Funktionelle Charakterisierung von Na ⁺ / H ⁺ Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Aktivität von intrazellulär exprimierten Natriumprotonenaustauschern zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen selektiert werden, die die intrazellulären Natriumprotonenaustauscher an der Plasmamembran exprimieren, indem die Protonenselektion abgetötet wird. In einem zweiten Schritt werden die ausgewählten Zellen angesäuert, und dann wird die intrazelluläre pH-Erholung gemessen, um die Natriumprotonenaustauschaktivität der Zellen zu bestätigen.

Anschließend wird die schnelle Kinetik des Ionentransports gemessen, um die Affinitätskonstanten für das transportierte Kation und die Inhibitoren zu bestimmen. Letztendlich ermöglicht die Überwachung der Veränderungen des intrazellulären pH-Werts und der schnellen Kinetik der ausgewählten somatischen Zellen die funktionelle Charakterisierung des intrazellulären Proteinaustauschs. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Expression mutierter Transporter oder der Verwendung von Zellen besteht darin, dass sie die Expression von intrazellulären Transportern des weißen Typs an der Plasmamembran ermöglicht und somit eine direkte Messung ihrer Funktion ermöglicht.

Das Verfahren wird von Dr. Mallory Poet, einem Forscher aus meinem Labor, demonstriert, um mit dem Protonentötungsverfahren zu beginnen. Inkubieren Sie zunächst die Zellen, die den intrazellulären Natrium-Protonenaustauscher exprimieren, in einer Ladelösung bei 37 Grad Celsius und einem kohlendioxidfreien Inkubator für eine Stunde. Als nächstes aspirieren Sie die Ladelösung und waschen die Zellen zweimal mit frischem Medium.

Nach dem zweiten Waschen aspirieren Sie das Medium und inkubieren die Zellen in einer Rückgewinnungslösung in einem kohlendioxidfreien Inkubator. Ersetzen Sie nach einer weiteren Stunde das Rückgewinnungsmedium durch ein normales Kulturmedium und züchten Sie die Zellen unter Standardkulturbedingungen. Wiederholen Sie diesen Selektionszyklus zweimal pro Woche, bis stabile Klone auftauchen, um den intrazellulären Fluoreszenz-pH-Wert der Zellen abzubilden.

Zunächst wurde ein Imaging-Set bestehend aus einem inversen Mikroskop ausgestattet, das mit einer hochempfindlichen Videokamera mit 450 Nanometern und 490 Nanometern schmalbandigen Interferenzfiltern gepaart mit den entsprechenden Quarz-Neutraldichtefiltern zur Anregung gekoppelt war. Wenn möglich, verwenden Sie den entsprechenden Satz von Filtern und Beleuchtungsbedingungen, um vergleichbare Fluoreszenzwerte für die Kanäle eins und zwei einzustellen, so dass das Verhältnis sich eins nähert, um die Vorwärtsaktivität des Natriumprotonenaustauschers zu messen. Anschließend säuern Sie die Zellen mit einer einstündigen Inkubation in Ammonium-Ladelösung an.

In Abwesenheit von Kohlendioxid während der letzten fünf Minuten der Inkubation färben Sie die Zellen mit einem metrischen pH-Wert empfindlichen Fluoreszenz ab. Am Ende der Inkubationszeit werden die Zellen mit Ammonium-Ladelösung gereinigt, um die extrazelluläre Sonde zu eliminieren und die gefärbten Zellen auf das Mikroskop zu montieren. Wählen Sie die relevanten Bereiche aus, in denen die Fluoreszenzwerte gemessen werden sollen.

Nehmen Sie dann mehrere Bilder auf, um eine Basislinie zu erstellen, und perfundieren Sie die Zellen mit der RIN-Lösung, um einen Abfall der Fluoreszenz zu initiieren. Nachdem sich der pH-Wert stabilisiert hat, untersuchen Sie die Zellen mit der interessierenden Lösung, um die pH-Rückgewinnungsraten zu messen, die durch den Austausch von Lithiumwasserstoff, Natriumwasserstoff oder Kaliumwasserstoff vermittelt werden. Durchsuchen Sie nun die Zellen mit der Lösung von Hippies, die mit Kaliumchlorid und Gerin ergänzt ist.

Sammeln Sie dann die Fluoreszenzmessungen aus den Bildern und exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm im Textformat, um die Anfangsrate des Natriumprotonenaustauschers zu messen. Sieben, durch schnelle Lithiumaufnahme, säuern die Zellen und Multi-Well-Platten durch die Imodium-Ladetechnik an, wie gerade gezeigt. Spülen Sie anschließend die Platten zweimal schnell aus, wie gerade gezeigt.

Inkubieren Sie dann die Zellen in Aufnahmelösungen, die ein bis 10 mikromolares Lithium und die gewünschten Konzentrationen des interessierenden Kations oder der interessierenden Inhibitoren enthalten, für etwa eine Minute oder weniger am Ende der Aufnahmeperiode, entfernen Sie vorsichtig das Aufnahmemedium und waschen Sie die Zellen schnell viermal mit eiskaltem PBS in insgesamt weniger als 10 Sekunden, um einen Lithiumausfluss zu verhindern, und lysieren Sie dann die Zellen in 250 Mikrolitern 25%iger Salpetersäure pro mindestens eine Stunde lang gut. Kratzen Sie jede Vertiefung mit dem Ende der Pipettenspitze am Ende der Inkubation ab und übertragen Sie die Suspensionen aus jeder Vertiefung in neue Mikrozentrifugenröhrchen. Schließlich zentrifugieren die Proben fünf Minuten lang bei 15.000 g bei Raumtemperatur, um die Zelltrümmer zu entfernen, und messen dann den Lithiumgehalt des Snats durch Atomabsorptionsspektroskopie.

Gemäß den Anweisungen des Herstellers basiert die Auswahl der Protonenabtötung auf der Diffusion der schwachen Ammoniumbase. Zum Beispiel können Zellen, die keinen funktionsfähigen Natriumprotonenaustauscher an der Plasmamembran exprimieren, keinen neutralen pH-Wert wiederherstellen und weisen daher ein typisches angesäuertes Aussehen mit einer flachen Form und einem körnigen Zytosol auf, wie in diesem repräsentativen Bild zu sehen ist, nach wiederholten Selektionszyklen, Zellen, die vollständig und stabil überleben. Die Versauerung bildet jedoch einzelne zelluläre Klone, wie hier zu sehen ist, wie gezeigt wurde. Die Aktivität und Ionenselektivität der intrazellulären Natriumprotonenaustauscher, die an der Plasmamembran exprimiert werden, kann charakterisiert werden, indem die Änderungen des intrazellulären pH-Werts gemessen werden, die unter verschiedenen experimentellen Bedingungen induziert werden, wie in diesen Diagrammen nach der Imodium-Beladungsversauerung beobachtet wurde.

Was die Enzymkinetik betrifft, so kann die Dosis-Wirkungs-Beziehung für die anfänglichen Aufnahmeraten weiter verwendet werden, um die Affinitätskonstantenwerte für die Substrate und für die Hemmkonstantenwerte der Inhibitoren abzuleiten. Ein interessantes Merkmal der Transporter besteht darin, dass verschiedene Kopplungskationen um den Transport konkurrieren, was die Möglichkeit bietet, die Affinitätskonstante für Natrium in Konkurrenz zur Lithiumaufnahme zu messen, wie in dieser Abbildung nach diesem Verfahren gezeigt. Andere Experimente wie Zelloberflächen-BioInnovation gekoppelt mit RNA-Silencing können durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob der interessierende Transporter tatsächlich an der Plasmamembran exprimiert wird.