Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, primäre Neuronen aus dem ventralen Mittelhirn von Nagetieren effizient zu isolieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Mittelhirn von Nagetier-Embryonen präpariert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das ventrale Mittelhirn sorgfältig zu isolieren.

Anschließend muss das neuronale Gewebe dissoziiert werden, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Im letzten Schritt werden die primären Neuronen in einem kleinen Volumen auf Deckgläsern ausplattiert, bevor die angehefteten Zellen später in eine 24-Well-Platte überführt werden. Abschließend erfolgt die Identifizierung der dopaminergen Neuronen in der Kultur mithilfe von Antikörpern und der immunfluoreszenzmikroskopischen Analyse.

Die dopaminergen Neurone im Mittelhirn sind an mehreren Funktionen beteiligt, darunter der Steuerung von Bewegung und Emotion in der Kognition sowie dem Belohnungssystem des Gehirns. Sie sind zudem an neurologischen und neuropsychiatrischen Erkrankungen beteiligt, darunter Parkinson-Krankheit, Sucht und Schizophrenie. Die Methode zur Reparatur des ventralen Mittelhirns.

Neuronale Kulturen können verwendet werden, um die Physiologie und zellulären Eigenschaften dopaminerger Neuronen zu untersuchen sowie die Ursachen ihres degenerativen Verlusts zu verstehen, wie sie beispielsweise im Verlauf von Erkrankungen wie Morbus Parkinson auftreten. Bereiten Sie zunächst die Deckgläser vor.

Kochen Sie sie mindestens 30 Minuten lang in 70 % Ethanol, um Rückstände von Fett zu entfernen. Danach autoklavieren Sie die Deckgläser. Überführen Sie die Deckgläser in 24-Loch-Platten und geben Sie jeweils ein halbes Milliliter Polyol all ethene hinzu.

Lassen Sie die Platten nun eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Beachten Sie, dass die Haltbarkeit der gebrauchsfertigen Polyol- oder Athene-Lösung ein Monat beträgt. Anschließend die Deckgläser dreimal mit je einem halben Milliliter Wasser waschen.

Ohne alle drei Waschschritte würden die kultivierten Zellen nicht 24 Stunden überleben. Als Nächstes bereiten Sie die Laminin-Lösung zu. Achten Sie darauf, sie zuerst langsam auf Eis aufzutauen.

Lösen Sie dann das Laminin in kaltem D-M-E-M-F 12 auf und verwenden Sie es sofort. Geben Sie nun je ein halbes Milliliter frisch hergestellte Arbeitslösung mit Laminin in jedes Loch und lassen Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Zuletzt poliere ich beim Vorbereiten der Glaspipette deren Spitzen auf die Hälfte ihrer normalen Größe.

Führen Sie einen Bauchschnitt durch, um die Uterusblasen freizulegen, und lösen Sie mit einer Pinzette den Uterus. Überführen Sie den Uterus in eiskaltes HBSS in einer 100-Millimeter-Schale und beginnen Sie, die Embryonen mit der Pinzette zu entfernen. Überführen Sie die isolierten Embryonen in eine neue Schale mit kaltem HBSS.

Präparieren Sie nun unter dem Stereomikroskop bei 10-facher Vergrößerung die Region des ventralen Mittelhirns. Dissezieren Sie das Mes- und das zephalische Archiv, indem Sie das Gehirn am Isthmus sowie in der Grenzregion zwischen Mes- und zephalischem Di-zephalischem Bereich mit einer Schere oder Pinzette durchtrennen. Nachdem das gesamte Mittelhirn entfernt wurde, führen Sie einen Schnitt im medialen dorsalen Mittelhirn durch.

Entfernen Sie mit einer Pinzette die Hirnhäute. Dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolg der neuronalen Kultivierung. Nicht-neuronale Zellen sterben unter den Kulturbedingungen ab und beeinträchtigen benachbarte Neuronen durch ungünstige Signalgebung.

Jetzt das Mitthirngewebe zu einer Schmetterlingsform abflachen. Mit einer sterilen Klinge etwa die Hälfte jedes Flügels abschneiden, wobei das ventrale Mittelhirn übrig bleibt. Das ventrale Mittelhirn in kalte HBSS-Lösung in einem 15-Milliliter-Konischgefäß überführen.

Danach fortfahren, den nächsten Embryo zu präparieren, und innerhalb einer Stunde so viele Embryonen wie möglich bearbeiten. Embryonen, die länger als eine Stunde auf Eis aufbewahrt werden, weisen eine geringe Zellviabilität auf. Um eine hohe Viabilität der dopaminergen Neuronen sicherzustellen, sollte die Zeit von der Präparation bis zur Ausplattierung eine Stunde nicht überschreiten.

Außerdem ist das Entfernen der Meningen unter einem Abzug für das Überleben der Neuronen entscheidend. Entfernen Sie das HBSS aus der Sammlung des ventralen Mittelhirns. Geben Sie dann ein Milliliter warme 0,05 %ige Trypsin-ADTA-Lösung hinzu, ausreichend für 12 Gewebestücke.

Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten. Ersetzen Sie unter dem Abzug das Tripsin A DTA durch ein Milliliter Deaktivierungsmedium, vorsichtig aufquellen lassen, um es zu mischen, und entfernen Sie anschließend das Deaktivierungsmedium, lassen jedoch genügend Medium zurück, sodass die dissoziierten Zellen nicht verworfen werden.

Als Nächstes waschen Sie die Gewebe zweimal mit vollständigem Medium, ohne die Zellen zu verlieren. Geben Sie nun ein Milliliter vollständiges Medium hinzu. Danach pipettieren Sie das Gewebe mit der feuerpolierten Pipette, ohne Blasen zu bilden, bis eine Einzelzell-Suspension erhalten ist.

Etwa acht bis zehn Passagen sollten ausreichen. Anschließend die Zellen fünf Minuten lang mit 400 Gs zentrifugieren. Das Medium entfernen und die Zellen in einem Milliliter komplettem Medium resuspendieren.

Pipettieren Sie die Zellen bis zu viermal, um eine Suspension zu erhalten. Beginnen Sie damit, die Zellen in der Suspension zu zählen und ihren Gesundheitszustand zu beurteilen. Verwenden Sie dabei die Trypanblau-Ausschlussmethode mit einem Hämozytometer.

Passt nun die Zellsuspension auf 1500 Zellen pro Mikroliter an. Überführt anschließend die sterilisierten Mikrozentrifugenrohrkappen in 100-Millimeter-Dishs. Platziert die vorbereiteten Deckgläser mit einer Pinzette auf den Kappen.

Spülen Sie die Deckgläser nicht und vermeiden Sie, dass sie austrocknen. Geben Sie 100 Mikroliter Suspension auf jedes Deckglas. Diese etwas ungewöhnliche Methode gewährleistet eine Kulturviabilität von 90 % und ist ein entscheidender Schritt für den Erfolg.

Danach die Petrischale schließen und eine Stunde lang in den Inkubator stellen; nach der Inkubation vorsichtig die Deckgläser mit dem Medium in 24-Loch-Platten überführen, die in jedem Loch 400 Mikroliter vollständiges Medium enthalten, das auf 37 Grad Celsius erwärmt wurde, und die Zellen dann über Nacht inkubieren. Die ersten Stunden sind für das Zellüberleben innerhalb von 24 Stunden am kritischsten. Vorsichtig einen halben Milliliter vollständiges Medium zu jedem Loch hinzufügen.

Jede zwei Wochen. Wechseln Sie die Hälfte des Mediums. Wenn die Kultur gelb wird, kann der halbe Mediumwechsel früher durchgeführt werden, sollte aber dennoch selten erfolgen.

Dopaminerge Neuronen überleben unter diesen Bedingungen mehr als sechs Wochen. Nach zweiwöchiger Kultur zeigen immunhistochemische Färbungen gegen Tyrosinhydroxylase und neuronale Marker, dass 1% der Zellen dopaminerg sind. Neuronale Fortsätze erscheinen innerhalb von zwei Stunden nach der Aussaat.

Am Ende des ersten Kulturtages sind Axone und Dendriten unterscheidbar. Letztendlich überleben die Neuronen mehr als sechs Wochen und zeigen eine umfangreiche Auswucherung nach dieser Vorgehensweise. Andere Methoden wie virale Transduktion, immunfluoreszente Färbung oder Elektrophysiologie können durchgeführt werden, um mechanistische Fragen in dopaminergen Neuronen zu beantworten.