Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren

Ziel dieses Verfahrens ist es, neuartige Modelle für Glioblastome zu schaffen und letztlich neuartige Therapieansätze zu entwickeln, indem die Bildung von Glioblastomen mit spezifischen genetischen Mutationen in Mäusen induziert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Transposon-Plasmide erzeugt werden, die für die spezifischen Gene von Interesse kodieren. Der nächste Schritt besteht darin, die Plasmide mit einem Transfektionsreagenz vorzubereiten und in den Seitenventrikel von neugeborenen Mäusen zu injizieren.

Die Aufnahme in die Tumorprogression wird dann durch Lumineszenz überwacht. Wenn die Tiere zahlreicher werden, werden sie für histologische und immunhistochemische Analysen geopfert. So werden neue Glioblastome mit spezifischen genetischen Veränderungen in Wildtyp- oder gezielten genetischen Hintergründen induziert.

Diese Tumoren können in vivo untersucht oder in vitro verwendet werden, um neue Zelllinien zu erzeugen, die für biochemische Analysen und Zytotoxizitätsexperimente mit Chemotherapeutika geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z.B. orthotopen Injektionen von Glioblastom-Zelllinien, besteht darin, dass Tumore durch die maligne Umwandlung von endogenen Zellen in ein immunkompetentes Tier unter Verwendung von genetischen Veränderungen, die sehr spezifisch ausgewählt werden, induziert werden. Dieser Prozess reproduziert die Ätiologie der menschlichen Krankheit genauer und rekapituliert die hervorstechenden histopathologischen Merkmale des menschlichen GBM.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neuroonkologie zu beantworten, z. B. welche Treibermutationen für die Induktion verschiedener Arten von Glioblastomen multiforme, klassischen, präneuralen, neuralen Chy bei Erwachsenen oder bei pädiatrischen Tumoren verantwortlich sind. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von GPM seit neuartigen Chemotherapeutika. Strahlenimmuntherapien oder eine Kombination davon können mit diesem Modell relativ schnell in vivo oder in vitro getestet werden.

Die Idee zu dieser Methode hatte ich zum ersten Mal, als ich mit meinem Kollegen Dr. John von der University of Minnesota diskutierte, der das erste Hirntumormodell unter Verwendung der Dornröschen-Transponierungen der vermittelten Integration von Onkogenen, einem Inhibitor von Tumorsuppressorgenen, in die genomische DNA des Wirts entwickelt hatte. Ich dachte, dass diese Methode sehr leistungsfähig wäre, um die Auswirkungen neuer Mutationen auf die Tumorprogression zu untersuchen und bei der Entwicklung gezielter Therapien für Hirntumore zu helfen. Drei bis vier Wochen vor dem Experiment einen Zuchtkäfig für Mäuse mit einem Männchen und einem Weibchen einrichten, ein farbiges Plastikiglu einbauen, um die Umgebung zu bereichern und die Paarungschancen zu erhöhen. Entfernen Sie das Männchen, sobald eine Trächtigkeit bestätigt wurde, und beginnen Sie 18 Tage nach dem Paarungstag mit der Überwachung des Weibchens bis zur Geburt.

Stellen Sie sicher, dass zum Zeitpunkt der Entbindung eine Leihmutter verfügbar ist. Führen Sie am ersten Tag nach der Geburt die intraventrikulären Injektionen durch. Bereiten Sie die Injektionslösung vor, indem Sie zuerst Ali unter Angabe von 20 Mikrolitern der DNA-Mischung, die die Transponierung auf Plasmiden enthält, in einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm DNA pro Mikroliter angeben.

Geben Sie dann ein Aliquot von 20 Mikrolitern PEI-Lösung in die DNA-Lösung und lassen Sie sie 20 Minuten bis eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren, wonach die Mischung auf Eis gelagert werden sollte. Befestigen Sie für die Injektionsnadel eine 10-Mikroliter-Spritze an einer 30-Gauge-Injektionsnadel, die bei 12,5 Grad abgeschrägt ist. Befestigen Sie dann die Spritze an einer Mikropumpe mit automatischer Injektion.

Testen Sie das Setup mit 10 Mikrolitern Wasser und achten Sie darauf, die Spritze zu leeren. Kühlen Sie nun das stereotaktische Stadium des Neugeborenen mit einer Aufschlämmung aus Trockeneis und Alkohol ab. Wenn es auf zwei bis acht Grad Celsius abgekühlt ist, fahren Sie mit den Injektionen fort.

Betäuben Sie zunächst einen Welpen, indem Sie ihn zwei Minuten lang auf Eis legen. Während der Welpe auf Eis liegt, befüllen Sie die Spritze mit der Injektionslösung. Sobald der Welpe betäubt ist, übertragen Sie ihn in den Rahmen und fixieren Sie seinen Kopf zwischen den mit Gaze bedeckten Ohrstangen.

Vergewissern Sie sich, dass die dorsale Seite des Schädels horizontal und parallel zur Rahmenoberfläche verläuft. Auch die Schädelnähte sollten deutlich sichtbar sein. Wenn der Kopf des Welpen nicht fest genug immobilisiert ist, bewegt er sich während der Injektion.

Wenn es jedoch zu fest zwischen die Ohrstangen des Rahmens gedrückt wird, ist das Lambda nicht sichtbar und der Druck im Kopf zwingt die injizierte Lösung zum Austreten. Wenn der Welpe fest am Rahmen festsitzt, wischen Sie den Kopf mit 70% Ethanol ab, senken Sie dann die Nadel und stellen Sie ihre Position so ein, dass sie das Lambda berührt. Heben Sie dann die Nadel an und bewegen Sie sie um 0,8 Millimeter seitlich und 1,5 Millimeter zählend. Dann senke es wieder ab, bis es die Haut leicht einspannt.

Notieren Sie sich die Koordinaten dieser Position. Dann senke die Nadel ab, 1,5 Millimeter durch die Haut und den Schädel und in die Rinde an der dortigen Seitenkammer. Injizieren Sie 0,75 Mikroliter über 90 Sekunden und warten Sie eine Minute, bis sich die Lösung während der Wartezeit dispergiert.

Der nächste Welpe, der injiziert werden soll, kann betäubt werden. Heben Sie nach dem Gewicht die Nadel langsam an und bringen Sie den Welpen dann an einen Erholungsort unter einer Heizlampe. Die Zeit von der Betäubung bis zur Erwärmung muss weniger als 10 Minuten betragen.

Je schneller, desto besser, überwachen Sie die Atmung und reiben Sie bei Bedarf sanft die Gliedmaßen, um die Atmung anzuregen. Sobald der Welpe aufgewärmt ist, eine rosige Farbe und einen gleichmäßigen Atem hat, bringen Sie ihn zu seiner Mutter zurück. Dies dauert in der Regel fünf bis sieben Minuten nach der Injektion.

Wenn mehrere Welpen injiziert werden, sollten sie alle geborgen werden, bevor sie an die Mutter zurückgegeben werden. Wenn nach einer halben Stunde noch nicht alle Welpen bereit sind, geben Sie ihr die Hälfte zurück und geben Sie den Rest später am Ende des Eingriffs zurück, überwachen Sie das Muttertier. Nach der Rückgabe der Welpen.

Wenn sie nicht auf die Welpen anspricht, setzen Sie die Leihmutter in den Käfig ein. Überwachen Sie 24 bis 72 Stunden nach der Injektion die Plasmidaufnahme und bringen Sie alle Jungtiere in sechs Well-Gewebekulturschalen, ein Welpen pro Well. Laden Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit 30 Milligramm pro Milliliter Luzifer in Kochsalzlösung oder PBS und setzen Sie eine 30-Gauge-Injektionsnadel ein.

Injizieren Sie 30 Mikroliter Lösung subkutan zwischen die Schulterblätter jedes Welpen, um eine Verletzung des Welpen zu vermeiden, und injizieren Sie die Lösung unter eine kleine Hautfalte. Übertragen Sie die Welpen sofort in ein In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebungssystem. Richten Sie eine Sequenz ein, um vier aufeinanderfolgende Bilder im Abstand von einer Minute mit automatischer Belichtung, großem Benning und einer Blende von eins aufzunehmen. Später.

Nach etwa 17 Tagen können die Tiere beginnen, makroskopische Tumore zu bilden, die durch Biolumineszenz und Histologie nachweisbar sind. Es kann auch bis zu sechs Wochen dauern, bis die Tumoren überwacht sind. Injizieren Sie 100 Mikroliter luziferische Lösung intraperitoneal mit einer 26-Gauge-Nadel.

Nach drei Minuten werden die Tiere in einer ISO-Fluor-Sauerstoff-Anästhesiekammer betäubt und in die Bildgebungskammer gelegt, die mit Kegeln ausgestattet ist, um das ISO-Fluor zu dispergieren. Nehmen Sie eine Serie von sechs Bildern im Zwei-Minuten-Intervall mit einer automatischen Belichtungszeit, mittlerem Binning und einer Blende von eins bei offener Blende auf. Die interessierende Region ist typischerweise ein Oval über dem Kopf, wobei die Lumineszenzintensität bei jedem Tier mit den gleichen Einstellungen gemessen wurde, um histopathologische Merkmale von SB-induzierten Glioblastomen zu charakterisieren.

C 57 schwarz wurden sechs neonatale Mäuse an P eins mit einem Plasmid und einer Beschichtung von Luciferase in Kombination mit NRA S und SV 40 großen T-Plasmiden, Inod-Transposons mit onkogener DNA injiziert. Alternativ wurde ein Plasmid, das für eine kurze Haarnadel P 53 mit PDGF beta kodiert, und ein GFP-Reporter in Kombination mit NRAS injiziert. Die Pseudo-Palis-Nekrose war ebenso offensichtlich wie die perivaskuläre und diffuse Nekrose ins Gehirn.

Parenchym-Glioblastome wurden ebenfalls mit Biolumineszenz überwacht. Tiere erliegen in der Regel der Tumorlast. Wenn die Lumineszenz eine Intensität von 10 erreichte, wurden die siebte bis 10 bis zur neunten kalibrierten Einheit kalibriert

Das mediane Überleben der Tiere hing vorhersehbar von den Kombinationen onkogener Transposons ab, die in das Gehirn des Neugeborenen injiziert wurden. Die aggressivsten Tumoren wurden mit NRS induziert und SV 40 große T-Antigen de novo Tumoren wurden durch ihre Expression charakteristischer Moleküle charakterisiert. Entstehende Tumoren, die dazu gebracht wurden, GFP zu exprimieren, die mit SHP 53 und nras induziert wurden, exprimierten den neuralen Stammzellmarker Neston, und einige exprimierten auch gliofibrilläres saures Protein.

Nach 56 Tagen wurde ein Tumor gefunden, der von zahlreichen GFAP-positiven Astrozyten umgeben war. Diese Tumorzellen exprimierten nein, aber kein GFAP. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Bildung von Glioblastomen induziert, spezifische genetische Mutationen durch intraventrikuläre Injektionen in neugeborene Mäuse beherbergt und wie man das Fortschreiten der Krankheit mit Biolumineszenz überwacht.

In diesem Artikel finden Sie Details zum einfachen Klonen neuer trans-Pro-Plasmide, zur Kodierung von Genen von Interesse, sowie zur Überwachung der Tumoren und zur Analyse mit Histologie und Immunhistochemie. Darüber hinaus finden Sie eine detaillierte Methode, wie man neue Glioblastom-Zelllinien aus Tieren mit gentechnisch veränderten Tumoren generieren kann. Wir hoffen, dass dieser Artikel dazu beitragen wird, die Entdeckung neuer Therapien für diese verheerende menschliche Krankheit zu beschleunigen.