rundkolben 2,3 g des resultierenden halogenierten Methylolacetamids in 40 mL Wasser mit 2,1 g Magnesiumsulfat-Heptahydrat über einen Zeitraum von drei Stunden. Geben Sie tropfenweise 50 mL einer gesättigten wässrigen Kaliumpermanganatlösung zu und führen Sie das Gemisch anschließend weitere zwei Stunden bei etwa 135 °C im Ölbad unter Rückfluss. Kühlen Sie das Gemisch auf Raumtemperatur ab und filtrieren Sie es, um das Pyrozyt-Begleitprodukt zu entfernen. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit 37 %iger Salzsäure auf 1 ein.Als Nächstes filtrieren Sie das Produkt aus dem Lösungsmittel und trocknen es unter Vakuum. Nach dem Trocknen isolieren Sie das Deci-Produkt gemäß der schriftlichen Anleitung und suspendieren anschließend 8,17 Gramm des erhaltenen Deci-Produkts in 33 Milliliter trockenem Acetonid-Triazol. Geben Sie innerhalb von 30 Minuten gleichzeitig tropfenweise 5,3 Milliliter Pyridin und eine Lösung von 3,22 Gramm Tristin in 18,5 Milliliter trockenem Dichlormethan zur Lösung hinzu. Erwärmen Sie danach die Reaktion in einem Ölbad auf 50 Grad Celsius.Nach drei Stunden etwa 75 % des Lösungsmittels entfernen und 100 Milliliter destilliertes Wasser hinzufügen, um die Reaktion abzubrechen. Das Produkt abfiltrieren und den Filter anschließend mit fünf bis 10 Millilitern kaltem Chloromethan waschen. Nach dem Waschen das Produkt im Vakuum trocknen, das Alkylierungsprodukt dieses Zwischenprodukts herstellen und dann das resultierende Anhydrid gemäß dem schriftlichen Protokoll öffnen.Isolieren Sie das resultierende Produkt durch Säulenchromatographie. Beginnen Sie die Dickman-Kondensation, indem Sie drei Gramm des Produkts mit 1,75 Gramm Kaliumoxid in 100 Milliliter trockenem Dathylether-Rückflussgemisch zwei Stunden lang bei 40 bis 45 Grad Celsius umsetzen. Entfernen Sie anschließend etwa 75 % des Lösungsmittels unter Vakuum und fallen Sie das Produkt mit 100 Milliliter einmolarer Salzsäure aus. Das Produkt filtrieren und anschließend im Vakuum trocknen. Um die Synthese von XG zu beginnen, 400 Milligramm des Allylesters der Indoclicsäure mit 410 Milligramm TBAs und 500 Milligramm α-Xto-bromgalactose in 10 Milliliter Chloromethan versetzen. Anschließend 10 Milliliter einer einmolarigen wässrigen Kaliumcarbonatlösung zur Reaktion hinzufügen.Rühren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur etwa drei Stunden lang und überwachen Sie den Verbrauch von alpha-Acetobromacetalose mittels Dünnschichtchromatographie in einer Lösung aus Petroleumether und Ethylacetat im Verhältnis 1:1. Nach vollständigem Verbrauch des alpha-Acetobromgalactoses trennen Sie die organische Phase der Lösung mit einem Trenntrichter ab. Trocknen Sie anschließend die organische Phase über Natriumsulfat, um verbleibendes Wasser zu entfernen, und reinigen Sie das Produkt dann mittels Säulenchromatographie, wie im Textprotokoll beschrieben, um den allo-Ester abzuspalten. Lösen Sie 600 Milligramm der Galactopuric-Seite in 15 Milliliter trockenem Tetrahydrofuran auf.Entfernen Sie das Lösungsmittel im Vakuum, geben Sie 400 Milligramm Silberacetat, 800 Milligramm Kaliumcarbonat und 10 Milliliter Essigsäureanhydrid zum Produkt hinzu und erhitzen Sie die Reaktion anschließend etwa 20 Minuten lang auf etwa 95 Grad Celsius. Lassen Sie die Reaktion auf Raumtemperatur abkühlen und verdünnen Sie sie dann mit 50 Millilitern Dichlormethan. Zur Aufarbeitung dieser Reaktion waschen Sie die Mischung zweimal mit Wasser und einmal mit einer 10%igen Natriumbicarbonatlösung.Trocknen Sie die organische Phase über Natriumsulfat und konzentrieren Sie anschließend die Lösung. Reinigen Sie das resultierende acetylierte Galacto-Puric-Seitenprodukt mittels Säulenchromatographie. Lösen Sie danach 396 Milligramm des gereinigten Materials in 10 Milliliter Methanol.Fügen Sie eine spatelspitzenmäßige Menge Natriummethanolat hinzu und rühren Sie die Reaktion über Nacht um. Neutralisieren Sie die Reaktion mit einem Kationenaustauscherharz und konzentrieren Sie die Lösung anschließend im Vakuum. Trocknen Sie das Produkt schließlich im Vakuum, um Xal zur Überprüfung der Gültigkeit des Synthesewegs zu erhalten.Zunächst lösen Sie das Xal in wenigen Mikrolitern Dimethylsulfoxid auf. Anschließend stellen Sie eine 0,5 mM Stammlösung von Xal in einem geeigneten Puffer her. Danach geben Sie ein Mikroliter Beta-Galacto hinzu und schütteln das Gemisch bei 600 Umdrehungen pro Sekunde.Überwachen Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius visuell auf die Bildung eines intensiven Indigofarbstoffs. Die Bildung eines blauen Farbstoffs in der Lösung weist eindeutig auf enzymatische Aktivität in Doxyl hin. Glykoside sind wichtig zur Überwachung der Glykosidase-Aktivität, sind jedoch schwer zu synthetisieren.Der hier vorgestellte synthetische Ansatz liefert das endgültige endo Galacto Puric Seitenprodukt in einer Gesamtausbeute von 66 %. Eine deutliche Verbesserung gegenüber der bisherigen Methodik, die lediglich eine Ausbeute von 28 % ergab. Die erhaltenen Doxyl-Glycoside können zur Überprüfung der Aktivität reiner oder unreiner Enzymlösungen verwendet werden.In diesem Beispiel wurde die Indigofärbung nur in Vertiefungen beobachtet, die Beta-Galacto enthielten, und sie entstand bereits bei einer Konzentration von lediglich 0,1 Millimolar XG. Sobald der Indoc-Zellakzeptor hergestellt ist, kann diese synthetische Route zur Gewinnung von Indoc-Zellglykosiden innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Synthese und Nutzung von inialen Glykosiden besitzen. Diese synthetische Route liefert diese Verbindungen in guter Ausbeute, trotz ihrer komplexen Strukturen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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