Name: Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Lernen Sie die Transposon-vermittelte Plasmid-DNA-Integration in die Subventrikularzone neugeborener Mäuse zur Erzeugung von Glioblastom-Modellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung spezifischer genetischer Mutationen und Tumorprogression in vivo.

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Wir danken Dr. John Ohlfest und Dr. Stacey Decker13 für das großzügige Geschenk von Plasmiden und für die Ausbildung, die zur Beherrschung dieser Methode bereitgestellt wurde. Wir danken Marta Dzaman für ihre Hilfe bei der Standardisierung des Hämatoxylin-Eosin-Färbeverfahrens von paraffineingebetteten Schnitten. Wir danken auch Molly Dahlgren für die Durchsicht dieses Manuskripts und die hilfreichen Vorschläge. Diese Arbeit wird durch NIH/NINDS-Zuschüsse an MGC und PRL, Leah's Happy Hearts Foundation an MCG und PRL unterstützt. Alex's Lemonade Foundation Young Investigator Award und das St. Baldrick's Foundation Fellowship to CK.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Artikel werden wir ausführlich ein vielseitiges und reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung von neuen Modellen der GBM mit SB transposase- vermittelte Integration onkogenen Plasmid-DNA in die Zellen umgebenden Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen. Wir stellen ein Protokoll zur Transposon-Plasmiden mit neuen Genen von Interesse zu erzeugen, zu veranschaulichen, wie das Fortschreiten von Tumoren in lebenden Tieren zu überwachen und, wie histopathologischen und immunhistochemischen Eigenschaften dieser Tum...

Glioblastoma multiforme (GBM) ist die häufigste (60%) primäre Hirntumoren bei Erwachsenen, mit einer medianen Überlebenszeit von 15 bis 21 Monaten, wenn sie mit Operation, Bestrahlung und Chemotherapie 1 behandelt. Neuartige Therapien für GBM sind unerlässlich. Experimentelle Therapien erfordern Tests an Tiermodellen, die die wesentlichen Merkmale der menschlichen Krankheit angemessen zu reproduzieren. Strategien zur GBM induzieren bei Nagetieren sind chemische Mutagenese mit alkylierenden Substanzen, Keimbahn oder somatischen genetischen Veränderungen, oder Transplantation mit Gliomzelllinien 2. Die am häufigsten verwendeten Modelle verwenden die Implantation Gliomzelllinien entweder orthotopisch, in das Gehirn oder subkutan mit syngenen Zellen in Tieren, die mit identischen Genotyp; oder xenogene Zellen, am häufigsten menschlichen GBM-Zelllinien, in Immun implantiert beeinträchtigt Mäusen 3. Xenografts bieten viele Vorteile für die Untersuchung der intrakraniellen Tumoren: Bequemlichkeit der Reproduzierbarkeit, standardized Wachstumsraten, Zeit des Todes und der Tumorlokalisation. Allerdings haben diese Modelle Einschränkungen auf Grund der künstlichen, invasive chirurgische Ansatz für Implantationen und begrenzte Fähigkeit, histologische genau zu reproduzieren verwendet charakteristischen Merkmale der menschlichen GBM (WHO Grad IV): Pseudo pallisading Nekrose, Kern Atypien, diffuse Invasion, Mikrogefäßproliferations und die Bildung von glomeruloid Gefäßveränderungen 4-7. Induktion der GBM durch Verändern des Genoms von somatischen Zellen mit onkogener DNA, entweder mit viralen Vektoren 8-12 oder mit Transposon-vermittelte Integration 13 reproduziert enger die Ätiologie der Krankheit beim Menschen und rekapituliert histopathologischen Merkmale der menschlichen GBM. Historisch gesehen, Tumoren des ZNS wurden klassifiziert, basierend auf der wahrgenommenen Ursprungszelle, die beobachtet wurde, würde ein prädiktiver Faktor für das Überleben 14 sein. GBM sind in primäre und sekundäre eingestuft. Anzeichen dafür, today weist auf die sehr heterogenen Natur der primären Glioblastomen 15. Sekundäre GBM (15%), das Ergebnis der malignen Transformation von Astrozytomen niedrig (WHO Grad I) und anaplasic Astrozytome (WHO Grad II) werden mit früheren Ausbruch der Krankheit, bessere Prognose und einem &quot;proneurale&quot; Muster der Genexpression assoziiert , während primäre GBM (85%) zeigen einen späten Beginn, schlechte Prognose und Gliazellen (klassisch), neuronale oder mesenchymalen Expressionsmuster. Ob diese Muster der Genexpression korrelieren mit der eigentlichen Ursprungszelle des Tumors noch intensiv erforscht. Sammeln von Daten zeigt, dass die Kombination von genetischen Mutationen, die mit GBMs zugehörige prädiktive Überleben sind. Beispielsweise werden Verlust Heterozygotie (LOH) der Chromosomen 1p / 19q, IDH1 Mutationen, PDGFRα Amplifikationen mit sekundären GBMs, proneurale Expressionsmuster und bessere Prognose assoziiert, während EGFR-Überexpression, Notch und Sonic Hedgehog-Pfad aktiviert, Nf1 und PTEN Verlust und Mutationen von p53 mit neuronalen, Klassik, oder mesenchymale primären GBM und schlechtere Prognose 16,17 korreliert. Das Aufkommen der Großsequenzierungsprojekte und die Ansammlung von zahlreichen Patientenproben zum Testen zur Verfügung bringt eine Fülle von neuen Informationen in Bezug auf genetische Mutationen und Wege in GBM Pathogenese und Progression und die Möglichkeit der individualisierten Medizin, wo Therapien gezielt auf zugeschnitten werden verwickelt die genetische Anomalien des Patienten. Letztlich, um die Aussagekraft dieser Mutationen und Wege in systematischer Weise zu bewerten und mögliche Behandlungen jeweils zu testen, benötigt Tiermodellen der GBM mit vorgegebenen genetischen Veränderungen. Transposon-vermittelte Integration genomischer DNA bietet ein gangbarer Weg. Das Transposon Sleeping Beauty Systems, Mitglied des Tc1 / mariner Klasse von Transposons, wurde &quot;erwacht&quot; (gebaut) in einem mehrstufigen Verfahss von ortsspezifische Mutagenese von einer Lachs Transposasegen, die vor mehr als ruhend 10.000.000 Jahre 18,19 wurde. Im Wesentlichen DNA Transposons durch spezifische Sequenzen (inverted repeats / direkte Wiederholungen: IR / DR) flankiert kann in das Genom in einem &quot;cut and paste&quot; Weise durch die Aktivität des Dornröschen Transposase integriert werden. Die Transposase erkennt die Enden der IR Sites, schneidet das Transposon und integriert sie zufällig in einem anderen DNA-Region zwischen den Basen T und A, Basen, die an jedem Ende des Transposons während der Umsetzung (Abbildung 1a) dupliziert werden. Dornröschen Transposase wird aus drei Domänen, ein Transposon-bindende Domäne, eine Kernlokalisationssequenz und eine katalytische Domäne umfasst. Vier Transposase Moleküle sind erforderlich, um die beiden Enden des Transposons zusammen zu bringen und lassen für die Umsetzung ist jedoch, wenn zu viele Moleküle des Transposase vorhanden sind, sie dimerisieren können und tetramerize zu hemmendie Umsetzung Reaktions 20. Eine effiziente Transpositionsreaktion benötigt eine optimale Verhältnis von Transposase Transposons. Die DNA, die Transposase kodiert, kann auf demselben Plasmid mit dem Transposon (in cis) oder auf einem anderen Plasmid (in trans) geliefert werden. Um das optimale Verhältnis zwischen der Transposase und Transposons zu gewährleisten, kann ein Promotor mit ausreichender Aktivität für die Expression der Transposase (für die &quot;cis&quot; Modell) oder das Verhältnis der Plasmide in der Injektionslösung kann optimiert werden, gewählt werden (für den &quot;trans&quot; Modell). Das Transposon Sleeping Beauty Systems erfolgreich der funktionellen Genomik, Insertionsmutagenese, Transgenese und somatische Gentherapie 21 verwendet werden. Als synthetisches Konstrukt zu einem funktionellen Molekül aus einem ruhenden Lachs Variante überarbeitet, wird die Dornröschen Transposase nicht auf andere Transposons in Menschen oder anderen Säugetieren 20 zu binden. Seit seiner Entdeckung hat Molekulartechnik enhanced die Umsetzung Wirksamkeit des SB Transposonsystem durch Veränderungen in der IR-Sequenzen und die Zugabe von TATA Dinukleotide flankierenden Transposon, was zu den pT2 Transposons. Diese Transposons haben an den IR-Website Bindung des SB optimiert und erhöht die Wirksamkeit der Exzision. Die SB Transposase unterzog auch signifikante Verbesserung; die Transposase in Experimenten hierin dargestellt verwendet wird, ist die SB100X, ein hyperaktives Transposase von einer DNA shuffling Strategie gefolgt von einer großen genetischen Screen in Säugetierzellen 22 erzeugt. In diesem Bericht zeigen wir eine schnelle, flexible und reproduzierbares Verfahren zur intrinsischen GBM in Mäusen, die mit nicht-viralen, Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in Zellen der Unter ventrikulären Zone des neugeborenen Mäusen 23 induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine einfache Möglichkeit, Transposons mit neuer Gene zugänglich für genomische Integration mit dem Dornröschen Transposase zu schaffen und zeigen, wie man das Plasmid Aufnahme zu überwachen undFortschreiten der Krankheit mit Biolumineszenz. Wir charakterisieren auch histologischen und immunhistochemischen Eigenschaften der GBM mit diesem Modell wiedergegeben. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen eine schnelle Methode, um primäre GBM Zelllinien aus diesen Tumoren zu erzeugen. Dornröschen Modell, bei denen Tumore aus Zellen Original dem Tier induziert werden, erlaubt das funktionale Bewertung der Rolle von Kandidaten GBM Gene bei der Induktion und Progression von Tumoren. Dieses System ist auch für das Testen von neuen GBM Behandlungen, einschließlich Immuntherapien in immunkompetenten Mäusen geeignet, ohne die Notwendigkeit invasiver entzündlichen chirurgischer Prozeduren, die die lokale Mikroumgebung verändern können.

<table><tbody><tr><td>Stoelting's Lab Standard mit Ratten- und Mausadaptern</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>Andere Unternehmen stellen ähnliche Rahmen her, jeder von ihnen mit kleinen Mausadaptern ist geeignet&nbsp;</td></tr><tr><td>Quintessenz des stereotaktischen Injektors (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Injektionen können ohne ihn durchgeführt werden, aber&nbsp; &nbsp; &nbsp; Der automatische Injektor ermöglicht eine erhöhte Reproduzierbarkeit und Komfort</td></tr><tr><td>10 & mu; l 700 Serie handmontierte MICROLITER-Spritze</td><td>Hamilton</td><td>Modell 701</td><td>Dieses Spritzenmodell liefert zuverlässig 0,5 bis 500 μl Lösung. Andere Nadeln (z. B. 5 ul, Modell 75) können ebenfalls verwendet werden</td></tr><tr><td>30 Gauge Injektionsnadel (1,25", 15o Fase) &nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>Diese Nadel ist ideal, um die Haut und den Schädel einer neugeborenen Maus zu durchstechen, ohne dass andere invasive Verfahren erforderlich sind. Wenn es stumpf wird (nicht leicht in die Haut eindringt), muss es ersetzt werden.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>Aliquot in kleinen Volumina und bei -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Luciferin, Kaliumsalz</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>Andere Quellen für Glühwürmchen-Lucifierase sind ebenso ausreichend</td></tr><tr><td>Hämatoxylin-Lösung, Harris modifiziert</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td>Zur Einbettung von Gehirnen für Kryosektionen und Immunhistovhemistik</td></tr><tr><td>Fortgeschrittenes DMEM/F-12, kein Glutamin</td><td>Leben Technologien</td><td>12634-010</td><td>Für die Kultur der Neurosphären</td></tr><tr><td>B-27&uml; Ergänzung (50X), serumfrei&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Serumfreies Nahrungsergänzungsmittel für die Kultur von Neurosphären</td></tr><tr><td>N2 Nahrungsergänzungsmittel (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Serumfreies Nahrungsergänzungsmittel für die Kultur von Neurosphären</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>Anti-Mykoplasmen-Wirkstoff für die Kultur von Neurosphären</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes</td><td>EGF PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>Wachstumsfaktor-Ergänzung für die Kultur von&nbsp; neurosphären</td></tr><tr><td>Rekombinante humane FGF-basis</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>Wachstumsfaktor-Ergänzung für die Kultur von&nbsp; neurosphären</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp; Reagenz zur Zellablösung&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>Scientific SV3003001</td><td>Für die Dissoziation von Neurosphären</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Pellet Stößel</td><td>Fisher</td><td>Scientific K749510-0590</td><td>Für die Dissoziation von frisch präparierten Tumoren</td></tr><tr><td>Falcon Cell Seveners Maschenweite 70 μm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Für die Erzeugung von Einzelzellsuspensionen aus dissoziierten Neurosphären</td></tr><tr><td>Xylole Histologische Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>Protokoll Harris Hämatoxylin Quecksilberfrei (angesäuert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protokoll Eosyn Y Lösung (intensiviert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

transposon-vermittelte integration von plasmid-dna in die subventrikularzone von neugeborenen mäusen zu novel modelle von glioblastoma generieren

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Es besteht ein dringender Bedarf, den Beitrag neuer Gene zur Pathogenese und Progression von humanen Glioblastomen (GBM) zu testen, dem häufigsten primären Hirntumor bei Erwachsenen mit düsterer Prognose. Neue potenzielle Therapien kommen schnell auf den Prüfstand und erfordern eine systematische Erprobung in experimentellen Modellen, die die hervorstechenden Merkmale der menschlichen Krankheit genau reproduzieren. Darin beschreiben wir im Detail eine Methode zur Induktion neuer Modelle von GBM mit Transposon-vermittelter Integration von Plasmid-DNA in Zellen der subventrikulären Zone von neonatalen Mäusen. Wir stellen eine einfache Möglichkeit vor, neue Transposons zu klonen, die für die genomische Integration mit dem Dornröschen-Transposon-System geeignet sind, und veranschaulichen, wie die Plasmidaufnahme und das Fortschreiten der Krankheit mithilfe von Biolumineszenz, Histologie und Immunhistochemie überwacht werden können. Wir beschreiben auch eine Methode, um neue primäre GBM-Zelllinien zu erzeugen. Im Idealfall wird dieser Bericht die weitere Verbreitung des Dornröschen-Transposon-Systems unter Hirntumorforschern ermöglichen, was zu einem tiefgreifenden Verständnis der GBM-Pathogenese und -Progression sowie zur rechtzeitigen Entwicklung und Erprobung wirksamer Therapien für Patienten führt.

Um histopathologischen Merkmale SB induzierten Glioblastome charakterisieren, C57 / BL6 neugeborenen Mäusen wurden an P1 mit einem Plasmid, das für Luciferase (PT2 / SB100x-Luc) in Kombination mit Plasmiden, Transposons Codieren mit onkogener DNA, dh NRAS (pT / CAGGS spritzt -NRASV12) und SV40 LgT (Pt / CMVSV40-LgT) (3c) oder ein Plasmid, das eine kurze Haarnadel-p53 mit PDGFβ und GFP-Reporter (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) in Kombination mit NRAS (Abbildung 3d Codierung). Die Tier...

Hier beschreiben wir ein effizientes und vielseitiges Protokoll zur Induktion, Überwachung und Analyse neuartiger Glioblastome (GBM) unter Verwendung von Transposon-DNA, die in die Ventrikel von neugeborenen Mäusen injiziert wird. Zellen der subventrikulären Zone, die das Plasmid aufnehmen, transformieren, vermehren und Tumore mit histopathologischen Merkmalen des menschlichen GBM erzeugen.

Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neuartige Modelle für Glioblastome zu erstellen und letztendlich neue therapeutische Ansätze zu entwickeln, indem die Bildung von Glioblastomen mit spezifischen genetischen Mutationen bei Mäusen induziert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Transposon-Plasmide hergestellt werden, die die spezifischen Gene des Interesses kodieren. Die nächsten Schritte sind die Vorbereitung der Plasmide mit einem Transfektionsreagenz und deren Injektion in das Seitenventrikel von neugeborenen Mäusen.Die Aufnahme während des Tumorwachstums wird anschließend mittels Lumineszenz überwacht. Wenn die Tiere stärker betroffen sind, werden sie für die histologische und immunhistochemische Analyse getötet. Auf diese Weise werden neue Glioblastome mit spezifischen genetischen Veränderungen in Wildtyp- oder gezielt veränderten genetischen Hintergründen induziert.Diese Tumoren können in vivo untersucht oder in vitro verwendet werden, um neue Zelllinien zu generieren, die für biochemische Analysen und Zytotoxizitätsexperimente unter Verwendung chemotherapeutischer Wirkstoffe geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie beispielsweise orthotopen Injektionen von Glioblastom-Zelllinien, liegt darin, dass die Tumoren durch die maligne Transformation von Zellen induziert werden, die endogen einem immunokompetenten Tier angehören, wobei genetische Veränderungen sehr gezielt ausgewählt werden. Dieser Prozess reproduziert die Ätiologie der menschlichen Erkrankung genauer und stellt die wesentlichen histopathologischen Merkmale des menschlichen GBM nach.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet der Neuro-Onkologie beantworten, beispielsweise, welche treibenden Mutationen für die Entstehung verschiedener Typen von Glioblastoma multiforme – klassisch, präneural, neural – bei Erwachsenen oder pädiatrischen Tumoren verantwortlich sind. Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik reichen bis in die Therapie von GPM hinein, da neuartige Chemotherapeutika, Strahlen-Immunsuppressionstherapien oder Kombinationen daraus mit diesem Modell vergleichsweise schnell in vivo oder in vitro getestet werden können.Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals während eines Gesprächs mit meinem Kollegen Dr. John an der University of Minnesota, der das ursprüngliche Hirntumor-Modell mithilfe der sleeping beauty-Transposase-vermittelten Integration von Onkogenen und Inhibitoren von Tumorsuppressorgenen in die genomische DNA des Wirts entwickelt hatte. Ich war der Ansicht, dass diese Methodik äußerst leistungsfähig wäre, um die Auswirkungen neuer Mutationen auf das Tumorwachstum zu untersuchen und bei der Entwicklung gezielter Therapien gegen Hirntumore zu unterstützen. Drei bis vier Wochen vor dem Experiment richten Sie einen Maus-Zuchtkäfig mit einem Männchen und einem Weibchen ein und stellen einen farbigen Kunststoff-Iglo bereit, um die Umgebung anzureichern und die Paarungschancen zu erhöhen. Entfernen Sie das Männchen, sobald eine Schwangerschaft bestätigt wurde, und beginnen Sie 18 Tage nach dem Paarungstag mit der Überwachung des Weibchens auf die Geburt.Stellen Sie sicher, dass eine Pflegemutter zum Zeitpunkt der Geburt verfügbar ist. Führen Sie am ersten Tag nach der Geburt die intraventrikulären Injektionen durch. Bereiten Sie die Injektionslösung vor, indem Sie zunächst 20 Mikroliter der DNA-Mischung entnehmen, die den Transposon-Plasmidkomplex in einer Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm DNA pro Mikroliter enthält.Fügen Sie als Nächstes eine 20 µL-Aliquotlösung der PEI-Lösung zur DNA-Lösung hinzu und lassen Sie diese 20 Minuten bis eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren; danach sollte das Gemisch auf Eis aufbewahrt werden. Für die Injektionsnadel befestigen Sie eine 10-µL-Spritze an einer Kanüle mit 30 Gauge und einem 12,5-Grad-Schrägschliff. Anschließend verbinden Sie die Spritze mit einer Mikropumpe mit automatischer Injektion. Testen Sie die Einrichtung mit 10 Mikrolitern Wasser und vergewissern Sie sich, dass die Spritze geleert wird. Kühlen Sie nun die stereotaktische Vorrichtung für Neugeborene mit einer Mischung aus Trockeneis und Alkohol ab. Wenn sie auf eine Temperatur zwischen zwei und acht Grad Celsius abgekühlt ist, fahren Sie mit den Injektionen fort.Betäuben Sie zunächst ein Jungtier, indem Sie es zwei Minuten lang auf Eis legen. Während sich das Jungtier auf dem Eis befindet, füllen Sie die Spritze mit der Injektionslösung. Sobald das Tier betäubt ist, überführen Sie es auf den Halterahmen und fixieren Sie den Kopf zwischen den mit Mull bedeckten Ohrhaltern.Überprüfen Sie, ob die dorsale Seite des Schädels horizontal und parallel zur Rahmenoberfläche liegt. Außerdem sollten die Schädelnähte deutlich sichtbar sein. Wenn der Kopf des Welpen nicht fest genug fixiert ist, wird er sich während der Injektion bewegen.Wird der Kopf des Tieres dagegen zu fest zwischen den Ohrstangen des Halterungsrahmens fixiert, ist das Lambda nicht sichtbar, und der Druck im Schädel führt dazu, dass die injizierte Lösung austritt. Wenn das Jungtier sicher im Rahmen fixiert ist, wischen Sie den Kopf mit 70 %igem Ethanol ab, senken dann die Nadel ab und justieren ihre Position, sodass sie das Lambda berührt. Anschließend heben Sie die Nadel an und verschieben sie lateral um 0,8 Millimeter und um 1,5 Millimeter nach kaudal. Danach senken Sie die Nadel erneut ab, bis sie die Haut leicht eindellt.Notieren Sie die Koordinaten dieser Position. Senken Sie dann die Nadel um 1,5 Millimeter durch die Haut und den Schädel in den Kortex am Seitenventrikel ab. Injizieren Sie 0,75 µL über einen Zeitraum von 90 Sekunden und warten Sie anschließend eine Minute lang, um die Lösung zu verteilen.Der nächste zu injizierende Welpen kann anästhesiert werden. Nach dem Wiegen langsam die Nadel anheben und anschließend den Welpen an einen Erholungsort unter einer Wärmelampe bringen. Die Zeit von der Anästhesie bis zur Wärmezufuhr muss weniger als 10 Minuten betragen.Überwachen Sie die Atmung so schnell wie möglich, und falls erforderlich, reiben Sie sanft die Gliedmaßen, um die Atmung anzuregen. Sobald das Jungtier erwärmt ist, eine rosige Färbung aufweist und gleichmäßig atmet, bringen Sie es zu seiner Mutter zurück. Dies dauert gewöhnlich fünf bis sieben Minuten ab dem Zeitpunkt der Injektion.Wenn mehrere Welpen injiziert werden, sollten alle bis zur vollständigen Erholung zurückbehalten werden, bevor sie der Mutter zurückgegeben werden. Falls nach einer halben Stunde nicht alle Welpen bereit sind, geben Sie die Hälfte von ihnen zurück und die restlichen später am Ende des Verfahrens; überwachen Sie anschließend die Mutter. Nach dem Zurückgeben der Welpen.Falls sie nicht auf die Welpen reagiert, fügen Sie die Ersatzmutter dem Käfig hinzu. 24 bis 72 Stunden nach der Injektion überwachen Sie die Plasmidaufnahme und überführen Sie alle Welpen in sechs-Well-Zellkulturschalen, einen Welpen pro Vertiefung. Danach befüllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 30 Milligramm pro Milliliter Luciferin in Kochsalzlösung oder PBS und befestigen eine 30-Gauge-Hypodermikanadel.Injizieren Sie 30 Mikroliter der Lösung subkutan zwischen den Schulterblättern jedes Wurfes, um Verletzungen zu vermeiden; injizieren Sie die Lösung unter eine kleine Hautfalte. Überführen Sie die Würfe unmittelbar in ein In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebungssystem. Richten Sie eine Sequenz ein, um vier aufeinanderfolgende Bilder im Abstand von jeweils einer Minute mit automatischer Belichtung, großer Blende und einer Blendenöffnung von eins aufzunehmen. Später.Nach etwa 17 Tagen können die Tiere makroskopische Tumoren bilden, die mittels Biolumineszenz und Histologie nachweisbar sind. Die Überwachung der Tumoren kann auch bis zu sechs Wochen dauern. Injizieren Sie 100 Mikroliter Luciferin-Lösung intraperitoneal mit einer 26-Gauge-Nadel.Nach drei Minuten betäuben Sie die Tiere in einer ISO-Fluor-Oxygen-Narkosekammer und bringen die Tiere in die Bildgebungskammer, die mit Konen zur Verteilung des ISO-Fluors ausgestattet ist. Erwerben Sie eine Serie von sechs Bildern in zweiminütigen Abständen mit automatischer Belichtungszeit, mittlerer Binning-Stufe und geöffnetem Blendenwert (F-Stop) von eins. Der interessierende Bereich ist typischerweise ein ovales Areal über dem Kopf; messen Sie die Lumineszenzintensität bei jedem Tier unter identischen Einstellungen, um die histopathologischen Merkmale von SB-induzierten Glioblastomen zu charakterisieren.Neugeborene C57Black6-Mäuse wurden am Tag P1 mit einem Plasmid und einem Luciferase-kodierenden, mit NRAS und SV40 Large T-Plasmiden verbundenen Transposon mit onkogenetischer DNA injiziert. Alternativ wurde ein Plasmid, das einen kurzen Haarnadel-P53, PDGF-beta und einen GFP-Reporter kodiert, in Kombination mit NRAS injiziert. Pseudopalisadische Nekrose war erkennbar, ebenso perivaskuläre und diffuse Ausbreitung ins Gehirn.Parenchymale Glioblastome wurden ebenfalls mittels Biolumineszenz überwacht. Die Tiere sterben in der Regel an der Tumorbürde. Wenn die Lumineszenz eine Intensität von 10 hoch 7 bis 10 hoch 9 kalibrierten Einheiten erreichte.Die mediane Überlebenszeit der Tiere hing vorhersagbar von den Kombinationen onkogener Transposons ab, die in das neonatale Gehirn injiziert wurden. Die aggressivsten Tumoren wurden mit NRS und SV40 großem T-Antigen induziert; de-novo-Tumoren zeichneten sich durch die Expression charakteristischer Moleküle aus. Frühstadien von Tumoren, die zur Expression von GFP gebracht wurden und mit SHP53 sowie nras induziert wurden, exprimierten das Markerprotein der neuronalen Stammzellen, Nestin, und einige exprimierten zudem das gliale fibrilläre saure Protein.Nach 56 Tagen wurde ein Tumor gefunden, der von zahlreichen GFAP-positiven Astrozyten umgeben war. Diese Tumorzellen exprimierten nein, jedoch nicht GFAP. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Entstehung von Glioblastomen, die spezifische genetische Mutationen aufweisen, durch intraventrikuläre Injektionen in neugeborene Mäuse induziert und wie man den Krankheitsverlauf mittels Biolumineszenz überwacht.In dem Artikel finden Sie Details dazu, wie man leicht neue trans-pro-Plasmide klonen kann, die Gene des Interesses kodieren, sowie wie man die Tumoren überwacht und sie mittels Histologie und Immunhistochemie analysiert. Zusätzlich finden Sie eine ausführliche Methode zur Erzeugung neuer Glioblastomzelllinien aus Tieren mit genetisch veränderten Tumoren. Wir hoffen, dass dieser Artikel dazu beitragen wird, die Entdeckung neuer Therapien gegen diese verheerende menschliche Erkrankung zu beschleunigen.

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Dieses Video beschreibt eine effiziente Technik zur Induktion von Glioblastomen (GBM) mit Hilfe von Transposon-DNA, die in die Ventrikel von neugeborenen Mäusen injiziert wird. Zellen der subventrikulären Zone, die das Plasmid aufnehmen, transformieren, vermehren und Tumore mit histopathologischen Merkmalen des menschlichen GBM erzeugen.

Glioblastom-Induktion mittels SB-vermittelter Transposition: Eine Technik zur Generierung eines neuartigen Mausmodells unter Verwendung der Transposon-vermittelten Integration von SB-Plasmid in das Gehirn von Neugeborenen

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

Wir haben eine kortikale orthotopen Glioblastom-Modell bei Mäusen für die Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die biophysikalischen Einschränkungen im Spiel während des Wachstums des Tumors rekapituliert normalerweise etabliert. Eine chronische Glasfenster ersetzt den Schädel über dem Tumor ermöglicht die Follow-up der Tumorprogression über die Zeit durch Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Dieses Verfahren zeigt, wie Interneuronen im sich entwickelnden Maus-Vorderhirn mittels in utero-Elektroporation gezielt angegriffen werden können. Diese Technik war besonders effizient, um eine selektive Genexpression in Interneuronen-Subtypen zu erreichen, die für die oberflächlichen Schichten des Kortex bestimmt sind.

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Hier demonstrieren wir eine Technik zur weit verbreiteten neuronalen Transduktion durch intraventrikuläre Injektion von Adeno-assoziierten Viren in das neonatale Mausgehirn.  Diese Methode bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, eine lebenslange Expression von viral transportierten Transgenen zu erreichen.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

Dargestellt ist hier die einfache Methode zur Isolierung und Durchflusszytometrieanalyse Gliom-infiltrierenden mononukleären peripheren Blutzellen, die zeitabhängige quantitative Daten über die Anzahl und Aktivierungsstatus von Immunzellen in das Gehirn frühen Tumorumgebung ergibt.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

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Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren (Video) | JoVE Journal

Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren

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