Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zelluläre Interaktionen zwischen Lungenkrebszellen und krebsassoziierten Fibroblasten in einer dreidimensionalen Co-Kulturmethode zu untersuchen. Dies wird durch die Primärkultur von humanen Lungenkrebs-assoziierten Fibroblasten aus gesammeltem Lungengewebe erreicht, das in ein Millimeter große Stücke zerkleinert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Kollagengele herzustellen, die in Fibroblasten eingebettet sind, indem eine Kollagenlösung mit den Trypsin-Augenzellen gemischt und auf eine Sechs-Well-Platte übertragen wird, um sie zu verleistern.

Als nächstes werden Lungenadenokarzinomzellen auf die Oberfläche jedes Gels plattiert, um eine dimensionale Co-Kultur von Krebszellen und Fibroblasten vorzubereiten, und das Gel wird vom Rand der Vertiefung getrennt, um eine schwimmende Kultur zu erzeugen. Der letzte Schritt besteht darin, die Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkultur und den Invasionsassay durchzuführen, indem die kontrahierten Gele an der Luft ausgesetzt werden, indem sie auf ein Netz in einer Sechs-Well-Platte gelegt werden. Letztendlich werden histologische Untersuchungen verwendet, um die Invasion von Krebszellen und morphologische Veränderungen zu beurteilen.

Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden wie der zweidimensionalen Monolayer-Kultur besteht darin, dass multizelluläre Wechselwirkungen in dreidimensionalen Zustandskulturen untersucht werden können. Dieses Verfahren beginnt mit der Primärkultur von Fibroblasten aus gesammeltem Lungengewebe, wie im Textprotokoll beschrieben und referenziert. In diesem Video wird die Lungen von Mäusen anstelle von menschlichem Lungenkrebsgewebe verwendet.

Legen Sie die Lungengewebeprobe auf eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale ohne Nährmedium. Schneiden Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette und einem Skalpell in kleine Abschnitte von etwa einem Millimeter Größe Während dieses Prozesses vermeiden Sie es, den Schnitt trocken zu machen, da sonst die Effizienz des Zellwachstums beeinträchtigt wird. Platzieren Sie kleine Lungengewebeabschnitte auseinander, um einen leeren Bereich um jedes Stück herum zu erhalten.

Machen Sie mit einer Skalpellklinge Kratzer auf der Oberfläche der Gewebekulturschale. Alternativ erhöht die Abdeckung von Gewebestücken die Wirksamkeit des Zellwachstums und der Zellvermehrung nach mehreren Passagen. Geben Sie zuerst Silikonfett an zwei Stellen im Abstand von 1,5 Zentimetern in jede Vertiefung

Legen Sie dann die gehackten Taschentuchstücke einzeln in die Mitte. Nun, dann befestigen Sie den Deckglas mit Silikonfett an der Oberfläche der Platte. Geben Sie vorsichtig Nährmedium in die Schale oder eine Sechs-Well-Platte, bevor die Gewebeschnitte austrocknen.

Das effiziente Zellwachstum geht größtenteils verloren. Wenn die Proben austrocknen, gießen Sie das Medium nicht zu schnell, um ein Ablösen der Gewebeschnitte für die Kollagengelbildung zu vermeiden. Waschen Sie die Fibroblasten mit einer x phosphatgepufferten Kochsalzlösung oder PBS und fügen Sie Tryin One hinzu, um die herauswachsenden Zellen nach der Trypsinisierung für etwa fünf Minuten zu lösen.

Bei 37 Grad Celsius lösen Sie die Zellen mit neun Millilitern DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, sammeln Sie die im Medium suspendierten Zellen in einem 10-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 200 bis 300 Mal G, um Zellpellets zu bilden. Wiederbelebung. Suspendieren Sie die resultierenden Pellets in 100 % FBS bei einer Dichte von einer halben Million Zellen pro Milliliter. Kühlen Sie die Reagenzien, Pipetten und Röhrchen für die Kollagengelvorbereitung vor der Kollagengelzubereitung im Kühlschrank ab.

Bereiten Sie als Nächstes das Kollagengel vor, indem Sie die Fibroblastensuspension in FBS Typ eins, A-Kollagen, fünf X-D-M-E-M mischen und den Rekonstitutionspuffer kräftig pipettieren, um eine homogene Mischung zu gewährleisten und die Bildung von Blasen während des Pipettiervorgangs zu vermeiden. Geben Sie dann drei Milliliter der Mischung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte und lassen Sie sie im Inkubator bei 37 Grad Celsius ungestört 30 bis 60 Minuten lang für die Krebszellkultur auf dem Kollagengel Resus gelatinieren. Suspendieren Sie die Krebszellen im 3D-Co-Kulturmedium bei einer Dichte von eins mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter.

Arme zwei Milliliter der resuspendierten, A 5 49 Lungen-Adenokarzinom-Zelllösung auf die Oberfläche jedes Gels. Modifizieren Sie die Zellzahl von Krebszellen oder Fibroblasten in Co-Kultur in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen, um eine Gelkontraktion durchzuführen. Inkubieren Sie die Gele über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit die Krebszellen an dem Kollagengel haften können.

Trennen Sie dann jede Vertiefung und erzeugen Sie in jeder Vertiefung eine schwimmende Kultur. Von den sechs Vertiefungen wird eine Platte mit einer abgewinkelten 21-Gauge-Nadel oder einem kleinen Spatel verwendet, um jedes Gel alle zwei bis drei Tage vom Rand der Vertiefung zu trennen. Frischen Sie die Vertiefungen mit zwei Millilitern 3D-Co-Kulturmedium auf.

Messen Sie die Größe jedes Gels fünf Tage lang jeden Tag. Sehen Sie sich schließlich das Textprotokoll für die Kollagengel-Analyse an. Nach der Kultivierung der Kollagen-Gele fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius.

Setzen Sie die zusammengezogenen Gele der Luft aus, indem Sie sie auf ein Netz legen. In neuen sechs Well-Platten wird das Netz aus kommerziell erhältlichen Zellsieben hergestellt, die für die Durchflusszytometrie verwendet werden. Füllen Sie jede Vertiefung vorsichtig mit 11 Millilitern 3D-Co-Kultur. Mittel.

Positionieren Sie die Gele mit einem sterilen Löffel auf dem Netz und entfernen Sie in diesem Zustand das restliche Medium von den Gelen. Die Gele werden in das Medium getaucht, während die Oberseite des Gels der Luft ausgesetzt ist. Definieren Sie diese Kulturbedingung als Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche.

Diese Co-Kultur-Methode, die die Mikroumgebung des Tumors nachahmt, ist ein nützliches Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Fibroblasten zu untersuchen, die in Kollagengele eingebettet sind. A 5 49 Zellen wurden auf einem Kollagengel co-kultiviert, das in die Fibroblasten eingebettet war, und die Schicht von 5 49 Zellen wurde an der Luft ausgesetzt, indem das Gel auf ein Netz im Medium aufgebracht wurde. Hier ist ein repräsentatives Bild des Gels zu sehen, das in einer Vertiefung einer Sechs-Well-Platte auf dem Netz platziert ist, histologische Analysen mit Hämat, Toin und Eoin.

Die Färbung von Querschnitten eines dreidimensional kultivierten Gels zeigte die Invasion von 5 bis 49 Zellen in das Kollagengel, das mit Lungenkrebs-assoziierten Fibroblasten eingebettet war. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Genexpression oder Knockdown durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die spezifische Genfunktion bei der Tumorsturminteraktion zu beantworten.