Prüfung von Rapid Dopamine Dynamics mit Fast Scan Cyclovoltammetrie Während Intraorale Geschmacksträger in Verwaltung Awake Rats

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dopaminreaktionen im Untersekunde auf den oralen Geschmack zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Mundkatheter, Referenzelektroden und Kohlefaserelektroden erstellt werden, die für die chirurgischen Eingriffe benötigt werden, und anschließend über zyklische V-Telemetrie mit schnellem Scan aufgezeichnet wird. Im zweiten Schritt werden die Mundkatheter, die Hirnelektrode und die Führungskanüle für die Kohlefaserelektrode operativ

Eine Woche später kann die Kohlefaser-Mikroelektrode in den Nucleus accumbens abgesenkt werden, um Veränderungen der extrazellulären Dopaminfreisetzung als Reaktion auf die intraorale Abgabe von Geschmäckern aufzuzeichnen. Der letzte Schritt nach der Aufzeichnung besteht darin, die Elektrode zu kalibrieren und die Hauptkomponentenanalyse zu verwenden, um Daten zu isolieren, die Informationen über Dopamin enthalten. Letztendlich wird die kombinierte Verwendung von intraoralem Geschmack und Verabreichung und zyklischer Fast-Scan-Vol-Telemetrie verwendet, um Veränderungen in den Dopaminreaktionen von unter einer Sekunde auf Taten zu zeigen.

Es gibt zwei Hauptvorteile dieser kombinierten Technik gegenüber bestehenden Methoden. Erstens hat die schnelle IC-Photometrie eine hohe zeitliche Auflösung und zweitens minimiert die intraorale Verabreichung von Tatin die Bewegung, die die Ratte ausführen muss, um das Tatin zu erhalten, und ermöglicht es uns, Dopaminreaktionen auf das Tatin besser zu isolieren. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit der Herstellung des Mundkatheters.

Die Konstruktion eines guten und kostenpflichtigen Mundkatheters gewährleistet jedoch einen festen Sitz des Katheters zwischen der Wange und den oberen Backenzähnen und erhöht die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Experiments. Zur Vorbereitung der Aufzeichnungselektrode aspiriert man zunächst eine Kohlefaser T six 50 mit einem Durchmesser von sieben Mikrometern in eine Bora-Silikatglas-Kapillare mit einem Innendurchmesser von 0,4 Millimetern. Positionieren Sie anschließend die Kapillare in einer vertikalen Elektrode, ziehen Sie zunächst mit einer auf 55,0 eingestellten Heizung und ausgeschaltetem Magneten und stellen Sie sie dann nach Bedarf ein.

Nachdem Sie die Pipette unter ein Mikroskop gezogen haben, schneiden Sie die freiliegende Kohlefaser so ab, dass sie 75 bis 100 Mikrometer über das Glas hinausragt. Die Faser im Glas muss dicht verschlossen sein, sonst entsorgen Sie das Präparat. Entfernen Sie als Nächstes die Isolierung von der Hälfte eines drei Zoll großen 30-Gauge-Drahtes und tragen Sie einen Schrumpfschlauch auf, um die Elektrode am Mikromanipulator zu befestigen.

Trage dann eine dünne Schicht silberne Farbe auf den Draht auf, während die Farbe noch nass ist. Führen Sie den Draht in das offene Ende der Elektrode ein und befestigen Sie ihn an der Kohlefaser darin. Überprüfen Sie diesen Kontakt unter dem Mikroskop.

Nehmen Sie die Elektrode in den Mikromanipulator und sichern Sie sie mit Schrumpfschlauch. Legen Sie die vorbereitete Kohlefaserelektrode für mindestens 10 Minuten in IPA, um die Elektrodenoberfläche zu reinigen und die anschließende Empfindlichkeit gegenüber Dopamin zu erhöhen. Nachdem Sie die Elektrode aus dem IPA entfernt haben, spülen Sie die Kohlefaser mit Leitungswasser ab, um das IPA zu entfernen.

Bereiten Sie als nächstes die Referenzelektrode aus einem 13 Millimeter Silberdraht mit einem sechs Millimeter Silberchlorid-Netz mit einem Durchmesser von 0,4 Millimetern vor, schneiden Sie den unvermaschten Teil des Drahtes ab und löten Sie ihn an einen Goldstift. Tragen Sie dann Epoxidharz auf das Lot auf. Tauchen Sie dann den Netzteil fünfmal in eine Copolymersäure.

Lassen Sie es nach dem letzten Tauchgang zwischen den Tauchgängen 30 Minuten an der Luft trocknen. Lassen Sie es über Nacht an der Luft trocknen. Am nächsten Tag.

Den Maschenteil des Drahtes bei 120 Grad Celsius eine Stunde lang backen. Um den Mundkatheter zuerst zu schneiden. Schlauch aus Polyethylen 100 in sechs Zentimeter-Segmente.

Mache dann an einem der Rohrsegmente eine kleine flache Scheibe, indem du das Ende schmilzt und auf eine flache, kühle Oberfläche in der Mitte der Scheibe drückst. Verwende eine 18-Gauge-Nadel, um ein Loch zu erzeugen. Befestigen Sie das andere Ende des Rohrsegments am stumpfen Ende einer 18-Gauge-Nadel.

Dann werden mit einem Locher mehrere sechs Millimeter große und 3,18 Millimeter dicke Stücke aus Polytetrafluorethylen hergestellt. Erstellen Sie dann in der Mitte dieser Scheiben ein Loch, wodurch die Scheiben zu Unterlegscheiben werden. Schneiden Sie die Unterlegscheibe in eine trapezförmige Form, um sie während der Backenzahnimplantation zu verankern.

Um den Katheter zu vervollständigen, schieben Sie eine Nadel, die an den PE-Schlauch befestigt ist, vollständig durch die Unterlegscheibe und schieben Sie die Unterlegscheibe bündig auf den Schlauch. Das Ausfüllen des folgenden Protokolls dauert ca. 75 Minuten. Beginnen Sie mit einer Ratte, die für die Operation vorbereitet ist, und öffnen Sie ihr Maul mit einem Wattestäbchen.

Schieben Sie dann die Nadel auf einer Kanüle in das Gewebe zwischen der Wange und dem ersten oberen Backenzahn, so dass die Nadel direkt hinter und medial zu den Ohren austritt. Schieben Sie dann die Kanüle nach oben und befestigen Sie die Unterlegscheibe an den Backenzähnen, um den Katheter auf der freiliegenden Nadel zu fixieren. Schieben Sie eine Unterlegscheibe auf und bringen Sie sie fest an den Einschnitt.

Befestigen Sie diese Unterlegscheibe. Schneiden Sie den Schlauch so ab, dass zwei bis vier Zentimeter über dem Kopf der Ratte freiliegen. Führen Sie dann mit der gleichen Technik einen Katheter in die andere Seite des Mundes ein.

Anschließend setzen Sie die Ratte in einen stereotaktischen Rahmen und bohren drei Löcher für die Kanülen und Elektroden, um Aufzeichnungen in der Kernposition des Nucleus accumbens zu machen. Die Führungskanüle 1,2 Millimeter anterior und 1,4 Millimeter. Laterales Torema.

Senken Sie den Kanülenapparat ab, bis die Kunststoffbasis bündig mit dem Schädel abschließt. Setzen Sie die Referenzelektrode kontralateral zur Führungskanüle in die Halbkugel ein. Senken Sie die Referenz etwa zwei Millimeter unter die Dura ab.

Positionieren Sie dann die Stimulationselektrode 5,2 Millimeter posterior und 1,0 Millimeter laterales Torema. Zur gezielten Behandlung des ventralen tegmentalen Bereichs. Senken Sie die Stimulationselektrode 8,0 Millimeter unter Dura ab.

Anschließend werden die Bauteile mit Schrauben und Zement gesichert und postoperativ versorgt. Überprüfen Sie vor der Durchführung eines Experiments immer die Durchgängigkeit der Mundkanüle, indem Sie 200 Mikroliter Wasser infundieren, und beobachten Sie, ob die Ratte das Wasser schmeckt. Reinigen Sie die Aufnahmestelle, indem Sie die Dummy-Kanüle entfernen, zwei Tropfen 50%iges Heparin hinzufügen und dann vorsichtig neu positionieren. Der Dummy darf sich nicht innerhalb von zwei Millimetern von der Aufnahmestelle befinden.

Befestigen und stabilisieren Sie nun den Kopftisch an den in den VTA implantierten Stimulator und senken Sie dann die Aufzeichnungselektrode in den Kern des Nucleus accumbens ab. Befolgen Sie nun das Textprotokoll und erstellen Sie ein Trainingsdataset. Warten Sie immer mindestens zwei Minuten, aber bis zu vier bis fünf Minuten zwischen den Stimulationen, um ein vesikuläres Nachladen zu ermöglichen und müssen.

Der wichtigste Schritt im Experiment ist die Gewinnung einer qualitativ hochwertigen Elektrode. Wenn der Hintergrund eine charakteristische abgerundete Form auf der aufsteigenden Phase ist, ist eine gute Elektrode. Wenn die abgerundete Form klein ist oder der angewendeten Wellenform sehr nahe kommt, versuchen Sie es mit einer anderen Elektrode.

Wenn sich der Hintergrund genau an der Stelle befindet, an der er verschoben wurde, wenden Sie eine Offset-Verschiebung auf die angewendete Wellenform in positiven Richtungen in Schritten von 0,1 Volt an. Sobald ein Trainingssatz am Aufzeichnungsort generiert wurde, sammeln Sie Daten, während Sie alle ein bis drei Minuten 25 Infusionen mit 200 Mikrolitern Taten-Boli infundieren. Warten Sie dann mindestens 30 Minuten und ziehen Sie den nächsten Geschmack auf die gleiche Weise auf.

FSCV in Kombination mit einer intraoralen Katheterimplantation wurde verwendet, um zu untersuchen, wie Saccharose und eine erhöhte AIT von Taten die phasische Dopaminfreisetzung im Kern des Nucleus accumbens vor der Infusion modulieren. Die elektrische Stimulation, die durch den roten Balken des VTA angezeigt wurde, führte zu einem robusten Anstieg der phasischen Dopaminfreisetzung im Kern des Nucleus accumbens, nachdem das Trainingsset erworben wurde. 6,5 Sekunden Infusionen von 200 Mikrolitern Saccharose, die durch den roten Balken angezeigt wurden. Strom, der durch den weißen Pfeil angezeigt wird. Dies geschah am Oxidationspotential von Dopamin, das durch die weiße Strichlinie angezeigt wird, wodurch die Daten in ein Konzentrations-Zeit-Diagramm umgewandelt wurden. Nachdem PCA überprüft hat, dass der erhöhte Strom als Reaktion auf den Geschmack das Ergebnis eines Anstiegs der Dopaminkonzentration ist.

Ein weiteres Tatin-Menthol wurde während der FSCV-Messungen in den Kern des Nucleus accumbens infundiert. Eine erhöhte Dopaminkonzentration wurde auch nach der Infusion von Menthol beobachtet. Einmal gemeistert, kann die kombinierte intraorale und Kanülenoperation in 75 Minuten durchgeführt werden. Diese Technik kann mit anderen Verhaltensweisen kombiniert werden, wie z.B. einer kompetitiven und aversiven Pawlowschen und Opernkonditionierung, um Fragen zur Dopamin-Signalgebung im Untersekundenbereich während dieser Prozesse zu beantworten.