Name: Methoden zum Vergleich der Nährstoffe in Bienenbrot Hergestellt von Africanized und europäischen Honigbienen und die Auswirkungen auf die Hämolymphe Protein Titer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Nährstoffquantifizierung in Pollen und Bienenbrot von afrikanischen und europäischen Honigbienen. Diese Technik ermöglicht die Messung von Proteinkonzentrationen und Verzehrmustern für die Bienenforschung.

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Die Autoren danken Mona Chambers, Geoffrey Hidalgo und Maurissa Two Two für ihre technische Unterstützung. Wir danken auch Dr. Earl White für die Aminosäureanalyse, Dr. Roger Simonds für die Analyse von Pollen auf Pestizide und Dr. Stanley S. Schneider, Vanessa Corby-Harris und Kirk Anderson für ihre Rezensionen und Diskussionen früherer Versionen des Manuskripts und viele hilfreiche Vorschläge.

1. Gewinnung von Bienenbrot AHB und EHB Kolonien <ol><li> Zeigen Pollenfallen auf Bienenvölker und sammeln Pollen. Schleifen Sie die Pollen zu einem feinen Pulver (ähnlich wie Pollen von Staubbeuteln Schuppen) mit einer Kaffeemühle. </li><li> Stellen Sie je von AHB und EHB 5 Kolonien in einem geschlossenen Flugbereich (EFA), so dass die Bienen Futter nur auf der Pollen zur Verfügung gestellt. Um Arbeitskräfte davon abzuhalten, zwischen EHB und AHB Kolonien zu vermeiden, teilen Sie die EFA in einzelne Abschnitte, so dass die Bienen nicht zwischen ihnen zu überqueren. Zeigen einzelnen EHB oder AHB Kolonien mit 3.500-4.000 Arbeiter-Bienen, Wachs-Kamm mit Honig, Nektar, unreifen Brut und leeren Kamm in jedem Abschnitt der EFA. HINWEIS: Die Kolonien nicht Pollen gespeichert haben, wenn festgestellt. Die Rate, dass Pollen gespeichert können ohne eine Verlegung Königin in den Kolonien erhöht werden. </li><li> Futtergrund Pollen, Kolonien, indem Sie ein Tablett mit dem Pollen in jedem Abschnitt der EFA. Verbreitung über 60 g Pollen auf jedem Boden, so dass foraging Bienen sammeln als corbicular Lasten und speichern Sie die Pollen in ihren Kolonien als Bienenbrot. Weiter bietet frischen Pollen auf jedem Boden täglich für 3 Wochen. </li><li> Siehe aus den europäischen Kolonien Europäischen Bienenbrei (EBB) und von Africanized Kolonien afrikanisiert Bienenbrei (ABB) Bienenbrei. </li></ol> 2. Feeding Bienen in Käfige <ol><li> Platz Rahmen versiegelt Arbeiterinnenbrut von AHB und EHB Kolonien in getrennten Käfigen Entstehung in einer Umwelt Zimmer 32 bis 34 ° C und 40% relativer Luftfeuchte eingestellt .. </li><li> Als die Arbeiter entstehen und sind ca. 24 Stunden alt, errichten 12 Plexiglas-Bioassay Käfigen (Abmessungen = 11,5 x 7,5 x 16,5 cm 3) und fügen Sie entweder 100 neu entstandenen EHB oder 100 neu entstandenen AHB Arbeitsbienen zu jedem Käfig. Legen Sie ein Teil der Kamm mit einer bekannten Anzahl von entweder EBB oder ABB-Zellen (24-30 Zellen pro Käfig) in jeden Käfig, um die folgenden Behandlungskombinationen erzeugen: AHB gefüttert ABB, EHB gefüttert ABB, AHB gefüttert EBB und EHB gefüttert EBB. (4 Behandlungen; 6Käfige pro Behandlung; 24 Käfige insgesamt). </li><li> In Fläschchen mit Wasser und 50% Honig und Wasser-Lösung auf das Volumen an jedem Käfig formuliert. Füllen Sie den Honig und Wasser Fläschchen täglich für die 11 Tage Studiendauer. </li></ol> 3. Probenahme Arbeitskraft-Bienen und Bienenbrot und Schätzung des Verbrauchs <ol><li> Probe 10 neu, bevor Sie sie in den Käfigen heraus EHB und AHB Arbeiter. Siehe diese als Tag 0 Bienen und sie als Grundlage für Hämolymphe Proteinkonzentrationen zu dienen. </li><li> Entfernen 10 Bienen aus jedem Käfig, nachdem sie auf EBB oder ABB für 4, 7 und 11 Tage gefüttert. </li><li> Legen Sie die lebenden Bienen in einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen und setzen auf Eis Packs. Wählen Sie eine Teilstichprobe von vier Bienen für die Analyse der Hämolymphe Proteinkonzentration. </li><li> Nach der Probenahme Bienen auf Day-11, zählen die Anzahl der Wabenzellen, die noch Bienenbrei enthalten. Dies ist ein relatives Maß für beebread Verbrauch. </li><li> Das restliche Bienenbrei aus den Zellen in jedem Käfig und lagern in separaß Mikrozentrifugenröhrchen nach Käfig. Halten die beebread Proben bei -80 ° C bis zum pH-Wert lösliche Proteinkonzentration und Aminosäuregehalt analysiert. </li></ol> 4. Abschätzung pH-Wert von Pollen und Bienenbrot <ol><li> Nehmen Sie sechs Zufalls 0,3 g Proben der Pollen für die Bienen in der EFA zugeführt und löst ihn in 300 ul destilliertem Wasser. Messen Sie den pH mit einem wasserfesten Doppelkreuz pH Speer mit einer Genauigkeit von 0,01. </li><li> Nehmen Sie 0,3 g Probe von Bienenbrot, das nach dem 11-tägigen Fütterungsperiode in jedem Käfig blieb. Löse den beebread in 300 ul destilliertem Wasser und Messen pH wie Pollen (4.1) beschrieben. </li></ol> 5. Proteinanalytik <ol><li> Nehmen Sie sechs Proben der Pollen und eine Probe von EBB und ABB aus jedem Käfig. Proben bei -20 ° C bis zum löslichen Proteinkonzentration analysiert. </li><li> Mischungs 20 mg entweder Pollen oder Bienenbrot mit 1000 ul 0,1 M Phosphatpufferlösung (PBS). </li><li> VoRTEX der Mischung für 10 sec und Zentrifuge bei 571,2 × g für 1 min. </li><li> Entfernen einer 10 ul-Probe des Überstandes und in Vertiefungen einer 96-Well-Flachboden EIA / RIA Polystyrolplatte. Replizieren Sie alle Proben in drei Brunnen. </li><li> Zeichnen Hämolymphe von Bienen von jedem Käfig durch Einfügen einer 20 ul Kapillarrohr (die erhitzt und gezogen, um einen nadelscharfen Punkt worden war) in den rechten Seitenabschnitt des Thorax in der Nähe der Befestigungsstelle der Flügel aufgefangen. Sammeln zusätzlicher Hämolymphe, falls erforderlich, durch Einfügen des gleichen Rohres in der Membran zwischen den Bauch tergites. </li><li> 1 ul Hämolymphe zu 9 ul 0,1 M PBS. Bewahren Sie die Hämolymphe Lösung bei -20 ° C bis zur Analyse für lösliches Protein. </li><li> Bestimmen gesamten löslichen Protein-Konzentrationen im Pollen, Bienenbrot, und Hämolymphe Proben unter Verwendung eines kommerziellen Bradford-Test-Kit. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Stellen Sie eine Standardkurve, um lösliches Protein c schätzenONZENTRATION in den Proben durch Messung der Proteinabsorption mit bekannten Proteinkonzentrationen in Rinderserumalbumin (BSA). Messen Sie Protein-Absorption bei 595 nm mit einem Spektralphotometer. </li></ol> 6. Aminosäureanalyse <ol><li> Pool Einzelproben aus Wabenzellen jeder Kolonie, um eine repräsentative Stichprobe von EBB und ABB für die Analyse zu schaffen. </li><li> Nehmen Sie eine 50 mg Pollen oder Bienenbrei Wägegut in Autosampler-Fläschchen, und fügen Sie 1 ml destilliertem Wasser in das Fläschchen, zusammen mit 100 ul einer 50 ng / ul interne Standardlösung, bestehend aus 4 d-Alanin, d 23 -lauric Säure, 13 C 6 -Glucose und d 39 -arachidiac Säure. </li><li> Verschließen Sie die Probe und für 5 min beschallen. </li><li> Bedingen einen HLB Patrone durch Zugabe von 1 ml Methanol gelöst, durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser, gefolgt von der Zugabe von 1 ml der beebread oder Pollen Probe äquilibriert. Mit 1 ml von 5,0% MeOH / H 2 O und Elu waschen die Patronete mit 1 ml 80% MeOH / H 2 O. </li><li> Dampfe das wird bis zur Trockne unter einem Stickstoffstrom. Rekonstituieren Sie die Probe mit 50 ul Pyridin und 100 ul N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoracetamid + Trimethylchlorsilan (TMCS BSTFA +). </li><li> Cap und Inkubation der Probe bei 70 ° C für 30 min. </li><li> Lassen Sie die Probe abkühlen und überträgt es auf eine saubere Autosamplergefäß. </li><li> Kappe und legen Sie die Probe in einem massenselektiven Detektor angeschlossen, um einen Gaschromatographen, um die Proben sowohl für flüchtige Verbindungen und organische Säuren analysiert. Trennen Sie die Zucker und organische Säuren folgenden TMS Derivatisierung mit BSTFA + TMCS Verwendung einer Säule (30 mx 0,25 mm ID) mit einem 1,0 &amp; mgr; m Schichtdicke. </li><li> Stellen Sie den Säulenofen bei 50 ° C für 2 Minuten, dann erhöhen Sie die Temperatur linear auf 290 ° C bei 5 ° C / min. Halten Sie für 7 min. Stellen Sie die GC-Injektor und GC / MS-Schnittstelle bis 250 ° C und 290 ° C. <ol><li> Verwenden Helium als Träger bei einer flow Rate von 1,0 ml / min. Legen Sie die MS Quellentemperatur bis 230 ° C. </li></ol></li><li> Tune und Kalibrierung des Massenspektrometers täglich mit Perfluortributylamin (PFTBA). Verwenden Sie eine 1 ul Injektion PFTBA im Scan (35-700 amu) positiven Ionenmodus um Daten über das Vorhandensein und die Konzentrationen der Aminosäuren zu erhalten. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren, haben wir festgestellt, dass die beebread Firma AHB wurde in größeren Mengen sowohl von AHB und EHB verbraucht. Obwohl EHB und AHB verbraucht ähnliche Mengen der einzelnen Arten von Bienenbrot hatte AHB höher Hämolymphe Protein-Titer. Erkenntnisse auf der Grundlage unserer Methoden waren ähnlich zu früheren Berichten, wo Hämolymphe Protein-Ebene in AHB höher als in EHB obwohl beide die gleichen Diäten 26 zugeführt wurden. Durch die Messung des Verbrauchs von EBB und ABB, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten sowohl EHB und AHB verbraucht wurden, wurde bestimmt, dass Hämolymphe Proteinkonzentration in den einzelnen Unterarten nicht durch eine Erhöhung der Nahrungsaufnahme erhöht werden. Es scheint ein Plateau für Hämolymphe Proteinkonzentration in Arbeiter Krankenschwester Biene Alter und dass der Sollwert für die Hochebene ist in AHB als EHB höher sein. Es gibt mehrere wichtige Voraussetzungen für die Bildung Kolonien beebread Produktion, die die Rate der Pollenspeicher optimieren. Erstens, die colonies müssen Rahmen mit offenen Brut. Ohne offene Brut zu füttern, werden die Arbeiter nicht viel Pollen sammeln. Zweitens muß der Kolonie weisellos sein, so dass keine zusätzlichen Brut erzeugt. Brutaufzucht benötigt große Mengen an Pollen und nur überschüssiges Pollen gespeichert. In den kleinen Kolonien in EFA gegründet, gäbe es wenig Pollen als Bienenbrot, wenn Brutbereiche wurden erweitert, so Kolonien müssen weisellos sein gespeichert werden können. Schließlich wird für beebread gemacht werden, Pollen müssen corbicular Lasten gesammelt und in Wabenzellen gespeichert werden. Wenn der Pollen in Pollenfallen gesammelt, muss es zu einem feinen Pulver, bevor er sich für die Bienen, so dass sie es als corbicular Lasten sammeln können geschliffen werden. Die Methoden zur Messung der Verbrauch von Bienenbrei erzeugt eher qualitative als absolute Schätzungen. Der einzige, der Verbrauch gezählt wurde, war, wenn die Zellen vollständig von Bienenbrot entleert. Eine genauere Schätzung der gesamten Bienenbrot Verbrauch könnte durch Entfernen der Bienen br erhaltenead aus den Zellen und damit zu einer Pastete, die vor und nach der Studie Zeitraum gewogen werden konnte. Wollten wir jedoch, das Bienenbrot in den Zellen zu halten, damit die Bienen könnten darauf, wie sie es in einer Kolonie und vielleicht auch weiterhin während der Studiendauer Verarbeitung füttern. Der Gewichtsunterschied der Kammabschnitte vor und nach der Studie nicht als eine Schätzung des Konsums verwendet, weil das Gewicht steigt an, weil Bienen setzen Sie den verdünnten Honig, sie in einigen Zellen zugeführt. Die Arbeiter könnten auch einige der verdünnten Honig auf die Bienenbrot hinzugefügt haben. Aus diesen Gründen wurden die Zellen, das etwa gleiche Mengen von Bienenbrot vor und nach der Fütterungsperiode gezählt und erzeugt einen qualitativen Messung. Dennoch gab es einen auffallenden Unterschied zwischen den beiden Arten von beebread der Anzahl der leeren Zellen ABB Vergleich EBB gezählt nach 11 Tagen. Festlegen, wann gespeichert Pollen wird Bienenbrei kann difficult weil Bienen ständig hinzufügen Pollen, Zellen. Die für die Herstellung von Bienenbrot verwendet Kolonien wurden mit Rahmen von offenen Brut hergestellt, so würden die Bienen Pollen zu sammeln. Allerdings waren die Kolonien weisellos so gab es Larven für nur 9 Tage zu ernähren, nachdem die Kolonie gegründet wurde. Für den Rest des Zeitraums von 3 Wochen bei Kolonien wurden in EFA, Pollen, die die gesammelten Bienen wurde gespeichert und umgewandelt, um Bienenbrot. Halten Sie die gespeicherten Pollen in den Kamm Zellen für weitere 11 Tage bei Verfütterung an Bienen in Käfigen kann auch die Verarbeitung von Pollen weiter Bienenbrei haben. Die Umwandlung von Pollen Bienenbrot dauert ca. 7 Tage 8. Die auf EHB und AHB gefüttert Bienenbrei hatten niedrigere pH-Wert und reduziert die Proteinkonzentrationen im Vergleich mit dem Pollen gefüttert. Ähnliche Ergebnisse von Änderungen der Pollen nach Umwandlung Bienenbrei wurden von anderen 7,10,27 berichtet. Die Ergebnisse unterschieden sich von früheren Berichten jedoch darin, dass es Unterschiede in Konzentrationen of bestimmte Aminosäuren zwischen Bienenbrot und Pollen. Die Veränderungen der beiden Protein und Aminosäurekonzentrationen konnte aufgrund der Aktivität von proteolytischen Enzymen, könnte die Quelle, von denen die Bienen selbst oder die mikrobiellen Gemeinschaften im Bienenbrot 7,8,28,29 etabliert sein. Die verwendet werden, um die Proteinkonzentration zu messen Verfahren waren ähnlich den zuvor beschriebenen, um die Wirkungen von Nahrungsprotein auf Africanized und europäischen Bienen 26 bestimmen. Als Erweiterung der Verfahren, waren wir in der Lage, lösliche Protein in Pollen und beebread abzuschätzen. Diese Methoden erzeugt ähnliche Ergebnisse zu früheren Berichten 7,10,27. Unsere Ergebnisse liefern weitere Beweise dafür, dass AHB Nahrungsprotein effizienter assimilieren als EHB, und dass dies ein Schlüsselfaktor für den ökologischen Dominanz des AHB in den meisten Regionen, in denen sie eingewandert sind und sich etabliert hat 30-32 sein.

Ernährung spielt eine grundlegende Rolle bei der Gesundheit und Vitalität von Bienenvölkern und deren Etablierung als Populationen. Nährstoffe aus der Nahrung liefern Energie und die biochemischen Komponenten für die Brutaufzucht, Thermoregulation notwendig, Nahrungssuche und Immunantwort. Für Bienenvölker, benötigt die Nährstoffe Kolonie Bevölkerungen wachsen und pflegen ihre Gesundheit von Nektar und Pollen zu kommen. Nectar bietet Kohlenhydrate und Pollen liefert die verbleibenden diätetischen Anforderungen wie zB Protein, Lipide, Vitamine und Mineralien ein. Unterarten der Honigbienen in ernährungsphysiologisch basierten Kolonie-Level-Parameter, wie Arbeiter Langlebigkeit, Brutaufzucht und Mechanismen der sozialen Immunität 2-6 unterscheiden. Diese Unterschiede könnten, wie Lebensmittel, insbesondere Pollen wird durch die Kolonie verarbeitet und verdaut Personen verknüpft werden. Pollen ist in Wabenzellen und durch mikrobiell vermittelte Milchsäuregärung wird chemisch verändert gespeichert <sup&gt; 10.07. Das fermentierte Pollen wird als Bienenbrot. Es könnte genotypische Unterschiede zwischen den Unterarten in ihrer Fähigkeit, Nährstoffe aus dem Pollen sie sammeln und speichern zu erwerben und dies könnte Kolonie Wachstum und Überleben beeinflussen. Genotypische Auswirkungen auf die Lebensmittelverarbeitung und Nährstoff Erwerb haben in anderen Organismen dokumentiert was manche Menschen, mehr Nährstoffe und Kalorien als andere zu erhalten und verbrauchen dabei die gleichen Nahrungsmittel 11-14. Wir beschreiben hier verwendet, um die Zusammensetzung und den Verbrauch von Bienenbrei durch verschiedene Unterarten der Honigbienen gemacht vergleichen Methoden. Methoden, um die resultierenden Hämolymphe Protein-Titer bei Arbeiterinnen beschrieben sind zu messen. Frühere Studien über die Nährstoffzusammensetzung Bienenbrei wurden mit europäischen Honigbienen (EHB) 10,15,16 getan. Allerdings kann es Unterschiede in Bienenbrei von Bienen der verschiedenen Unterarten gemacht, selbst wenn sie auf der gleichen Pollen ernähren. EHB und AHB miteinander verglichen, da diese U-BootePecies haben unterschiedliche verhaltensmäßigen und physiologischen Unterschiede, die Lebensmittel- und Nährstofferfassung 17 in Zusammenhang stehen könnten. Einige der bemerkenswertesten Unterschiede sind, dass AHB sammeln und verbrauchen mehr Pollen als EHB und scheinen, um es leichter in Brut 18 umzuwandeln. AHB Kolonien haben höhere Schwärmen Raten als EHB und fliehen, wenn Nahrungsressourcen zu begrenzten 19-23. Flucht ist in EHB selten. AHB auch höhere Stoffwechselrate als EHB 24. Die Nahrungsgrundlage für die Kolonie-Pegeldifferenzen zwischen EHB und AHB könnte zu der Rate der Pollensammlung sowie dessen Nährstoffgehalt (zB Aminosäuren und Proteinen), nachdem es umgewandelt Bienenbrei hängen. Bienenbrei Verbrauch und das resultierende Protein Akquisition könnte auch eine Rolle in der Kolonie-Niveauunterschiede zwischen EHB und AHB zu spielen. Mit den entwickelten Methoden, EHB und AHB gemacht Bienenbrei aus demselben Pollenquelle. Die Bienenbrot wurde dann zurück auf die Bienen gefüttert each Unterart und kann bestimmen, ob Bienen erwerben Protein aus beebread in einer Weise kennzeichnend für deren Unterarten oder an die Source des beebread.

<table><tbody><tr><td>wasserdichter pH-Speer mit Doppelverbindung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaffeemühle</td><td>Mr. Coffee&nbsp;</td><td>Modell 1DS77</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatpufferlösung</td><td>Emd-Millipore</td><td>BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>EIA/RIA Polystyrolplatte</td><td>Sigma-Aldrich-Corning</td><td>CLS3590-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapillarpipetten</td><td>Kimble Glass Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schnellstart Bradford Protein Assay Kit 2&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>#500-0202</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Biotek Synergy HT&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Massenselektiver Detektor</td><td>Agilent</td><td>5973N</td><td></td></tr><tr><td>HLB Kartuschen-Gaschromatograph</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>6930</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Gaschromatographie-Säule&nbsp;</td><td>Ein J& W Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>DB-1701</td><td></td></tr><tr><td>d4-alanin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>488917</td><td></td></tr><tr><td>d23-Laurinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451401</td><td></td></tr><tr><td>13C6-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>Pyridin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis (trimethylsilyl)trifluoracetamid +&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trimethylchlorsilan (BSTFA + TMCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33148</td><td></td></tr><tr><td>Perfluortributylamin (PFTBA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442747-U</td><td></td></tr><tr><td>d39-Arachidiasäure</td><td>Cambridge-Isotop&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methoden zum vergleich der nährstoffe in bienenbrot hergestellt von africanized und europäischen honigbienen und die auswirkungen auf die hämolymphe protein titer

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honigbienen zu erhalten Nährstoffe aus Pollen sie sammeln und speichern im Bienenstock als Bienenbrot. Wir entwickelten Methoden, um die Pollenquelle, die Bienen sammeln und zu konvertieren, indem Kolonien in einem speziell konstruierten geschlossenen Fluggebiet Bienenbrei steuern. Es wurden Methoden entwickelt, um das Protein und Aminosäurezusammensetzung der Pollen und beebread analysieren. Wir beschreiben auch, wie Verbrauch des Bienenbrei wurde gemessen und Verfahren zur Behandlung von erwachsenen Arbeitnehmer Biene Hämolymphe Protein-Titer nach der Fütterung auf Bienenbrei für 4, 7 und 11 Tage nach dem Auflaufen zu bestimmen. Methoden wurden angewandt, um festzustellen, ob Genotyp beeinflusst die Umwandlung von Pollen Bienenbrot und das Tempo der Bienen verbrauchen und Protein zu erwerben von ihm. Zwei Unterarten (europäischen und Africanized Honigbienen; EHB und AHB) wurden mit demselben Pollenquelle zur Verfügung gestellt. Auf Basis der entwickelten Methoden, Bienenbrei von beiden Unterarten gemacht hatten niedrigere Proteinkonzentrationen und pH-Werte als die Pollen. Im Allgemeinen Aminosäure conzent in Bienenbrei entweder EHB oder AHB gemacht waren ähnlich und trat auf höheren Ebenen in Bienenbrei als im Pollen. Sowohl AHB und EHB verbraucht deutlich mehr der Bienenbrei von AHB als durch EHB gemacht. Obwohl EHB und AHB verbraucht ähnliche Mengen von jeder Art von Bienenbrot waren Hämolymphe Proteinkonzentrationen in AHB höher als in EHB. Unterschiede in der Protein Erwerb von AHB und EHB Umwelt Anpassungen an die geografische Region, in der jeweils Unterarten entwickelt Zusammenhang widerspiegeln könnten. Diese Unterschiede könnten auf die erfolgreiche Etablierung der AHB Populationen in der Neuen Welt wegen der Auswirkungen auf die Brutaufzucht und Koloniewachstum beitragen.

<html> Bienenbrei wurde in -80 ° C für weniger als einen Monat, bevor für pH und Proteinkonzentration analysiert gespeichert und für etwa 4 Monate vor der Aminosäureanalyse. Bienenbrei unterschied sich von der Pollen im pH und der Proteinkonzentration (Abbildung 1). Der pH beebread niedriger war als der Pollen wurde die Proteinkonzentration. Sowohl EHB und AHB verbraucht mehr ABB als EBB (Abbildung 2). Niveaus von löslichem Protein in der Hämolymphe von AHB waren signifikant höher als EHB unabhängig von der Art der Bienenbrot sie verbraucht ist (Abbildung 3). Diese Unterschiede in der Hämolymphe Proteinniveaus auftrat, obwohl EHB und AHB verbraucht ähnliche Mengen von jeder Art von Bienenbrot. Das Alter der Bienen zum Zeitpunkt der Probenahme erheblich beeinträchtigt lösliches Protein-Konzentrationen in der Hämolymphe. Verglichen mit Tag-7 oder 11, die nicht unterschied Proteinkonzentrationen waren deutlich niedriger in Tag-4 Bienen. _content &quot;&gt; Von den 10 Aminosäuren, die essentiell für Honigbienen, alle außer Histidin wurden im Pollen nachgewiesen. In den meisten Fällen waren die Aminosäurekonzentrationen in beebread gemessen höher ist als in den Pollen (Abbildung 4). Beispielsweise werden Konzentrationen von Leucin und Threonin waren ungefähr 60% höher im Vergleich beebread mit Pollen und Valin-Konzentrationen waren etwa 25% höher. Alanin wurden Asparaginsäure, Glutamin und Methionin Ebenen auch beebread höher als in Pollen. Aminosäuren Konzentrationen nicht wesentlich zwischen unterschiedlich ABB und EBB mit Ausnahme von Phenylalanin und Cystein. Phenylalanin Werte waren etwa doppelt so hoch im Vergleich zu ABB entweder EBB oder Pollen. Cystein-Konzentrationen waren niedriger in EBB im Vergleich zu ABB oder Pollen. Tryptophan war die einzige Aminosäure, die in höheren Konzentrationen in Pollen als in EBB oder ABB. Die Konzentrationen von Prolin in Pollen und ABB waren höher als in EBB. Abbildung 1: Vergleich der pH-Wert (A) und löslichen Proteinkonzentrationen (B) in Pollen und Bienenbrot von europäischen (EHB) oder Africanized (AHB) Honigbienen gemacht. Der pH-Wert von Pollen war signifikant höher als die beebread durch Varianzanalyse bestimmt (F 2,12 = 3725, p &lt;0,0001), gefolgt von einer Tukeys W- Fachvergleichstest. Die Proteinkonzentration in Pollen war signifikant höher als in beebread durch EHB (EBB) oder AHB (ABB) hergestellt (F 2,27 = 16,49; p &lt;0,0001). Mittel, gefolgt von dem gleichen Buchstaben sind nicht auf dem Niveau 0,05 signifikant unterschiedlich. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig2highres.jpg" width="600" /> Bild 2: Der durchschnittliche Anteil der cells Bienenbrei, die vollständig über eine 11 Tage-Intervall von caged Bienen verbraucht wurden enthält. Die Bienenbrei wurde entweder von europäischen (EHB) oder Africanized (AHB) Bienen mit dem gleichen Pollenquelle gemacht. Die Mittelwerte wurden aus fünf Käfige jeder Behandlung geschätzt; die mit dem gleichen Buchstaben sind nicht auf dem Niveau 0,05 signifikant, wie durch eine Varianzanalyse (F 3,16 = 7,3, p = 0,003) und W Tukey bestimmt. Dieses Bild wurde von 25 modifiziert. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig3highres.jpg" width="600" /> Abbildung 3: Die durchschnittliche Konzentration des Proteins in der Hämolymphe von europäischen (EHB) oder Africanized (AHB) Honigbienen gefüttert Bienenbrei von europäischen (EBB) oder Africanized (ABB) Bienen für 4, 7 und 11 Tagen Eine wiederholte Messungen Analyse. Varianz angegeben signifikanten Unterschiede zwischen den 4 treatment Gruppen (F 3,20 = 19,7, p &lt;0,001). Levels von löslichem Protein in AHB gefüttert ABB deutlich über EHB gefüttert ABB (p = 0,008) oder EBB (p = 0,018). Das Alter der Bienen zum Zeitpunkt der Probenahme erheblich beeinträchtigt lösliches Protein-Konzentrationen in der Hämolymphe. Verglichen mit Tag-7 (p &lt;0,0001) und 11 (p = 0,001) Ebenen waren deutlich niedriger in Tag-4 Bienen. Tag 7 und Tag 11 Bienen unterschieden sich nicht (p = 0,149). Diese Zahl hat sich von 25 modifiziert. <img alt="4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52448/52448fig4highres.jpg" width="600" /> Abb. 4: Die Konzentrationen von Aminosäuren (ug pro Gramm Pollen oder Bienenbrot) in Pollen oder die Bienenbrot daraus EBB besteht Bienenbrei von europäischen Bienen und ABB wurde von Africanized Bienen. Tryptophan, Cystein, Phenylalanin und Prolin wurden separat zum Zwecke der Klarheit in pre aufgetragensenting ihre Mengen. Diese Zahl hat sich von 25 modifiziert.

Hier sind Methoden zur Quantifizierung von Nährstoffen in Pollen vor und nach seiner Umwandlung in Bienenbrot durch zwei Unterarten von Honigbienen. Wir beschreiben Techniken zur Messung des Bienenbrotverbrauchs und der daraus resultierenden Proteintiter in beiden Unterarten.

Methoden zum Vergleich der Nährstoffe in Bienenbrot Hergestellt von Africanized und europäischen Honigbienen und die Auswirkungen auf die Hämolymphe Protein Titer

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Nährstoffe in Pollen und Bienenbrot, das von zwei Unterarten der Honigbiene hergestellt wird, zu quantifizieren und den Verbrauch von Proteintitern zu messen. Dies wird erreicht, indem europäischen und afrikanischen Bienen dieselbe Pollenquelle in einem abgegrenzten Bereich angeboten wird, sodass die Bienen den Pollen in ihren Kolonien als Bienenbrot einlagern können. Anschließend wird das Bienenbrot neugeborenen europäischen und afrikanischen Bienen in Käfigen verfüttert.Anschließend werden Bienen in den Käfigen nach vier, sieben und elf Tagen Fütterung entnommen, und die Menge des verbliebenen Bienenbrots in jedem Käfig wird gemessen, um den Verbrauch zu schätzen. Schließlich werden die Konzentrationen von Nährstoffen, einschließlich Protein und Aminosäuren, im Pollen sowie im von europäischen und afrikanisierten Bienen hergestellten Bienenbrot gemessen und zwischen den Bienenrassen verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich Bienenbrot vom Pollen in der Proteinkonzentration und in der Konzentration einiger Aminosäuren sowie in den Proteintitern der Hämolymphe unterscheidet.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen in der Erforschung der Ernährung von Honigbienen beantworten, beispielsweise die Rolle der Pollenquelle für die Nährstoffe in Bienenbrot und die Art und Weise, wie Bienen unterschiedlicher Unterarten und Genotypen diese Nährstoffe aufnehmen. Die Techniken demonstriert Emily Watkins de Young, eine studentische Technikerin in meinem Labor. Um zu beginnen, nachdem Pollenfallen an den Bienenvölkern angebracht wurden, sammelt man den Pollen, mahlt ihn mit einer Kaffeemühle zu einem feinen Pulver, richtet fünf Völker ein – jeweils afrikanische Honigbienen (A. mellifera) oder europäische Honigbienen (EHB) – in einem umschlossenen Flugbereich (EFA), sodass die Bienen nur den bereitgestellten Pollen sammeln und Arbeiterinnen nicht zwischen EHB- und AHB-Völkern abwandern können. Teilen Sie den EFA in separate Abschnitte, sodass die Bienen nicht zwischen ihnen wechseln können. In jeden Abschnitt des EFA stellen Sie einzelne EHB- oder AHB-Völker mit 3.500 bis 4.000 Arbeitsbienen, Waben mit Nektar, Honig, unreifer Brut und leeren Waben. Füttern Sie die Völker mit gemahlenem Pollen, indem Sie eine Schale in jeden Abschnitt des EFA stellen und etwa 60 Gramm Pollen auf die Schalen verteilen.Auf diese Weise können Sammelbienen den Pollen als körbchenförmige Ladungen aufnehmen und ihn in ihren Kolonien als Bienenbrot lagern, um die Bienen in Käfigen zu füttern. Stellen Sie Waben mit verdeckelter Arbeitsbienenbrut aus HB- und EHB-Kolonien getrennt in Schlupfkäfige in einem Umweltkammerraum mit 32 bis 24 Grad Celsius und 40 % relativer Luftfeuchtigkeit. Wenn die Arbeitsbienen nach etwa 24 Stunden geschlüpft sind, richten Sie 12 Plexiglaskäfige für Bioassays ein und geben Sie entweder 100 frisch geschlüpfte EHB- oder HB-Arbeitsbienen in jeden Käfig. Platzieren Sie einen Wabenabschnitt mit einer bekannten Anzahl entweder europäischer bbr- oder EBB- oder afrikanisierter B-Brot- oder A-B-B-Zellen in jeden Käfig, um die folgenden Behandlungsbedingungen zu erzeugen.Eine HB, die A-B-B-E-H-B erhielt, erhielt A B, BAHB erhielt EBB und EHB erhielt EBB. EBB fügte den Käfigen Fläschchen mit Wasser und eine 30%ige Saccharoslösung, die nach Volumen hergestellt wurde, hinzu. Ersetzen Sie die Fläschchen mit Zuckersirup und Wasser täglich während des 11-tägigen Studienzeitraums.Entnehmen Sie Proben von 10 frisch geschlüpften EHB- und A-HB-Arbeiterinnen, bevor Sie diese in die Käfige setzen. Bezeichnen Sie diese als B-Arbeiterinnen vom Tag null und verwenden Sie sie als Basislinie für die Hämolymphe-Proteinkonzentrationen. Entfernen Sie 10 Bienen aus jedem Käfig, nachdem sie vier, sieben bzw. elf Tage lang EBB oder eine B, B aufgenommen haben.Stellen Sie die lebenden Bienen einzeln in Falcon-Röhrchen und legen Sie diese auf Eispacks. Wählen Sie die Teilprobe von vier Bienen zur Analyse der Hämolymphe-Proteinkonzentration nach der Probenahme der Bienen am Tag 11 aus und zählen Sie die Anzahl der Waben­zellen, die noch Bienenbrot enthalten. Entfernen Sie das verbleibende Bienenbrot aus den Zellen jedes Käfigs und lagern Sie es getrennt nach Käfigen in Mikrozentrifugenröhrchen.Lagern Sie die BBR-Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie auf lösliche Protein-Konzentration und Aminosäuregehalt analysiert werden. Für die Proteinanalyse entnehmen Sie sechs Proben des Pollens sowie jeweils eine Probe von EBB und A BB aus jedem Käfig. Geben Sie 20 Milligramm entweder Pollen oder BBR mit einem Milliliter 0,1 molarer PBS versetzt und 10 Sekunden lang verwirbeln, anschließend eine Minute bei 571,2 ×g zentrifugieren.Entnehmen Sie eine 25-Mikroliter-Probe des S-Supernatants und geben Sie sie in eine Vertiefung einer 96-Loch-Flachbodenplatte aus Polystyrol für E-I-A-R-I-A. Führen Sie jede Probe in drei Vertiefungen im Duplicate durch. Erhitzen Sie das Ende eines 20-Mikroliter-Kapillarrohrs und ziehen Sie den erhitzten Bereich, bis eine nadelförmige Spitze entsteht.Anschließend wird Hämolymphe von Bienen, die aus jedem Käfig gesammelt wurden, entnommen, indem das Kapillarrohr in den rechten seitlichen Bereich des Thorax in der Nähe der Flügelansatzstelle eingeführt wird. Falls erforderlich, kann zusätzliche Lymphe gewonnen werden, indem dasselbe Rohr in die Membran zwischen den Abdominalsegmenten eingeführt wird. Geben Sie ein Mikroliter Hämolymphe zu neun Mikrolitern 0,1-molarer PBS-Lösung hinzu.Verwenden Sie ein Bradford-Protein-Assay-Kit und befolgen Sie die Herstelleranweisungen, um das gesamte lösliche Protein zu bestimmen. Konzentrationen zur Durchführung der Aminosäureanalyse gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll; wie in diesen Grafiken gezeigt, waren sowohl der pH-Wert als auch die ProteinKonzentration in bbr niedriger als in Pollen. Sowohl EHB als auch A HB nahmen mehr A BB auf als EBB, wie hier dargestellt.Die Konzentrationen löslicher Proteine im Hämolymphe von A HB waren unabhängig von der Art des konsumierten Bbr signifikant höher als bei EHB. Diese Unterschiede in den Proteinkonzentrationen im Hämolymphe traten auf, obwohl EHB und A HB ähnliche Mengen jeder Art von Bbr konsumierten. Von den 10 für Honigbienen essentiellen Aminosäuren wurden alle mit Ausnahme von Histamin im Pollen nachgewiesen.In den meisten Fällen waren die Konzentrationen von Aminosäuren in Bienenbrot höher als im Pollen. Beispielsweise lagen die Konzentrationen von Leucin und Thionin in BBR etwa 60 % höher als im Pollen, und die Valin-Konzentrationen waren etwa 25 % höher. Auch die Gehalte an Alanin, Asparaginsäure und Glutamin waren in BBR höher als im Pollen.Die Konzentrationen der Aminosäuren unterschieden sich zwischen A B, B und EBB mit Ausnahme von Phenylalanin und Cystin nicht stark. Die Phenylalanin-Konzentrationen waren in A BB etwa doppelt so hoch wie in EBB oder Pollen. Die Cystin-Konzentrationen waren in EBB niedriger als in A, B, B oder Pollen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Proteinkonzentrationen in Bienenbrot, Pollen und Honigbienen-Hämolymphe bestimmt. Mit diesen Methoden können Sie ermitteln, ob genetische oder umweltbedingte Faktoren die Speicherung und Aufnahme von Nahrung sowie die Proteinkonzentrationen im Hämolymphe beeinflussen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Biologie

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Methoden zum Vergleich der Nährstoffe in Bienenbrot Hergestellt von Africanized und europäischen Honigbienen und die Auswirkungen auf die Hämolymphe Protein Titer (Video) | JoVE Journal

Methoden zum Vergleich der Nährstoffe in Bienenbrot Hergestellt von Africanized und europäischen Honigbienen und die Auswirkungen auf die Hämolymphe Protein Titer

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