Name: Funktionelle Charakterisierung von Na + / H + Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Erfahren Sie die funktionelle Charakterisierung von Na+/H+-Austauschern durch Proton-Killing-Selektion und pH-Recovery-Messungen. Diese Methode ermöglicht die direkte Analyse kinetischer Parameter an der Plasmamembran.

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Die Autoren sind allen Mitgliedern der wissenschaftlichen Gemeinschaft, die sich mit pH und Ionentransport beschäftigen, zu großem Dank verpflichtet, die die hier beschriebenen Messungen entwickelt und verbessert haben. Sie danken insbesondere Dr. Jacques Pouysségur, der die hier verwendete H+-tötende Selektionstechnik entwickelt hat. Sie danken der Universität Nizza-Sophia Antipolis, dem CNRS, der ANR (JCJC SVSE1 NHEint) und dem ICST Labex für die Unterstützung.

1. H + Töten Auswahl <ol><li> Zelllinien <ol><li> Stabil zu transfizieren NHE-defiziente Zellen (zB die CCL39-abgeleitete PS120 Zellinie 16) mit einer beliebigen Kombination von Säugetier-Expressionsvektor und Transfektion Verfahren, die eine effiziente Transfektion Ausbeuten und Selektion in einer Fibroblastenzelllinie zu produzieren. HINWEIS: Viele Jahre wurde Calciumphosphatpräzipitation 19 mit guten Ausbeuten Transfektion verwendet. Dies wurde in jüngerer Zeit durch kommerzielle Reagenzien wie Lipofectamine2000 ersetzt, wobei die Transfektionen nach Herstellerangaben durchgeführt. </li></ol></li><li> Lösungen <ol><li> Bereiten drei nachstehend beschriebenen sterilen Lösungen. Sterilisieren Sie diese Lösungen durch Filtration (0,22 um). <ol><li> Vorbereiten einer NH 4 + Loading-Lösung (pH 7,4) von 50 mM NH 4 Cl, 70 mM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM gl umfasstucose und 15 mM MOPS pH 7,4. </li><li> Bereiten einer Spüllösung (pH 7,0), der 120 mM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,0 enthielt. </li><li> Vorbereiten einer Gewinnungslösung (pH 7,4), der 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 enthielt. </li></ol></li></ol></li><li> Vor Beginn der Auswahl, erhalten eine Zellkulturbrutschrank, die bei 37 ° C ohne zusätzliche CO 2 aus externem Behälter (genannt CO 2 - &quot;frei&quot; Inkubator) verwendet werden kann, wie 5% CO 2 wird in Puffer Ergebnis, dass die beeinträchtigen können Versauerung. Erhöhen der Zelllinie, die NHE von Interesse bis zu etwa 2 x 10 8 Zellen (in der Regel etwa 20 konfluenten 100 mm-Platten). </li><li> H + Töten Verfahren: <ol><li> Die Zellen, die den intrazellulären NHE interessiere Inkubation für 1 Stunde in der Auftragslösung bei 37 ° C im CO 2 -freie Inkubator. </li><li> Saugen Sie das Lade Lösung und dann zweimal spülen Sie sie in der oben beschriebenen-Spüllösung. Führen Sie diesen Schritt effizient, um die restliche extrazellulären NH 4 Cl, die die Schaffung eines steilen NH 4 + Gradienten, die die Versauerung generieren beeinträchtigen beseitigen. </li><li> Beseitigen Sie die Spülmedium durch Aspiration und inkubieren Sie die Zellen für eine Stunde im Recovery-Lösung wieder auf 37 ° C im CO 2 Inkubator frei. </li><li> Ersetzen des Wiederherstellungsmedium mit regelmäßigen Kulturmedium (typischerweise DMEM mit 7,5% FCS) und wachsen die Zellen in Standardkulturbedingungen (37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 und 95% Luft). </li></ol></li><li> Wiederholen Sie diesen Zyklus der Auswahl zweimal in der Woche, bis stabile Klone entstehen. HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig über die Zellkultur und Selektionsbedingungen. Monate Arbeit kann von jedem Kontamination, die anfälliger für o ist ruiniertCCur nach einer langen Periode der Kultur und wiederholte Zellmanipulationen. <ol><li> Hier auswählen, ob die Klone zu verstärken und zu charakterisieren, sie individuell, wie weiter in Abschnitte 2-3 beschrieben, oder sie gemeinsam zusammen, um eine Zellpopulation vor der Charakterisierung zu erzeugen. </li></ol></li><li> Anwenden gelegentlichen Auswahl (etwa einmal alle zwei Wochen), um die Ansäuerung-resistenten Zellen durch Gegen diejenigen ausgewählt werden, die dem Elternsäureempfindlichen Phänotyp (1B) umgeschaltet haben kann beibehalten. </li></ol> 2. Intrazelluläre pH-Messungen 2.1) Fluoreszenz pH Imaging <ol><li> Verwenden Sie die ratiometrische pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff BCECF / AM, der pH-empfindlich ist, wenn bei 490 nm angeregt und besitzt eine 445 nm isosbestischen Punkt nach Herstellerprotokolle. <ol><li> Alternativ können Sie auch andere pH-empfindliche Sonden, nach Herstellerprotokolle. </li></ol></li><li> Verwenden Sie eine Bild gesetzt conbestehend aus einem umgekehrten Mikroskop auf eine hohe Empfindlichkeit Videokamera gekoppelt ist. Rüsten Sie dieses Set mit 450 nm und 490 nm Schmalband-Interferenzfilter, gepaart mit entsprechenden Quarz-Neutraldichtefilter zur Anregung. <ol><li> Wenn möglich, verwenden Sie die entsprechende Reihe von Filtern und Beleuchtungsbedingungen die Einrichtung vergleichbarer Fluoreszenzwerte für λ1 und λ2, dass das Verhältnis nähert 1. Vermeiden Sie auch basale Fluoreszenzwerte, die gesetzt werden, entweder gesättigt oder zu niedrig ist, sowohl für λ1 und / oder λ2. Dies kann wichtige Artefakte ergeben, wie dann kann das Verhältnis nicht nachweisbar, obwohl intrazellulären pH-Wert verändert sich. HINWEIS: Das System muss schnell Perfusion, Zeitraffer-Anregung bei den beiden oben genannten Wellenlängen und Übernahmen in der richtigen Emissionswellenlänge (535 nm für BCECF) zu ermöglichen. Rüsten Sie das System mit Software, die automatische Datenerfassung und -speicherung. </li></ol></li></ol> 2.2) Messung der NHE Zukunfts Aktivität (Extrusion vonProtonen aus dem Cytosol) <ol><li> Anzusäuern Zellen durch einen 1-stündigen Inkubation in der NH 4 + Loading-Lösung (siehe Schritt 1.4) in Abwesenheit von CO 2. </li><li> Fügen BCECF-AM (5 uM Endkonzentration) zu der Lösung in den letzten fünf Minuten und dann spülen Sie ihn mit NH 4 + Beladungslösung, die extrazelluläre Sonde zu entfernen. </li><li> Montieren Sie die Zellen unter dem Mikroskop an, um mehrere Bilder auf eine stabile Basislinie aufzuzeichnen. Versorgen die Spüllösung (siehe oben). Dies führt zu einem Abfall der Fluoreszenz, die der Ansäuerung. </li><li> Nach pH-Stabilisierung, durchströmen eine der unten angegebenen Lösungen für pH Rückgewinnungsraten von Li + / H +, Na + / H + oder K + / H + Austausch vermittelte messen. Jede Lösung enthält eine potentielle Kopplung Kation für H + Austausch getestet werden. Wenn eine dieser transportiert wird, wird dies in einer Zunahme der Fluoreszenz bei 495 nm, die entspr resultierenond zu einer Erhöhung des intrazellulären pH-Wert: 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4, 125 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4, </li></ol> 2.3) Messung der NHE Rückwärtsaktivitäts ANMERKUNG: Das Prinzip dabei ist, die Transmembran-Ionengradienten invertieren. <ol><li> Vor der Messung laden die Zellen mit der intrazelluläre Kation von Interesse (siehe unten). </li><li> Inkubieren Sie sie für 5 min mit BCECF / AM (siehe Schritt 2.2.2); spülen Sie sie, hängen Sie sie auf dem Videomikroskop. </li><li> Versorgen die Beladungslösung an, um mehrere Bilder auf eine stabile Basislinie aufzuzeichnen. </li><li> Nach der Grundlinienstabilisierung Bild die pH-Schwankungen, wenn die Zellen mit einer extrazellulären sauren Medium, das 120 m perfundiertM Cholinchlorid, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM MES bei pH 6,5. </li><li> Für LiCl Lade inkubieren Zellen für 2 h in einer Lösung von 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 zusammengesetzt. Intrazellulärem Lithium durch Atomabsorptionsspektroskopie gemessen ergibt einen Wert von etwa 60 mM. </li><li> Für Na + Lade inkubieren Zellen für zwei Stunden in einer Lösung aus 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 15 mM HEPES bei pH 7,4 zusammengesetzt ist, in Gegenwart von 1 mM Ouabain die Na / K-ATPase zu blockieren. Unter diesen Bedingungen ist die intrazelluläre Na + Konzentration im Bereich von 40 mM. HINWEIS: K + Belasten nicht notwendig cytosolischen K + -Konzentration in einem Bereich von 140 mm und einen nach außen gerichteten K + -Gradienten ist daher leicht zu erreichen. </li></ol> 2.4) Datenreinigung und Kalibrierung: HINWEIS: Dieser Schritt gilt sowohl für die Vorwärts- und Rückwärtsmessung. <ol><li> Am Ende jedes Experiments perfundieren Zellen mit einer Lösung von 140 mM KCl, 20 mM HEPES und 5 &amp; mgr; M Nigericin auf pH-Werte zwischen 6,5 und 7,4 eingestellt. </li><li> Sammeln Sie Daten, wie Fluoreszenzmessungen aus den Bildern (Graustufen, die Intensitätsstufen) und Export unter Text-Format und zu behandeln, wie unten mit einem Tabellenkalkulationsprogramm erläutert. </li><li> Berechnen intrazellulären pH-Wert für jede einzelne Zelle oder eine Region von Interesse unter Verwendung der folgenden Gleichung: pH = pKa + (Log (R-R min) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) </li><li> Durch Drücken der F min (λ2) / F ma x (λ2) -Verhältnis, wenn es Sonde Bleichen oder Leckage, was zu einer Abnahme der 450 nm-Fluoreszenz während der gesamten Experimente. Dies ist aber nur sehr selten in den in der des verwendeten Bedingungen beobachtetcribed Experimente. </li><li> Da die Kalibrierungsdaten am Ende jedes der pH-Messung vorhanden sind, zu überprüfen, ob die entsprechenden berechneten Werte die pH-Werte für die Kalibrierung verwendet werden, unterscheiden. Wenn dies der Fall ist, stellen Sie dann alle experimentell bestimmten pH-Werte für die Kalibrierung mit dem folgenden Verfahren: <ol><li> Berechnen des folgenden Quotienten (Q, die Differenz zwischen der gemessenen Werte / Unterschied zwischen der Kalibrierungswerte). Multiplizieren Sie die gesamte Datenmenge von Q. Nehmen Sie die endgültige Einstellung durch Addition oder Subtraktion, so dass die berechneten Werte werden die entsprechenden Kalibrierungswerten entsprechen. </li></ol></li></ol> 3. Messungen der Anfangsgeschwindigkeiten von NHE7 von Fast Li + Uptake <ol><li> Saatgutzellen auf Multi-Well-Platten (6 bis 24 Vertiefungen) und säuert sie entweder mit der oben oder abwechselnd die Nigericin / Rinderserumalbumin (BSA) in 20 beschrieben Ansäuerung beschrieben NH 4 + Beladungstechnik. </li><li&gt; Rinse Platten zweimal schnell unter Verwendung der oben beschriebenen Spüllösung und dann Inkubieren der Zellen in die Aufnahme Lösungen enthaltend 1-10 mM Lithium (leicht unterhalb Km-Werte) und die gewünschten Konzentrationen der Kationen und / oder Inhibitoren von Interesse für die gewünschte Menge der Zeit. </li><li> Halten Sie kurz und konsistente Aufnahme Dauer (in der Regel 1 Minute oder weniger), um sicherzustellen, dass der Transport ist im Anfangsgeschwindigkeiten Bedingungen. Stellen Sie außerdem sicher, dass alle für die Aufnahme verwendeten Lösungen sind isotonisch. </li><li> Am Ende der Aufnahmezeit, sorgfältig beseitigt die Aufnahmemedium und die Zellen werden viermal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Führen Sie diese wäscht so schnell wie möglich (weniger als 10 Sekunden für die vier von ihnen ist ideal), um Lithium-Efflux verhindern. </li><li> Lyse der Zellen in 25% ige Salpetersäure. Apply 250 ul pro Vertiefung von 25% Salpetersäure und lassen Sie es für mindestens 1 h sitzen, dann Schrott jede Vertiefung mit dem Ende der Pipettenspitze und überweisen Sie den ganzen gut Suspension in einem neuen microcentrifuge Rohr. </li><li> Übertragen des Lysats in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugieren 5 Minuten lang bei 15.000 × g (Raumtemperatur), um die Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Messung der Lithiumgehalt der Überstände durch Atomabsorptionsspektroskopie 21. HINWEIS: Verschiedene Unternehmen bieten Atomabsorptionsspektrometer, das mit einer Lithium-Hohlkathodenlampe ausgestattet werden müssen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, wie diese Maschinen sind sehr präzise, ​​sondern auch sehr empfindlich. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen, die intrazelluläre Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran, ohne dass ihre Primärsequenz durch ortsgerichtete Mutagenese ausgewählt. Diese Austauscher kann nun charakterisiert werden. Dieses Verfahren basiert auf der zellulären Toxizität von intrazellulärem Protonen basierend auf Zelllinien, die vesikulären Na + / H + Austauscher an der Plasmamembran exprimieren wählt. Es könnte möglich sein, im Prinzip ...

Die meisten intrazellulären Kompartimenten Anzeige eine saure luminalen pH-Wert, der einer der wichtigsten Parameter für die Reifung, Menschenhandel, Recycling von Proteinen oder Hormonen und Neurotransmittern Laden ist. Es wurde gezeigt, dass der pH-Gradient zwischen Cytosol und vesikulärer Gehalt durch vakuoläre H + ATPasen 1 erzeugt, um vesikuläre ClC Chloridtransporter 2 gekoppelt. Sowohl in Knock-out (KO) Mäusen und menschlichen Patienten ist die Bedeutung dieser Transporter durch die schweren Phänotypen, die durch Mutationen in ihren Genen 3-6 verursacht hervorgehoben. Die Mitglieder des Sodium-Hydrogen Tauscher SLC9A Familie, genannt auch NHEs für Na + / H + Austauscher haben, dass sie Schlüssel Effektoren der intrazellulären pH-Wert und Zellvolumenregulation sowie in vektorieller Transport von Säure-Basenäquivalente durch das Zellgewebe sein . Neben der Plasmamembran NHEs drei hochkonservierten Na + / H + Austauscher NHE 6, 7und 9 sind in trans-Golgi Netzwerk und Anfang Endosomen 7 ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit Angelman-like oder Christi Syndrome 8-9, familienbasierten Autismus 10 und Aufmerksamkeits-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung 11-12 verbunden. Diese Tauscher auch bei neurodegenerativen Probleme wie Alzheimer Krankheitsanfälligkeit 13 und X-chromosomale geistige Retardierung zusammenhängenden Gene Syndrome 14 beteiligt. Zusammen genommen verdeutlichen auch diese Studien die Bedeutung dieser intrazellulären NHEs der Gehirnentwicklung und / oder Funktion. Die intrazelluläre Lokalisation dieser Tauscher verhindert genaue Messungen der Ionenselektivität, Transportrichtung, kinetische Parameter und Regulierung. Wie ist der Fall für alle Transporter in intrazellulären Kompartimenten ausgedrückt, äußerst schwierig, ihre biochemischen Aktivitäten zu bewerten und damit zu ihrer physiologischen Funktionen und die mechan vollständig zu verstehen istIsmen zugrunde liegenden pathologischen ihre Auswirkungen. Aufgrund der hohen cytosolische K + -Konzentration, war die allgemein akzeptierte Hypothese, dass sie als K + gekoppelten Protonen Efflux-Transporter arbeiten. Die Existenz einer solchen Protonenleck hatte Hypothese aufgestellt, wie es Protonenpumpen durch den V-ATPasen, um einen stationären Zustand vesikulären pH aufrechtzuerhalten leichen. Das Ziel dieser visuellen Gegenstand (i), ein Verfahren, das die genetische Selektion von Zelllinien, die solche vesikuläre Transporter an ihrer Plasmamembran zu exprimieren, und (ii) an zwei unabhängige Ansätze, um die Funktionen dieser Transporter messen zeigen ermöglicht demonstrieren. Vor drei Jahrzehnten Pouysségur und Franchi eine genetische Ansatz, der die molekulare Klonierung und Charakterisierung der Mitglieder der NHE Familie 15 aktiviert voran. Dies wurde auf die Toxizität von intrazellulärem Protonen als Screening Methode. Der erste Schritt war, um Zelllinien zu erhalten defizientenjeden Na + / H + -Austausch ausgedrückt in der Plasmamembran mit Hilfe der Reversibilität dieses Transporters. Fibroblasten (CCL39-Zellinie) wurden mit Na + oder Li + vorgespannt und dann in einer sauren extrazellulären Mediums (pH 6,5) für 2 Stunden platziert. Dies führte zu dem Tod von Zellen, die einen funktionellen Na + / H + -Austausch zu aktivieren und auf die Auswahl von Antiporter-defizienten Zellen (PS120 Zellinie) 16. Wenn Bicarbonat-freiem Medium kultiviert werden, diese Zellen sind sehr empfindlich gegenüber akuten intrazellulären Ansäuerung. Infolgedessen wird die Expression eines beliebigen Funktionsprotonen Effluxmechanismen an der Plasmamembran positiv gewählt werden (siehe 17), wenn diese Zellen in akuten intrazellulären Ansäuerungen eingereicht. Solche Versauerung Techniken können verwendet werden, um Zelllinien mit Handel Defekte ermöglicht die erzwungene Expression von WT intrazellulären NHEs an der Plasmamembran zu isolieren. Als eukaryontische Na + / H+ Tauscher sind elektro, sie sind nicht messbar durch die elektrophysiologische Ansätze, die mit großem Erfolg eingesetzt worden sind, um Kanäle zu messen. Dieses Manuskript daher demonstriert, wie die Aktivität dieses Tauscher durch intrazelluläre pH-Messungen und schnelle Kinetik der Lithiumaufnahme messen. Da die zugrunde liegenden Konzepte die gleichen sind, ist es interessant zu bemerken, daß viele der für den Auswahlabschnitt entwickelten Verfahren auch direkt für die funktionelle Messungen verwendet. Interessanterweise haben wir festgestellt, dass der Menschenhandel Defekt in der Zelllinien mit Hilfe der in dieser Handschrift beschriebenen Ansatz gewählt vorhanden führt zu einer größeren Expression von anderen vesikulären Proteine ​​an der Plasmamembran wie der vesikulären Kaliumkanal TWIK1 18. Dies weist darauf hin, in Richtung auf die Auswahl einer allgemeinen Retentionsdefektmechanismus vesicularis Transmembranproteine. Daher ist diese Auswahlverfahren und die Zellen, die es generiert Maistellen ein vielversprechendes Werkzeug für die wissenschaftliche Gemeinschaft der Arbeit an den Membranproteinen von intrazellulären Kompartimenten. Sowie die Messtechnik hier vorgestellten könnten anwendbar für die Untersuchung anderer nicht-elektroTransporter sein.

<table><tbody><tr><td>Standard-Zellkulturausrüstung</td><td></td><td></td><td>Wird für die H+-Tötungsselektion verwendet, bestehend aus vielen Geräten mit unterschiedlichen Katalognummern</td></tr><tr><td>Inkubator mit CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator ohne CO2</td><td>Heraeus Instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Haube PSM1200NF</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>52010120</tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomabsorptionsspektrometer mit Zeeman Ofensystem</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Salpetersäure</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Videomikroskopie-Set</td><td>Leica</td><td></td><td>Bestehend aus vielen Geräten mit unterschiedlichen Katalognummern</td></tr><tr><td>Inverses automatisiertes Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopstativ</td><td>Leica</td><td>11888906 11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> 11505180 <td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>Auflichtfluoreszenz</td><td>Leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>Motorhalterung</td><td>Leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED-Übertragungsleuchte&nbsp;</td><td>Leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>Motorplatte</td><td>Leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>11888424</tr><tr><td>Kameraausgabe</td><td>Leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807 11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 11888259 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>Bilderfassungs-/Analysesoftware</td><td>Leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>Optik</td><td>Leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Xenonlampe</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>Metafluor/Mmfluor Software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH-empfindliche Sonde, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

funktionelle charakterisierung von na<sup&gt; +</sup&gt; / h<sup&gt; +</sup&gt; wärmetauscher von intrazellulären kompartimente mit proton-tötung selection man sie an der plasmamembran express

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomalen Ansäuerung ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von Prozessen, wie zB Protein-Recycling und Abbau, Rezeptordesensibilisierung und Neurotransmitter Belastung in synaptischen Vesikeln. Diese Ansäuerung wird beschrieben, dass durch Protonen-ATPasen, um ClC Chloridtransporter gekoppelt vermittelt werden. Hochkonservierten elektro Protonen Transporter sind die Na + / H + Austauscher (NHE) 6, 7 und 9 auch in diesen Kammern ausgedrückt. Mutationen in ihren Genen haben mit der menschlichen kognitiven und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht worden. Paradoxerweise bleibt ihre Rolle schwer fassbar, da ihre intrazelluläre Lokalisation hat detaillierte funktionelle Charakterisierung verhindert. Diese Handschrift zeigt ein Verfahren, um dieses Problem zu lösen. Diese besteht aus der Auswahl der mutierten Zelllinien, fähig zu überleben akuten cytosolische Ansäuerung durch Halte intrazellulärem NHEs an der Plasmamembran. Es zeigt dann zwei sich ergänzenden Protokolle, um die Ionenselektivität und Aktivität zu messendieser Austauscher: (i) eine auf die intrazelluläre pH-Messungen unter Verwendung von Fluoreszenzvideomikroskopie, und (ii) eine auf der Basis der schnellen Kinetik der Lithiumaufnahme. Solche Protokolle können extrapoliert werden, um andere nicht-elektro Transporter zu messen. Darüber hinaus ist die hier vorgestellte Auswahlverfahren erzeugt Zellen mit einem intrazellulären Retention defekt Phänotyp. Daher werden diese Zellen exprimieren auch andere Vesikelmembran Proteine ​​an der Plasmamembran. Die hier dargestellte experimentelle Strategie kann daher eine potentiell leistungsfähiges Werkzeug, um andere intrazelluläre Proteine, die dann an der Plasmamembran zusammen mit der vesikulären Na + / H + Austauscher für die Auswahl verwendet ausdrücken zu studieren.

Auswahl: Die H + tötet Auswahl basiert auf der Diffusion des Ammonium schwachen Base basiert, wie in 1A dargestellt. Die Wirkung von schwachen Basen und Säuren Diffusion auf intrazelluläre pH wurde von Walter Boron und Mitarbeiter 22 Pionierarbeit geleistet. Das elegante Idee, dieses Phänomen zu nutzen, um zu produzieren eine tödliche Versauerung für positive genetische Selektion wurde dann von Jacques Pouysségur 17 entwickelt. Unter solchen ...

Der erste Teil dieses Artikels zeigt, wie mutierte Zelllinien ausgewählt werden, die vesikuläre Na+/H+-Austauscher an ihrer Plasmamembran exprimieren. Der zweite Teil enthält Protokolle, die auf intrazellulären pH-Messungen und schneller Ionenaufnahme basieren und zur Bestimmung der Ionenselektivität und der kinetischen Parameter dieser Austauscher verwendet werden.

Funktionelle Charakterisierung von Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Aktivität intrazellulär exprimierter Natrium-Protonen-Austauscher zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen ausgewählt werden, die die intrazellulären Natrium-Protonen-Austauscher an der Plasmamembran exprimieren, und zwar mittels Protonen-Killings-Selektion. Im zweiten Schritt werden die ausgewählten Zellen azidifiziert und anschließend die Wiederherstellung des intrazellulären pH-Werts gemessen, um die Natrium-Protonen-Austausch-Aktivität der Zellen zu bestätigen.Die schnelle Kinetik des Ionen­transports wird anschließend gemessen, um die Affinitäts­konstanten für den transportierten Kationen und Inhibitoren zu bestimmen. Letztendlich ermöglicht die Überwachung der Änderungen des intrazellulären pH-Werts und der schnellen Kinetik der ausgewählten somatischen Zellen die funktionelle Charakterisierung des intrazellulären Protein­austauschs. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Expression mutierter Transporter oder der Verwendung einzelner Zellen liegt darin, dass sie die Expression von Wildtyp-intrazellulären Transportern an der Plasmamembran ermöglicht, wodurch deren Funktion direkt gemessen werden kann.Den Ablauf wird Dr. Mallory Poit, eine Wissenschaftlerin aus meinem Labor, demonstrieren. Um das Protonenauslöschungsverfahren zu beginnen, inkubieren Sie die Zellen, die den interessierenden intrazellulären Natrium-Protonen-Austauscher exprimieren, zunächst eine Stunde lang in der Beladelösung bei 37 Grad Celsius und in einem inkohlendioxidfreien Inkubator. Danach aspirieren Sie die Beladelösung und waschen die Zellen zweimal mit frischem Medium.Nach der zweiten Wäsche das Medium abziehen und die Zellen in einer Kohlendioxid-freien Inkubationskammer in der Rekonstitutionslösung inkubieren. Nach einer weiteren Stunde das Rekonstitutionsmedium durch reguläres Kulturmedium ersetzen und die Zellen unter standardmäßigen Kulturbedingungen weiterkultivieren. Diesen Selektionszyklus zweimal wöchentlich wiederholen, bis stabile Klone entstehen, um die intrazelluläre Fluoreszenz-pH-Werte der Zellen abzubilden.Zunächst wurde ein Abbildungssystem ausgestattet, das aus einem umgekehrten Mikroskop in Kombination mit einer hochsensitiven Videokamera und engbandigen Interferenzfiltern bei 450 Nanometern und 490 Nanometern besteht, gepaart mit den entsprechenden Quarz-Neutraldichtefiltern zur Anregung. Verwenden Sie nach Möglichkeit den geeigneten Satz an Filtern und Beleuchtungsbedingungen, um vergleichbare Fluoreszenzwerte für die Kanäle eins und zwei einzustellen, sodass das Verhältnis eins beträgt, um die Vorwärtsaktivität des Natrium-Protonen-Austauschers zu messen. Als Nächstes säuern Sie die Zellen durch eine einstündige Inkubation in einer Ammonium-Lade-Lösung an.Im letzten fünf Minuten der Inkubation färben Sie die Zellen in Abwesenheit von Kohlendioxid mit einem ratiometrischen, pH-empfindlichen fluoreszenten Farbstoff. Am Ende der Inkubationszeit spülen Sie die Zellen mit Ammonium-Lösung zum Beladen, um den extrazellulären Farbstoff zu entfernen, und bringen Sie die gefärbten Zellen auf dem Mikroskop unter. Wählen Sie die interessierenden Bereiche entsprechend aus, in denen die fluoreszenten Werte gemessen werden sollen.Zeichnen Sie anschließend mehrere Bilder auf, um einen Basiswert zu etablieren, und perfundieren Sie die Zellen mit der RIN-Lösung, um einen Abfall der Fluoreszenz einzuleiten. Nachdem sich der pH-Wert stabilisiert hat, perfundieren Sie die Zellen mit der Lösung der Untersuchung, um die pH-Wiederherstellungsrate zu messen, die durch den Lithium-Wasserstoff-, Natrium-Wasserstoff- oder Kalium-Wasserstoff-Austausch vermittelt wird. Perfundieren Sie nun die Zellen mit der Lösung von Hippies, ergänzt mit Kaliumchlorid und Gerin.Sammeln Sie anschließend die Fluoreszenzmesswerte aus den Bildern und exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm im Textformat, um die Anfangsgeschwindigkeit des Natrium-Protonen-Austauschers zu bestimmen. Sieben: Säuern Sie die Zellen und Mehrfach-Platten durch die eben gezeigte Imodium-Ladetechnik mittels schnellem Lithiumaufnahmeverfahren an. Spülen Sie danach die Platten zweimal schnell wie zuvor gezeigt aus.Anschließend inkubieren Sie die Zellen in Aufnahmelösungen, die ein bis zehn Mikromolar Lithium sowie die gewünschten Konzentrationen des Kations oder der interessierenden Inhibitoren enthalten, für etwa eine Minute oder weniger. Am Ende der Aufnahmephase entfernen Sie vorsichtig das Aufnahmemedium und waschen die Zellen viermal rasch mit eiskalter PBS innerhalb von insgesamt weniger als 10 Sekunden, um Lithium-Efflux zu verhindern. Lyse dann die Zellen in 250 Mikrolitern 25%iger Salpetersäure pro Mulde für mindestens eine Stunde. Schaben Sie anschließend jede Mulde mit dem Ende der Pipettenspitze ab und überführen die Suspensionen aus jeder Mulde in neue Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie abschließend die Proben fünf Minuten bei 15.000 × g bei Raumtemperatur, um zellulären Abfall zu entfernen, und bestimmen Sie anschließend den Lithiumgehalt des Überstandes mittels Atomabsorptionsspektroskopie.Entsprechend den Herstelleranweisungen beruht die Protonen-Killings-Selektion auf der Diffusion der schwachen Base Ammonium. Beispielsweise können Zellen, die keinen funktionsfähigen Natrium-Protonen-Austauscher an der Plasmamembran exprimieren, einen neutralen pH-Wert nicht wiederherstellen und weisen daher ein typisches, angesäuertes Erscheinungsbild mit flacher Form und granulärem Zytoplasma auf, wie in diesem repräsentativen Bild nach wiederholten Selektionszyklen zu sehen ist, bei denen Zellen vollständig und stabil überleben. Die Ansäuerung führt jedoch zur Bildung einzelner zellulärer Klone, wie hier dargestellt; die Aktivität und Ionauswahl der an der Plasmamembran exprimierten intrazellulären Natrium-Protonen-Austauscher kann durch die Messung der Änderungen des intrazellulären pH-Werts unter verschiedenen experimentellen Bedingungen charakterisiert werden, wie in diesen Diagrammen nach Imodium-bedingter Ansäuerung beobachtet.Was die Enzymkinetik betrifft, kann die Dosis-Wirkungs-Kurve für die anfänglichen Aufnahmeraten weiter verwendet werden, um die Affinitätskonstanten der Substrate sowie die Hemmkonstanten der Inhibitoren abzuleiten. Tatsächlich ist eine interessante Eigenschaft der Transporter, dass unterschiedliche gekoppelte Kationen um den Transport konkurrieren, wodurch die Möglichkeit besteht, die Affinitätskonstante für Natrium durch Konkurrenz mit der Lithiumaufnahme zu messen, wie in dieser Abbildung bei Anwendung dieses Verfahrens gezeigt. Weitere Experimente, wie die mit RNA-Interferenz gekoppelte Zelloberflächen-BioInnovation, können durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob der betreffende Transporter tatsächlich in der Plasmamembran exprimiert ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Elektroporation wurde verwendet, um gereinigte bakterielle Virulenzeffektorproteine direkt in lebende eukaryotische Zellen einzubringen. Die Proteinlokalisation wurde durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie überwacht. Diese Methode ermöglicht Studien zum Transport, zur Funktion und zu Protein-Protein-Wechselwirkungen mit aktiven exogenen Proteinen, wodurch die Notwendigkeit einer heterologen Expression in eukaryotischen Zellen vermieden wird.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

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Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

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