Generierung von murinen Herzschrittmacher Zellaggregate Basierend auf ES-Zell-Programmierung in Kombination mit Myh6-Promoter-Auswahl

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochreine Sinusknotenzellen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zelldifferenzierung induziert wird, indem das Medium modifiziert und hängende Tropfen gebildet werden, die zur Bildung von embryonalen Körpern einer definierten Größe führen. Anschließend werden die embryonalen Körper auf eine mit Gelatine überzogene Schale gelegt, so dass sie eine Zellschicht bilden.

Dann wird die Antibiotikaauswahl eingeleitet und nur Kardiomyozyten überleben. Schließlich wird die Zellschicht dissoziiert, um schnell schlagende einzelne Sinusknotenzellen oder kleine Sinusknotenkörper zu erhalten. Letztendlich wird die Bildgebung von lebenden Zellen verwendet, um hohe Schlagfrequenzen von Sinusknotenzellen zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass Sie hochreine Sinusknotenzellen herstellen können, z. B. für Arzneimitteltests. Die Methode kann uns helfen, zentrale Fragen bei der Sinusknotenerkrankung zu beantworten, da die Zellen uns Einblicke in die zugrundeliegenden Mechanismen geben. Die Technologie wird im Labor von Julia Yung, unserer Doktorandin, vorgestellt, die die Methode entwickelt hat. Beginnend mit einer ES-Zelllinie und pluripotenten Stammzellen, die mit bestrahlten Feeder-Zellen co-kultiviert wurden, wie im Textprotokoll beschrieben, zwei Tage bevor das Differenzierungsverfahren die PSCs aus den Feeder-Zellen entfernt wurden, indem das Medium zunächst aspiriert wurde.

Verwenden Sie 10 Milliliter PBS, um die Zellen zu waschen. Fügen Sie dann sieben Milliliter Kollagenase-Vier-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Legen Sie anschließend einen sterilen 40-Mikrometer-Filter in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie dann die PSC-Kolonien vorsichtig aus, indem Sie die Kollagenaselösung fünfmal auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in den Filter und verwenden Sie acht Milliliter PBS, um den Filter dreimal zu spülen. Drehen Sie dann den Filter um und legen Sie ihn kopfüber in eine Petrischale und pipettieren Sie 10 Milliliter PBS auf den Boden des Filters.

Um die PSC-Kolonien zu entfernen, geben Sie nun die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 300 Mal. G. Entfernen Sie das PBS, suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Accutane und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie nach der Inkubation 10 Milliliter PBS hinzu.

Mischen Sie die Zelllösung, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren und fünf Minuten lang bei 300 mal G zentrifugieren. Sobald das PBS entfernt ist, verwenden Sie 10 Milliliter Zellkultivierungsmedium, um die Zellen zu resuspendieren und die Zellzahl zu bestimmen. 15.000 Zellen pro Quadratzentimeter in einen 75 Quadratzentimeter großen Filterkolben und kultivieren Sie sie zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wenn der Kolben 50 % betragen sollte bis zu 70 % zusammenfließend. Nach der Ernte der Zellen und der Resus, die in einem Differenzierungsmedium gemäß dem Textprotokoll suspendiert sind, pipettieren Sie 20 Milliliter Wasser und fünf Milliliter hängenden Tropfen oder Huntington-Lösung in eine quadratische Petrischale, um ein Austrocknen der Huntington-Krankheit zu vermeiden.

Pipettieren Sie anschließend bis zu 50 Milliliter Zellsuspension in einer Schale. Drehen Sie dann den Deckel der Petrischale um und geben Sie mit einer 12-Kanal-Pipette 180 HDS mit je 20 Mikrolitern Zellsuspension auf den Deckel. Drehen Sie den Deckel vorsichtig um und legen Sie ihn auf die Petrischale.

Nach einer zweitägigen Inkubation, in der die Zellen Ebs bilden können, drehen Sie vorsichtig den Deckel der quadratischen Petrischale um und geben Sie das EBS aus zwei Petrischalen in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Warten Sie 10 Minuten, bis sich das EBS am Boden des Rohrs abgesetzt hat, und saugen Sie dann so viel Medium wie möglich an. Verwenden Sie 10 Milliliter Differenzierungsmedium, um das EBS zu suspendieren, und übertragen Sie die Suspension in eine 10 Zentimeter große Petrischale.

Sobald die Zellen vier Tage lang gemäß dem Textprotokoll in Suspension kultiviert wurden, übertragen Sie das EBS in eine mit Gelatine beschichtete 10 Quadratzentimeter große Zellkulturschale und inkubieren Sie es in den nächsten zwei bis sechs Tagen unter einem Mikroskop, überprüfen Sie die Zellen auf schlagende Herde und die Bildung einer Zellschicht drei Tage, nachdem die Zellen mit dem Schlagen begonnen haben. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 10 Milliliter frische Differenzierung hinzu. Medium, das 400 Mikrogramm pro Milliliter G enthält, vier 18 an die Zellen vier Tage später. Entfernen Sie das Medium vorsichtig, ohne die Zellschicht abzusaugen.

Fügen Sie dann 10 Milliliter PBS hinzu, um die Zellen zu waschen. Nachdem Sie das PBS vorsichtig entfernt haben, fügen Sie 10 Milliliter Kollagenase-4-Lösung hinzu und geben Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, mischen Sie die Suspension kräftig, indem Sie sie 10 Mal auf und ab pipettieren und die Zellen weitere fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Eine Suspension von kleinen Clustern sollte vorhanden sein. Fügen Sie dann 20 Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 300 Mal. G, aspirieren Sie das PBS sorgfältig und wenn induzierte Sino-Vorhofkörper oder Sabs erzeugt werden, verwenden Sie 12 Milliliter Differenzierungsmedium, das 400 Mikrogramm pro Milliliter G vier 18 enthält, um Resus zu verwenden, suspendieren Sie die Zellen und sehen Sie jeweils zwei Milliliter auf sechs Vertiefungen einer mit Gelatine beschichteten 24-Well-Platte, um einzelne Knotenzellen zu erzeugen, anstatt Differenzierungsmedium hinzuzufügen.

Nach dem Entfernen des PBS verwenden Sie fünf Milliliter Accutane, um die Zellen zu suspendieren und fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Pipettieren Sie auf und ab zu kräftig. Mischen Sie die Suspension nach der Inkubation bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.

Fügen Sie 20 Milliliter PBS hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 300 mal G mit 12 Millilitern Differenzierung. Medium, das G vier 18 enthält. Suspendieren Sie die Zellen und geben Sie jeweils zwei Milliliter in sechs Vertiefungen einer mit Gelatine beschichteten 24-Well-Plattenkultur und führen Sie die Analyse der Zellen gemäß dem Textprotokoll durch.

Unter Verwendung des in diesem Video demonstrierten Protokolls kann isab S aus pluripotenten Stammzellen mit einer Schlagfrequenz von etwa 450 Schlägen pro Minute erzeugt werden, wie hier nach der Dissoziation von isab S zu sehen. Die beobachteten Einzelzellen zeigen die typischen Formen von Zellen des Sinusknotens, zu dem auch Spindel- und Spinnenzellen gehören. Diese Zellen weisen hohe Expressionsniveaus von Proteinen auf, die für die Funktion des Sinusknotens essentiell sind, wie z.B. Hyperpolarisationsaktiviertes zyklisches Nukleotid-gesteuertes Kationen. Kanal vier, HCN vier, Conexion vier, fünf Conexion 30.2 und MYH sechs.

Bei Behandlung mit dem Kanalblocker ZD 7 2 88 oder dem Muskarinrezeptor-Agonisten Caracol weisen die aus dem ISAB stammenden Zellen eine signifikant reduzierte Schlagfrequenz auf. Der Beta-Nebennierenrezeptor-Agonist Isopren hingegen führt zu einer erhöhten Schlagfrequenz. Insgesamt wird unsere Technik den Weg zu einem besseren Verständnis der Funktionsweise und Erkrankungen von Herzschrittmachern ebnen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie voll funktionsfähige Sinusknotenzellen aus PLU-potenten Stammzellen generieren können.