Prüfung von Rapid Dopamine Dynamics mit Fast Scan Cyclovoltammetrie Während Intraorale Geschmacksträger in Verwaltung Awake Rats

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Dopaminantworten im Subsekundenbereich auf orale Geschmacksreize zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst orale Katheter, Referenzelektroden und Kohlenstofffaserelektroden hergestellt werden, die für die chirurgischen Eingriffe und die anschließende Aufzeichnung mittels schneller zyklischer Voltammetrie-Telemetrie benötigt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die oralen Katheter, die intrakranielle Elektrode und die Führungskanüle für die Kohlenstofffaserelektrode chirurgisch zu implantieren.

Eine Woche später kann die Kohlenstofffaser-Mikroelektrode in den Nucleus accumbens abgesenkt werden, um Änderungen der extrazellulären Dopaminausschüttung als Reaktion auf die intraorale Applikation von Geschmäcken aufzuzeichnen. Der letzte Schritt nach der Aufzeichnung besteht darin, die Elektrode zu kalibrieren und eine Hauptkomponentenanalyse durchzuführen, um Daten zu isolieren, die Informationen über Dopamin enthalten. Letztendlich wird die kombinierte Anwendung der intraoralen Geschmacksapplikation und der schnellen zyklischen Voltammetrie verwendet, um Veränderungen der Dopaminantworten im Subsekundenbereich auf Geschmäcker darzustellen.

Es gibt zwei wesentliche Vorteile dieser kombinierten Technik gegenüber bestehenden Methoden. Erstens verfügt die schnelle IC-Photometrie über eine hohe zeitliche Auflösung, und zweitens minimiert die intraorale Applikation von Taten die Bewegungen, die die Ratte zur Aufnahme des Tatin ausführen muss, wodurch wir Dopaminantworten auf das Tatin besser isolieren können. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten bei der Herstellung des oralen Katheters.

Die Herstellung eines guten und bezahlten oralen Katheters gewährleistet jedoch einen festen Sitz des Katheters zwischen Wange und oberen Molaren und erhöht die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Experiments. Um die Ableitelektrode vorzubereiten, saugen Sie zunächst eine sieben Mikrometer durchmessende T650-Kohlenstofffaser in eine Borosilikatglas-Kapillare mit einem Innendurchmesser von 0,4 Millimetern. Positionieren Sie danach die Kapillare in einer vertikalen Elektrodenziehvorrichtung, ziehen Sie zunächst mit einem auf 55,0 eingestellten Heizelement und ausgeschaltetem Magnet, und passen Sie anschließend nach Bedarf an.

Nachdem die Pipette unter dem Mikroskop gezogen wurde, schneiden Sie die freiliegende Kohlenstofffaser so zurecht, dass sie 75 bis 100 Mikrometer über das Glas hinausragt. Die Faser im Glas muss fest versiegelt sein, andernfalls verwerfen Sie die Präparation. Danach entfernen Sie die Isolierung von der Hälfte eines drei Zoll langen Drahtes mit der Drahtrahmenstärke 30, und ziehen Sie einen Schrumpfschlauch auf, um die Elektrode am Mikromanipulator zu befestigen.

Tragen Sie dann eine dünne Schicht Silberlack auf den Draht auf, während der Lack noch feucht ist. Führen Sie den Draht in das offene Ende der Elektrode ein und verbinden Sie ihn mit der darin befindlichen Kohlenstofffaser. Überprüfen Sie diesen Kontakt unter dem Mikroskop.

Nehmen Sie die Elektrode im Mikromanipulator und sichern Sie sie mit Schrumpfschlauch. Stellen Sie die vorbereitete Kohlenstofffaserelektrode mindestens 10 Minuten lang in IPA, um die Elektrodenoberfläche zu reinigen und die anschließende Empfindlichkeit gegenüber Dopamin zu erhöhen. Nach dem Entfernen der Elektrode aus IPA spülen Sie die Kohlenstofffaser mit Leitungswasser, um das IPA zu entfernen.

Bereiten Sie als Nächstes die Referenzelektrode aus einem 13 Millimeter langen Silberdraht mit einem sechs Millimeter langen Silber-Silberchlorid-Mesh mit einem Durchmesser von 0,4 Millimeter vor, schneiden Sie den nicht maschigen Teil des Drahts ab und löten Sie ihn an einen Goldpin. Tragen Sie anschließend Epoxidharz auf die Lötstelle auf. Tauchen Sie danach den maschigen Teil fünfmal in eine Copolymer-Säure ein.

Lassen Sie es nach dem letzten Eintauchen zwischen den Eintauchvorgängen 30 Minuten an der Luft trocknen. Lassen Sie es über Nacht an der Luft trocknen. Am nächsten Tag.

Backen Sie den Maschenteil des Drahtes eine Stunde lang bei 120 Grad Celsius. Um den oralen Katheter herzustellen, schneiden Sie zuerst Polyethylen-100-Schlauch in sechs Zentimeter lange Segmente.

Dann an einem der Schlauchabschnitte eine kleine, flache Scheibe erzeugen, indem das Ende geschmolzen und in der Mitte der Scheibe auf eine flache, kühle Oberfläche gedrückt wird. Mit einer 18-Gauge-Nadel ein Loch erzeugen. Das andere Ende des Schlauchstücks an das stumpfe Ende einer 18-Gauge-Nadel anschließen.

Dann mit einem Locher mehrere Scheiben aus Polytetrafluorethylen mit einem Durchmesser von sechs Millimetern und einer Dicke von 3,18 Millimetern herstellen. Anschließend in der Mitte dieser Scheiben ein Loch erzeugen, wodurch die Scheiben zu Unterlegscheiben werden. Die Unterlegscheibe in eine trapezförmige Form schneiden, um deren Fixierung während der Molarenimplantation zu erleichtern.

Um den Katheter zu vervollständigen, schieben Sie eine mit PE-Schlauch verbundene Nadel vollständig durch die Unterlegscheibe und schieben Sie die Unterlegscheibe bündig an den Schlauch heran. Das folgende Protokoll dauert etwa 75 Minuten zur Durchführung. Beginnen Sie mit einer für die Operation vorbereiteten Ratte und öffnen Sie deren Maul mit einem Wattestäbchen.

Dann führen Sie die Nadel einer Kanüle in das Gewebe zwischen der Wange und dem ersten oberen Molaren ein, sodass die Nadel knapp hinter und medial zu den Ohren austritt. Bewegen Sie anschließend die Kanüle nach oben und befestigen Sie eine Unterlegscheibe an den Molaren, um den Katheter auf der freiliegenden Nadel zu stabilisieren. Schieben Sie eine Unterlegscheibe auf und ziehen Sie sie fest an die Inzision heran.

Befestigen Sie diese Unterlegscheibe in Position. Schneiden Sie den Schlauch so zurecht, dass zwei bis vier Zentimeter über dem Kopf der Ratte herausragen. Bringen Sie dann mit derselben Technik einen Katheter in die andere Seite des Mundes ein.

Danach wird die Ratte in einen stereotaktischen Halter eingespannt, und es werden drei Löcher für die Kanülen und Elektroden gebohrt, um Ableitungen an der Position des Nucleus-accumbens-Kerns vorzunehmen. Die Führungskanüle befindet sich 1,2 Millimeter anterior und 1,4 Millimeter lateral zum Foramen.

Senken Sie die Kanülenapparatur ab, bis die Kunststoffbasis bündig mit dem Schädel abschließt. Platzieren Sie die Referenzelektrode in der Hemisphäre, die der Leitkanüle gegenüberliegt. Senken Sie die Referenzelektrode etwa zwei Millimeter unter die Dura ab.

Danach platzieren Sie die Stimulations-Elektrode 5,2 Millimeter posterior und 1,0 Millimeter lateral zum Rema. Um das ventrale tegmentale Areal anzusteuern. Senken Sie die Stimulations-Elektrode 8,0 Millimeter unter die Dura ab.

Danach die Komponenten mit Schrauben und Zement befestigen und die postoperative Versorgung durchführen. Vor Durchführung eines Experiments immer die Durchgängigkeit der oralen Kanüle überprüfen, indem 200 Mikroliter Wasser infundiert werden, und beobachten, ob die Ratte das Wasser schmeckt; den Aufnahmestandort freiräumen, indem die Platzbosonde entfernt, zwei Tropfen 50 % Heparin hinzugefügt und sie dann vorsichtig neu positioniert wird. Die Platzbosonde darf sich nicht innerhalb von zwei Millimetern des Aufnahmestandorts befinden.

Befestigen und stabilisieren Sie nun die Head-Stage an dem im VTA implantierten Stimulator und senken Sie die Ableitelektrode in den Kern des Nucleus accumbens ab. Erstellen Sie anschließend gemäß dem Textprotokoll einen Trainingsdatensatz. Warten Sie stets mindestens zwei Minuten, jedoch bis zu vier bis fünf Minuten zwischen den Stimulationen, um eine vesikuläre Wiederaufladung zu ermöglichen, und müssen dies tun.

Der entscheidende Schritt im Experiment ist das Erhalten einer Elektrode hoher Qualität. Wenn der Hintergrund in der Anstiegsphase eine charakteristische abgerundete Form aufweist, handelt es sich um eine gute Elektrode. Wenn die abgerundete Form klein ist oder der angelegten Wellenform sehr ähnlich sieht, sollte eine andere Elektrode ausprobiert werden.

Wenn sich der Hintergrund an der richtigen Stelle verschoben hat, wenden Sie eine Offset-Verschiebung der angelegten Wellenform in positiver Richtung in Schritten von 0,1 Volt an. Sobald ein Trainingsdatensatz am Aufnahmeort generiert wurde, sammeln Sie Daten während der Infusion von 200 Mikroliter Bolusgaben von Taten alle ein bis drei Minuten über 25 Infusionen hinweg. Warten Sie danach mindestens 30 Minuten und infundieren Sie den nächsten Geschmack auf die gleiche Weise.

Mittels FSCV in Kombination mit der Implantation eines intraoralen Katheters wurde untersucht, wie Sucrose als AIT von Taten die phasische Dopaminfreisetzung im Kern des Nucleus accumbens vor der Infusion von Taten moduliert. Elektrische Stimulation, die durch den roten Balken im VTA angegeben ist, führte nach Abschluss des Trainingssatzes zu deutlichen Zunahmen der phasischen Dopaminfreisetzung im Kern des Nucleus accumbens. 6,5-Sekunden-Infusionen von 200 µL Sucrose, angegeben durch den roten Balken, bewirkten eine Erhöhung des Stroms, die durch den weißen Pfeil markiert ist. Dies geschah bei dem Oxidationspotential von Dopamin, das durch die weiße gestrichelte Linie angegeben ist, wodurch die Daten in eine Konzentrations-zu-Zeit-Darstellung umgewandelt wurden. Nachdem mittels PCA verifiziert wurde, dass der erhöhte Strom als Reaktion auf den Geschmack auf einer Zunahme der Dopaminkonzentration beruht.

Ein weiterer Tatin-Menthol-Infusion während FSCV-Aufnahmen im Kern des Nucleus accumbens wurde ebenfalls eine erhöhte Dopaminkonzentration beobachtet, nachdem Menthol infundiert worden war. Sobald die kombinierte intraorale und Kanülierungs-Chirurgie beherrscht ist, kann sie innerhalb von 75 Minuten durchgeführt werden. Diese Technik kann mit anderen Verhaltensformen wie kompetitiver und aversiver pavlov’scher sowie operanter Konditionierung kombiniert werden, um Fragen zur Dopaminsignalübertragung im Subsekundenbereich während dieser Prozesse zu beantworten.