Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zellulären Wechselwirkungen zwischen Lungenkrebszellen und krebsassoziierten Fibroblasten mittels einer dreidimensionalen Kokultur-Methode zu untersuchen. Dies wird erreicht durch die Primärkultur humaner, mit Lungenkrebs assoziierter Fibroblasten aus gesammeltem Lungen­gewebe, das in etwa ein Millimeter große Stücke zerkleinert wird. Der zweite Schritt besteht darin, Kollagengele herzustellen, die mit Fibroblasten eingebettet sind, indem eine Kollagenlösung unter Verwendung der Trypsin-Augen-Zellen gemischt und anschließend in eine sechswellige Platte überführt wird, um zu gelieren.

Anschließend werden Lungenadenokarzinomzellen auf die Oberfläche jedes Gels aufgebracht, um eine dreidimensionale Ko-Kultur aus Krebszellen und Fibroblasten vorzubereiten, und das Gel wird vom Rand des Wells getrennt, um eine schwimmende Kultur zu erzeugen. Im letzten Schritt erfolgt die Luft-Flüssig-Grenzflächen-Kultur und Invasionstest, indem die kontrahierten Gele durch Platzieren auf einem Netz in einer Sechs-Loch-Platte der Luft ausgesetzt werden. Abschließend werden histologische Untersuchungen zur Bewertung der Invasion der Krebszellen und morphologischer Veränderungen herangezogen.

Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden wie der zweidimensionalen Monoschichtkultur besteht darin, dass multizelluläre Wechselwirkungen in einer dreidimensionalen Kulturbedingung untersucht werden können. Dieses Verfahren beginnt mit der Primärkultur von Fibroblasten aus gesammeltem Lungengewebe, wie im Textprotokoll beschrieben und referenziert. In diesem Video werden statt menschlichem Lungenkrebsgewebe Mauslungen verwendet.

Legen Sie die Lungengewebeprobe auf eine 10 cm große Gewebekulturschale ohne Kulturmedium. Schneiden Sie das Gewebe mit sterilen Pinzetten und einem Skalpell in kleine Stücke von etwa einem Millimeter Größe. Vermeiden Sie während dieses Vorgangs, dass das Gewebestück austrocknet, da sonst die Effizienz des Zellauswuchses beeinträchtigt wird. Platzieren Sie die kleinen Lungengewebestücke mit Abstand zueinander, um einen freien Bereich um jedes Stück herum zu gewährleisten.

Erzeugen Sie Kratzer auf der Oberfläche der Zellkulturschale mit einer Rasierklinge. Alternativ verbessert die Abdeckung von Gewebestücken die Wirksamkeit des Zellauswuchses und der Zellvermehrung nach mehreren Passagen. Bringen Sie zunächst Silikonfett an zwei Punkten im Abstand von 1,5 Zentimeter in jedem Well an.

Als Nächstes einzelne zerkleinerte Gewebestücke in die Mitte jedes Wells geben. Dann die Deckgläser mit Silikonfett an der Oberfläche der Platte befestigen. Vorsichtig Kulturmedium in die Schale oder die 6-Well-Platte geben, bevor die Gewebeschnitte austrocknen.

Ein effizientes Zellauswachsen geht größtenteils verloren. Wenn die Proben austrocknen, das Medium nicht zu schnell hinzufügen, um eine Ablösung der Gewebeschnitte während der Kollagen-Gel-Bildung zu vermeiden. Die Fibroblasten mit einer x Phosphat-gepufferter Salzlösung oder PBS waschen und Trypin hinzufügen, um die auswachsenden Zellen nach einer Trypsinisierung von etwa fünf Minuten abzulösen.

Bei 37 Grad Celsius lösen Sie die Zellen mit neun Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, ab, sammeln Sie die in dem Medium suspendierten Zellen in einem 10-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 200 bis 300 × g, um Zellpellets zu bilden. Resuspendieren Sie die resultierenden Pellets in 100 % FBS bei einer Dichte von einer halben Million Zellen pro Milliliter. Kühlen Sie die Reagenzien, Pipetten und Röhrchen für die Kollagen-Gel-Herstellung vor der Kollagen-Gel-Präparation im Kühlschrank ab.

Bereiten Sie als Nächstes das Kollagen-Gel vor, indem Sie die Fibroblastensuspension in FBS Typ I A Kollagen fünf X-D-M-E-M und Rekonstitutionspuffer kräftig pipettieren, um eine homogene Mischung zu gewährleisten, wobei während des Pipettierens die Bildung von Blasen vermieden werden sollte. Geben Sie anschließend drei Milliliter der Mischung in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte und lassen Sie die Mischung zur Gelierung ungestört im Inkubator bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten stehen, um anschließend Krebszellen auf dem Kollagen-Gel zu kultivieren. Suspendieren Sie die Krebszellen in dem 3D-Kokulturbedingungsmedium mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Milliliter.

Geben Sie zwei Milliliter der resuspendierten A549-Lungenadenokarzinomzelllösung auf die Oberfläche jedes Gels. Passen Sie die Zellanzahl von Krebszellen oder Fibroblasten in der Kokultur je nach experimentellen Bedingungen an, um die Gelkontraktion durchzuführen. Inkubieren Sie die Gele über Nacht bei 37 Grad Celsius, damit die Krebszellen an das Kollagengel adhärieren können.

Anschließend jedes Exemplar ablösen und eine schwimmende Kultur in jedem Wells erzeugen. In der sechs-well-Platte mit einer schräg stehenden Nadel der Stärke 21 oder einem kleinen Spatel jedes Gel alle zwei bis drei Tage vom Rand des Wells lösen. Die Wells mit zwei Milliliter 3D-Ko-Kulturmedium erneuern.

Messen Sie die Größe jedes Gels täglich über fünf Tage hinweg. Schlagen Sie abschließend den Textprotokoll zur Kollagen-Gel-Analyse nach. Nachdem die Kollagengele fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius kultiviert wurden.

Setzen Sie die kontrahierten Gele durch Platzierung auf einem Netz der Luft aus. Verwenden Sie in neuen 6-Well-Platten das Netz aus handelsüblichen Zellfiltern, die für die Durchflusszytometrie verwendet werden. Füllen Sie jedes Well vorsichtig mit 11 Millilitern 3D-Kokulturmedium.

Platzieren Sie die Gele mit einem sterilen Löffel auf dem Netz und entfernen Sie jegliches verbleibendes Medium von den Gele unter dieser Bedingung. Die Gele sind in das Medium eingetaucht, während die obere Oberfläche des Gels der Luft ausgesetzt ist. Definieren Sie diese Kulturbedingung als Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche.

Diese Ko-Kultur-Methode, die das Tumormikromilieu nachahmt, ist ein nützliches Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und in Kollagengelen eingebetteten Fibroblasten zu untersuchen. Eine 5 49 Zelllinie wurde gemeinsam auf einem Kollagengel kultiviert, das mit Fibroblasten versetzt war, und die Schicht der 5 49 Zellen wurde der Luft ausgesetzt, indem das Gel in einem Medium auf ein Netz gesetzt wurde. Hier ist eine repräsentative Abbildung des Gels, das auf dem Netz in einer Vertiefung einer sechswelligen Platte zur histologischen Analyse mit Hämatoxylin und Eosin dargestellt ist.

Die Färbung von Querschnitten eines dreidimensional kultivierten Gels zeigte das Eindringen von 5 49-Zellen in das mit lungentumormarkierten Fibroblasten eingebettete Kollagengel. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Genexpression oder Gen-Knockdown durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der spezifischen Genfunktion bei der Tumor-Stroma-Interaktion zu beantworten.