Name: Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Erfahren Sie die Isolation und Kultur primärer dopaminerger Neuronen aus dem ventralen Mittelhirn embryonaler Nagetiere. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neurodegenerativer Mechanismen bei Parkinson.

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Diese Arbeit wurde mit den Startkapitalern der Abteilung für Neurowissenschaften, Department of Medicine, Imperial College London an K.N.A. durchgeführt.

HINWEIS: Die Tiere wurden durch die Imperial Colleges und Tierschutz beibehalten und in Übereinstimmung behandelt mit den institutionellen Richtlinien und alle Tier Verfahren genehmigt und ethische Überprüfung zuständige Gremium (AWERB) und das Innenministerium und der Harvard University Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) in Übereinstimmung mit Bundes- und Landesvorschriften. 1. Reagenzien und Geräte-Setup <ol><li> Thaw, aliquoten und speichern 1 mg / ml Laminin-Lösung bei -80 ° C. Löse 2 ul in 1 ml DMEM / F12, was in einer Beschichtungskonzentration von 1-2 &amp; mgr; g / cm 2. HINWEIS: Thaw Laminin langsam auf Eis und lösen sich in kaltem DMEM / F12 und unmittelbar darauf an den Platten / Deck hinzuzufügen. </li><li> Verdünnen Sie 75 ml 0,01% Poly-L-Ornithin in 425 ml PBS und bei 4 ° C. HINWEIS: Die Haltbarkeit der Arbeitslösung bis zu einem Monat. </li><li> Lösen Sie 25% (w / v) BSA in PBS, pH 7,4, und bei 4 ° C für bis zu eine year. </li><li> Bereiten Sie 50% FBS (in HBSS) Deaktivierung Medien. </li><li> Bereiten Komplettmedium durch Zugabe von 50 U / ml Penicillin und Streptomycin, 1x N2 Ergänzung, 5% (Vol / Vol) FBS, 0,36% D - (+) - Glucose (w / v), 0,25% BSA (w / v), um DMEM / F12 und bei 4 ° C. HINWEIS: Die Haltbarkeitsdauer beträgt bis zu 10 Tage. </li><li> Ort Deck in kochendem 70% (vol / vol) Ethanol für mindestens 30 min, um jegliche Spuren von Fett und Autoklaven entfernen. </li><li> Ort Deck in Platten mit 24 Vertiefungen und fügen 500 ul Poly-L-Ornithin-Lösung in jede Kammer. Inkubieren Sie 1 Stunde unter der Gewebekultur Haube bei RT und dann waschen 3 Mal mit 500 ul Wasser. Gib 500 ul Laminin-Lösung zu jeder Platte und Inkubation O / N in der befeuchteten Gewebekulturinkubator bei 37 ºC. HINWEIS: Wenn keine Waschschritte nach Laminin Behandlung notwendig, Waschen der Poly-L-Ornithin weniger als dreimal führt zum Tod der Zellen nach 24 h Kultivierung. </li><li> Polieren Sie die Spitzen der Glaspipetten über Erdgas oder Taschenlampe flahm. HINWEIS: Nach diesem Schritt wird der Durchmesser der Spitze sollte etwa die Hälfte seiner normalen Größe sein. </li><li> Schneiden Sie die Kappen von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, mit einem autoklavierten Scheren und Autoklaven. </li></ol> 2. Präparation der embryonalen ventralen Mittelhirn <ol><li> Narkotisieren timed-schwangeren (E12.5) Dämme durch CO 2 Inhalation und durch Genickbruch einschläfern. </li><li> Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und eine Bauchschnitt, bis die Gebärmutter Säcke alle ausgesetzt sind. Mit einer Pinzette schneiden die vaginale Befestigung und entfernen Gebärmutter. Legen Sie die Gebärmutter in eiskaltem HBSS, in einer 100 mm Petrischale. </li><li> Embryonen aus der Gebärmutter und Fruchtblase zu entfernen, mit einer Pinzette (Abbildung 1C). Platz Embryonen in frischem eiskaltem HBSS. HINWEIS: Das Rechteck in Figur 1D zeigt die Stelle von embryonalen ventralen Mittelhirn. </li><li> Legen Sie die Embryonen unter Dissektionsmikroskop (10-fache Vergrößerung) und sezieren die MittelhirnBogen, indem das Gehirn an der Landenge und Mittelhirn-Zwischenhirn Randbereich, mit dem bioscissor und Pinzette (1E, siehe 1A für Linien der Einschnitt Abbildung). </li><li> Nach dem Herausnehmen der gesamten Mittelhirn, einen Schnitt in der mediodorsal Mittelhirn (1F). </li><li> Hirnhaut entfernen, mit zwei Zangen (Abbildung 1H). HINWEIS: entscheidender Schritt: Dieser Schritt ist wichtig für eine optimale Ausbeute und neuronale Überleben. Da die Kulturbedingungen optimal für Gehirnzellen sind, die meisten der Zellen aus dem umgebenden Gewebe zu sterben nach der Plattierung und die apoptotische Signal dieses Gewebe kann die Integrität der Kulturen schädigen. </li><li> Glätten Sie das Mittelhirn Gewebe auf der Petrischale, die Schmetterlingsform beobachten und schneiden etwa die Hälfte eines jeden Flügels, mit einem sterilisierten Rasierklinge (Abbildung 1 H, I). HINWEIS: Figur 1J zeigt die isolierte ventralen Mittelhirn. </li><li> Übertragen Sie dieStück ventralen Mittelhirn in eiskaltes HBSS in einem 15 ml konischen Rohr und fahren Sie mit dem nächsten Embryo. Hinweis: Die Schritte 2,1-2,8 sollte nicht mehr als 1 Stunde. Halten Sie die Embryonen außerhalb dieses Zeitrahmens auf Eis sinkt die Lebensfähigkeit der Zellen deutlich. </li></ol> 3. Die Dissoziation von ventralen Mittelhirn-Zellen <ol><li> Übertragen Sie die Stücke von ventralen Mittelhirn unter einer Sterilbank. Entfernen Sie die HBSS und 1 ml vorgewärmten (37 ° C) 0,05% Trypsin-EDTA in das konische Röhrchen (Menge reicht für bis zu 12 Stück der ventralen Mittelhirn). Inkubieren des Gewebes bei 37 ° C für 5-10 min. </li><li> Entfernen Trypsin-EDTA unter der Haube und 1 ml Deaktivierung Medium (das Serum wird Trypsin deaktivieren) auf das Gewebe. </li><li> Entfernen Sie die Deaktivierung Medium und waschen Sie das Gewebe in 1 ml vollständigem Medium zweimal. HINWEIS: Vermeiden Entfernen aller das Medium von der Röhre und Pipettieren der Gewebe, Verwerfen der dissoziierten Zellen zu verhindern. </li><li> In 1 ml Vollmedium und tritUrat das Gewebe mit einer feuerpolierten Glaspipette. Bildung von Blasen zu vermeiden, und weiterhin Verreiben bis einzelne Zellsuspension erreicht wird. Hinweis: geht normalerweise 8-10 durch den verengten Spitze für vollständige Dissoziation erforderlich. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie das Medium. </li><li> Re-suspendieren des Pellets in 1 ml Komplettmedium durch langsames Auf- und Abpipettieren mit bis zu viermal. </li></ol> 4. Überzug ventralen Mittelhirn-Zellen <ol><li> Nimm 10 &amp; mgr; l der Zellsuspension mit 90 ul Trypan-Blau-Lösung und die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer. HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Zellen kann auf dieser Stufe auch überprüft werden. </li><li> Zeigen sterilisierten Mikrozentrifugenröhrchen Caps in 100 mm Petrischalen und übertragen Sie die Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Deckgläser, mit einer Pinzette, einer nach dem anderen auf der Oberseite der Caps. HINWEIS: Waschen Sie die Deckgläser und vermeiden Trocknen des Laminin, da dies dazu führen uneven Kulturen und Abnahme der Überlebensfähigkeit der Zellen. </li><li> Die Lautstärke auf 1.500 Zellen pro 1 &amp; mgr; l durch Zugabe von komplettem Medium und Zugabe von 100 &amp; mgr; l (insgesamt 150.000 Zellen) der Zellsuspension auf jedes Deckglas (das Volumen ist optimal, um die Oberfläche des Deckglases ohne Verschütten zu bedecken). Schließen die Petrischalen und inkubieren für 1 h in einem befeuchteten Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2). HINWEIS: kritischer Schritt: Dieser Schritt ist für die Verbesserung der Befestigung und die Lebensfähigkeit der Zellen und zur Erhöhung der Anzahl der Deckplättchen pro Embryo erforderlich. Alternativ können die Zellen direkt in die Vertiefungen (mit Deckgläschen), aber die Anzahl von Zellen sollten bis 350.000 pro Well (statt 150.000) erhöht werden übertragen. In anderen Worten, mit dieser Methode können 8-10 Deck erworben werden, während die Direktübertragung ergibt etwa 3-4 Deck weil der Zellen, die an den Platten anzubringen (neben oder unterhalb der Deck). Die durchschnittliche viability der Kulturen, unter Verwendung dieses Verfahrens betrug etwa 90%. </li></ol> 5. Kultur Wachstum und Wartung <ol><li> Nach 1 Stunde Inkubation sorgfältig übertragen Sie die Deckgläser mit dem Medium in 24-Well-Platten, enthaltend 400 &amp; mgr; l vorgewärmten (37 ° C) vollständigem Medium (Gesamtvolumen: 500 ul). Die Zellen O / N bei 37 ° C. </li><li> Innerhalb von 24 Stunden nach der Inkubation die Wells vorsichtig fügen 500 ul Vollmedium in jede Vertiefung. Hinweis: die ersten paar Stunden ist die kritischste Phase für das Überleben von dopaminergen Neuronen und die Anzahl der überlebenden Zellen nicht signifikant über diesen Punkt hinaus zu ändern. </li><li> Sie zusätzliche Medien hinzufügen, nicht zu den Kulturen in den ersten zwei Wochen, bis das Medium wird gelb. Wenn Kultivierung für mehr als zwei Wochen oder mittlere Farbumschlag nach gelb, Austausch Hälfte der Medien (500 ul) mit frischem Komplettvorgewärmten Medien (in der Regel alle zwei Wochen). HINWEIS: Die dopaminerge Neuronen innerhalb derKulturen würden für mehr als 6 Wochen unter diesen Bedingungen zu überleben. </li></ol>

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</ol>

Es wurde kein Interessenkonflikt erklärt.

Dopaminerge Neuronen im Mittelhirn sind die Hauptquelle von Dopamin im ZNS. Sie werden in drei Gruppen unterteilt, Substantia nigra pars compacta (SNpc), ventralen Tegmentum (VTA) und retrorubral Feld (RRF) 10, 11. Die Neuronen im VTA SNpc und führen zu großen dopaminergen Bahnen, mesocorticalen, mesolimbischen und nigrostriatalen, in Funktionen beteiligt wie die Kontrolle der Emotionen, Motivation und Verhalten des Motors. Untergang der Neuronen in SNpc und funktionellen Störung des nigrostriatalen Systems i...

Verlust von dopaminergen Neuronen aus der Substantia nigra pars compacta führt zu den Kardinal motorischen Symptome der Parkinson-Krankheit (PD), die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung. Die zugrunde liegende Ursache für den Niedergang des Mittelhirn neuronalen Population ist nicht bekannt. Um die biochemischen Wege für die Entwicklung und Modulation neurophysiologischen Eigenschaften und das Überleben von Neuronen mesDA mehrere Zellkultur- und Tiermodellsystemen verantwortlich verwendet wurden studieren. Immortalisierte Zelllinien, einschließlich der Ratte dopaminergen Zelllinie 1RB 3 AN 27 (N27), der menschlichen dopaminergen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y, der Maus dopaminergen Hybridzellinie MN9D und Menschen mesencephalen LUHMES Zellen für biochemische und begrenzte mechanistische Studien 1 verwendet wurde -5. Für die Untersuchung des spezifischen Verlust mesDA Neuronen mehrere Neurobasis und genetische Modelle wurden entwickelt 6-8. Primäre ventralen Mittelhirn KulturenStellen ein unverzichtbares Werkzeug für die Untersuchung der neuronalen und synaptischen Eigenschaften der dopaminergen Neuronen und die Wege in der Pathogenese dieser häufige Erkrankung beteiligt. Hier präsentieren wir Ihnen ein ausführliches Protokoll für die Isolierung von Mittelhirn dopaminergen Neuronen, die Änderungen zu höheren Überlebensfähigkeit und erhöhte Ausbeute an Deckgläsern pro Embryo enthält. Die Nutzung vorzeitige E12.5 Maushirn (E14.5 in rat) erhöht die Überlebensfähigkeit. In diesem Alter Neuronen nicht Axone entwickelt noch, die Zellen intakt beim Präparieren verlässt und den Stress dadurch deutlich erhöht Überlebensfähigkeit minimiert. Darüber hinaus sorgfältige Präparation der ventralen Mittelhirn, wie in Abschnitt 2 dieses Protokoll beschrieben, weiter verbessert Überlebensfähigkeit. Um die Anzahl der Deckgläser pro Embryo zu erhöhen, wird eine alternative Beschichtungsverfahren in Abschnitt 4 dieses Protokolls vorgestellt. Dies führt zu einer Ausbeute von bis zu 10 Deck pro Embryo im Vergleich zu 4 Deckgläser unterStandard Plattierungsbedingungen wodurch die Menge der Tiere pro Versuch. Neuronen in Kultur zeigen Auswuchs von Axonen und Dendriten bilden synaptische Verbindungen und zeigen das Vorhandensein von neuronalen und synaptischen Marker machen diese Kulturen für Live Cell Imaging, immunzytochemischen und elektrophysiologische Untersuchungen geeignet. Weiterhin ist die Verwendung von neuronalen Kulturen erleichtert und pharmakologische Manipulation. Auswuchs von Neuriten von Tag 2 in vitro ermöglicht die Entwicklungsstudien. Ferner ermöglicht die langfristige Überlebensrate von Kulturen (bis zu sechs Wochen) für ein Studium des langsame, progressive Degeneration dieser Neuronen geeignet.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's modifizierte Eagle Medium Nährstoffmischung F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), flüssiges</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum, hitzeinaktiviert (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16140</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement (100X), flüssiges</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose Lösung (45 % (wt/vol) in Wasser</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin BSA</td><td>Sigma</td><td>A9430</td><td></td></tr><tr><td>Laminin aus Engelbreth-Holm-Swarm Maussarkom-Basalmembran</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (0,05 % (wt/vol)</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin (BSA) Zellkultur getestet</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tyrosin-Hydroxylase (Th)-Antikörper</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P60101-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin, 0,01%ige Lösung</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Map2 (Mikrotubuli-assoziiertes Protein-2A und -2B) Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Synapsin-1 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB1543P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen IgG&nbsp; &nbsp; Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Esel Anti-Kaninchen IgG&nbsp; &nbsp; Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Schaf IgG&nbsp; &nbsp; Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Esel Anti-Schaf IgG&nbsp; &nbsp; Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Esel Anti-Maus IgG&nbsp; &nbsp; Antikörper</td><td>Molekulare Sonden</td><td>A-21203</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung (0,4 % (wt/vol))</td><td>Biowhittaker</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Phasenkontrastmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 40 C</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>May-45</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaszange &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-33</td><td></td></tr><tr><td>Zwei Dumont #45 Pinzetten &ndash; Dumoxel</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11245-30</td><td></td></tr><tr><td>Klingenhalter/Brecher Flacher Griff - 11cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Student Iris Schere - Gerade 11,5 cm</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Faseroptische Halogenbeleuchtung</td><td>Nikon</td><td>MKII</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Pasteur-Pipetten aus Borosilikatglas</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Proscitech</td><td>SVZ2NIOU</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &Mikro; m sterile Filtereinheiten</td><td>Nalgene</td><td>NL-CE-156-4020</td><td></td></tr><tr><td>100x20 mm Petrischalen</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Runde Deckglas #1 Dicke Deutsches Glas 12 mm</td><td>Bellco Glas</td><td>1943-10012&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, kultur und langfristige wartung von primär mesencephalen dopaminergen neuronen aus embryonalen nagetier brains

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Die Degeneration von mesencephalen dopaminergen (mesDA) Neuronen ist das pathologische Kennzeichen der Parkinson-Krankheit. Die Erforschung der biologischen Prozesse, die an den physiologischen Funktionen und der Vulnerabilität und dem Tod dieser Neuronen beteiligt sind, ist unerlässlich, um die zugrunde liegenden Ursachen zu verstehen und die Heilung dieser häufigen neurodegenerativen Erkrankung zu entschlüsseln. Primärkulturen von mesDA-Neuronen stellen ein Werkzeug zur Untersuchung der molekularen, biochemischen und elektrophysiologischen Eigenschaften dar, um die Entwicklung, das langfristige Überleben und die Degeneration dieser Neuronen im Krankheitsverlauf zu verstehen. Hier stellen wir eine detaillierte Methode zur Isolierung, Kultivierung und Erhaltung von dopaminergen Neuronen des Mittelhirns aus E12.5-Mausembryonen (oder E14.5-Rattenembryonen) vor. Optimierte Zellkulturbedingungen in diesem Protokoll führen zum Vorhandensein von axonalen und dendritischen Projektionen, synaptischen Verbindungen und anderen neuronalen morphologischen Eigenschaften, die die Kulturen für die Untersuchung der physiologischen, zellbiologischen und molekularen Eigenschaften dieser neuronalen Population geeignet machen.

Immunhistochemie gegen Tyrosinhydroxylase (Th) zeigt, dass zwischen 0,5-1% der Zellen in Kultur sind dopaminergen. Neuronale Projektionen erscheinen innerhalb von 2 Stunden nach dem Ausstreichen von dem ersten Tag, Axonen und Dendriten unterscheidbar sind (Abbildung 2), unter Verwendung von Tyrosin-Hydroxylase (TH) und Microtubule-Associated Protein 2 (Map2) Antikörper (Abbildung 3). Die Neuronen überleben länger als sechs Wochen zeigen umfangreiche Auswuchs. Das Neuron-Glia-Verhältnis ...

Die Ursachen der Degeneration von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn während der Parkinson-Krankheit sind nicht vollständig geklärt. Zellkultursysteme stellen ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der neurophysiologischen Eigenschaften dieser Neuronen dar. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das für die in vitro Modellierung der Neurodegeneration verwendet werden kann.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, primäre Neuronen aus dem ventralen Mittelhirn von Nagetieren effizient zu isolieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Mittelhirn von Nagetier-Embryonen präpariert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das ventrale Mittelhirn sorgfältig zu isolieren.Anschließend muss das neuronale Gewebe dissoziiert werden, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Im letzten Schritt werden die primären Neuronen in einem kleinen Volumen auf Deckgläsern ausplattiert, bevor die angehefteten Zellen später in eine 24-Well-Platte überführt werden. Abschließend erfolgt die Identifizierung der dopaminergen Neuronen in der Kultur mithilfe von Antikörpern und der immunfluoreszenzmikroskopischen Analyse.Die dopaminergen Neurone im Mittelhirn sind an mehreren Funktionen beteiligt, darunter der Steuerung von Bewegung und Emotion in der Kognition sowie dem Belohnungssystem des Gehirns. Sie sind zudem an neurologischen und neuropsychiatrischen Erkrankungen beteiligt, darunter Parkinson-Krankheit, Sucht und Schizophrenie. Die Methode zur Reparatur des ventralen Mittelhirns.Neuronale Kulturen können verwendet werden, um die Physiologie und zellulären Eigenschaften dopaminerger Neuronen zu untersuchen sowie die Ursachen ihres degenerativen Verlusts zu verstehen, wie sie beispielsweise im Verlauf von Erkrankungen wie Morbus Parkinson auftreten. Bereiten Sie zunächst die Deckgläser vor.Kochen Sie sie mindestens 30 Minuten lang in 70 % Ethanol, um Rückstände von Fett zu entfernen. Danach autoklavieren Sie die Deckgläser. Überführen Sie die Deckgläser in 24-Loch-Platten und geben Sie jeweils ein halbes Milliliter Polyol all ethene hinzu.Lassen Sie die Platten nun eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Beachten Sie, dass die Haltbarkeit der gebrauchsfertigen Polyol- oder Athene-Lösung ein Monat beträgt. Anschließend die Deckgläser dreimal mit je einem halben Milliliter Wasser waschen.Ohne alle drei Waschschritte würden die kultivierten Zellen nicht 24 Stunden überleben. Als Nächstes bereiten Sie die Laminin-Lösung zu. Achten Sie darauf, sie zuerst langsam auf Eis aufzutauen.Lösen Sie dann das Laminin in kaltem D-M-E-M-F 12 auf und verwenden Sie es sofort. Geben Sie nun je ein halbes Milliliter frisch hergestellte Arbeitslösung mit Laminin in jedes Loch und lassen Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zuletzt poliere ich beim Vorbereiten der Glaspipette deren Spitzen auf die Hälfte ihrer normalen Größe.Führen Sie einen Bauchschnitt durch, um die Uterusblasen freizulegen, und lösen Sie mit einer Pinzette den Uterus. Überführen Sie den Uterus in eiskaltes HBSS in einer 100-Millimeter-Schale und beginnen Sie, die Embryonen mit der Pinzette zu entfernen. Überführen Sie die isolierten Embryonen in eine neue Schale mit kaltem HBSS.Präparieren Sie nun unter dem Stereomikroskop bei 10-facher Vergrößerung die Region des ventralen Mittelhirns. Dissezieren Sie das Mes- und das zephalische Archiv, indem Sie das Gehirn am Isthmus sowie in der Grenzregion zwischen Mes- und zephalischem Di-zephalischem Bereich mit einer Schere oder Pinzette durchtrennen. Nachdem das gesamte Mittelhirn entfernt wurde, führen Sie einen Schnitt im medialen dorsalen Mittelhirn durch.Entfernen Sie mit einer Pinzette die Hirnhäute. Dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolg der neuronalen Kultivierung. Nicht-neuronale Zellen sterben unter den Kulturbedingungen ab und beeinträchtigen benachbarte Neuronen durch ungünstige Signalgebung.Jetzt das Mitthirngewebe zu einer Schmetterlingsform abflachen. Mit einer sterilen Klinge etwa die Hälfte jedes Flügels abschneiden, wobei das ventrale Mittelhirn übrig bleibt. Das ventrale Mittelhirn in kalte HBSS-Lösung in einem 15-Milliliter-Konischgefäß überführen.Danach fortfahren, den nächsten Embryo zu präparieren, und innerhalb einer Stunde so viele Embryonen wie möglich bearbeiten. Embryonen, die länger als eine Stunde auf Eis aufbewahrt werden, weisen eine geringe Zellviabilität auf. Um eine hohe Viabilität der dopaminergen Neuronen sicherzustellen, sollte die Zeit von der Präparation bis zur Ausplattierung eine Stunde nicht überschreiten.Außerdem ist das Entfernen der Meningen unter einem Abzug für das Überleben der Neuronen entscheidend. Entfernen Sie das HBSS aus der Sammlung des ventralen Mittelhirns. Geben Sie dann ein Milliliter warme 0,05 %ige Trypsin-ADTA-Lösung hinzu, ausreichend für 12 Gewebestücke.Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten. Ersetzen Sie unter dem Abzug das Tripsin A DTA durch ein Milliliter Deaktivierungsmedium, vorsichtig aufquellen lassen, um es zu mischen, und entfernen Sie anschließend das Deaktivierungsmedium, lassen jedoch genügend Medium zurück, sodass die dissoziierten Zellen nicht verworfen werden.Als Nächstes waschen Sie die Gewebe zweimal mit vollständigem Medium, ohne die Zellen zu verlieren. Geben Sie nun ein Milliliter vollständiges Medium hinzu. Danach pipettieren Sie das Gewebe mit der feuerpolierten Pipette, ohne Blasen zu bilden, bis eine Einzelzell-Suspension erhalten ist.Etwa acht bis zehn Passagen sollten ausreichen. Anschließend die Zellen fünf Minuten lang mit 400 Gs zentrifugieren. Das Medium entfernen und die Zellen in einem Milliliter komplettem Medium resuspendieren.Pipettieren Sie die Zellen bis zu viermal, um eine Suspension zu erhalten. Beginnen Sie damit, die Zellen in der Suspension zu zählen und ihren Gesundheitszustand zu beurteilen. Verwenden Sie dabei die Trypanblau-Ausschlussmethode mit einem Hämozytometer.Passt nun die Zellsuspension auf 1500 Zellen pro Mikroliter an. Überführt anschließend die sterilisierten Mikrozentrifugenrohrkappen in 100-Millimeter-Dishs. Platziert die vorbereiteten Deckgläser mit einer Pinzette auf den Kappen.Spülen Sie die Deckgläser nicht und vermeiden Sie, dass sie austrocknen. Geben Sie 100 Mikroliter Suspension auf jedes Deckglas. Diese etwas ungewöhnliche Methode gewährleistet eine Kulturviabilität von 90 % und ist ein entscheidender Schritt für den Erfolg.Danach die Petrischale schließen und eine Stunde lang in den Inkubator stellen; nach der Inkubation vorsichtig die Deckgläser mit dem Medium in 24-Loch-Platten überführen, die in jedem Loch 400 Mikroliter vollständiges Medium enthalten, das auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde, und die Zellen dann über Nacht inkubieren. Die ersten Stunden sind für das Zellüberleben innerhalb von 24 Stunden am kritischsten. Vorsichtig einen halben Milliliter vollständiges Medium zu jedem Loch hinzufügen.Jede zwei Wochen. Wechseln Sie die Hälfte des Mediums. Wenn die Kultur gelb wird, kann der halbe Mediumwechsel früher durchgeführt werden, sollte aber dennoch selten erfolgen.Dopaminerge Neuronen überleben unter diesen Bedingungen mehr als sechs Wochen. Nach zweiw&ouml;chiger Kultur zeigen immunhistochemische F&auml;rbungen gegen Tyrosinhydroxylase und neuronale Marker, dass 1% der Zellen dopaminerg sind. Neuronale Forts&auml;tze erscheinen innerhalb von zwei Stunden nach der Aussaat.Am Ende des ersten Kulturtages sind Axone und Dendriten unterscheidbar. Letztendlich überleben die Neuronen mehr als sechs Wochen und zeigen eine umfangreiche Auswucherung nach dieser Vorgehensweise. Andere Methoden wie virale Transduktion, immunfluoreszente Färbung oder Elektrophysiologie können durchgeführt werden, um mechanistische Fragen in dopaminergen Neuronen zu beantworten.

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