Name: Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten In-vivo- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung von Monozyten-Trafficking im Schädelknochenmark lebender Mäuse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen zur Untersuchung von Mobilisierungsmechanismen im Immunsystem.

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Die Autoren möchten sich Anne Daron und Pierre Louis Loyher für redaktionelle Unterstützung danken, die Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) für die Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Mikroskop und das Tier Facility &quot;NAC&quot; und Camille Baudesson für Mäuse züchten Unterstützung. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel aus dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7 / 2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr 304.810 - RAIDs und Nr 241.440-EndoStem von Inserm, der Université Pierre et Marie Curie &quot;Emergence &quot;, von la&quot; Ligue contre le cancer &quot;, von&quot; Association pour la Recherche sur le Cancer &quot;und von&quot; Agence Nationale de la Recherche &quot;Programm Emergence 2012 (ANR-EMMA-050). PH wurde von la &quot;Ligue contre le cancer&quot; unterstützt.

HINWEIS: Alle Experiment Protokolle wurden von der Französisch Tierversuche und Ethik-Kommission genehmigt und vom &quot;Service Protection et Santé Animales, Environnement&quot; mit der Nummer A-75-2065 validiert. Probengrößen werden so gewählt, um die Reproduzierbarkeit der Experimente zu gewährleisten und nach dem 3R tierischen Ethik Regulierung. 1. Herstellung der Mäuse <ol><li> Anästhesie <ol><li> Für kurze Zeit der Bildgebung (weniger als 1 Stunde), betäuben die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 200 ul einer Kochsalzlösung mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). </li><li> Alternativ kann für längere Zeitabbildung (bis zu 4 h), anaesthetize der Maus bei einer Inhalation von Isofluran 2,5% in einer 70/30 Mischung von O 2 / N 2 O, verdampft durch eine angepasste Maske. </li><li> HINWEIS: Auf diese Weise sorgt für stabilere Bewusstlosigkeit und vermeidet Serien intraperitoneale Injektion von Drogen. </li&gt; <li> Sobald die Maus betäubt, überprüfen Bewusstlosigkeit durch Stimulation der Fußsohle mit Zangen. </li></ol></li><li> Gefäßfärbung / zusätzliche Färbung <ol><li> Für vaskuläre Färbung: intravenös injizieren in die Schwanzvene wurden 200 ul Rhodamin-Dextran (2 MDa, 10 mg / ml in Kochsalzpuffer). </li><li> Für Neutrophilen-Färbung: injizieren 2 ug Ly6G-PE (Klon 1A8) in 100 ul Kochsalzlösung, intravenös in die Schwanzvene. </li></ol></li><li> Immobilisierung <ol><li> Zur Immobilisierung, verwenden Sie eine maßgeschneiderte stereotaktischen Halterung an das Mikroskop und mit dem Narkosegas Inhalator angepasst. HINWEIS: Die stereotaktische Halter ist ein Metallträger mit zwei Metallplatte Klammern, von denen einer fest und der andere Wechsel und anpassungsfähig, um den Kopf des Tieres fest. </li><li> Installieren Sie den Kopf der Maus zwischen den Halteplatten isoliert von Atembewegungen zu gewährleisten. Ziehen Sie die Ohren zwischen Halteplatten und den Kopf auf die sk streckenin. Prüfen Sie für die Stabilität und die Atmung Wohlbefinden der Tiere. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Kopfhaut <ol><li> Vorsichtig mit 70% igem Ethanol, um das Haar von der Kopfhaut mit einem sterilen Applikators benetzen, Vermeidung von Kontakt mit den Augen. </li><li> Schneiden Sie die Haut mit einer sterilen Schere und Zange, die Kopfhaut von der Rückwärts des Scheitelbein vollständig zu entfernen, um das Stirnbein. Fernhalten von bis zu 3 mm von Augen und Ohren, um umfangreiche Blutungen zu verhindern. Entfernen Sie die Abdeckung des Schädels (Knochenhaut) lockerem Bindegewebe. Waschen Sie die restlichen Haare mit warmem PBS getränkten Papiertuch. </li></ol></li><li> Immersion-System einrichten <ol><li> Fügen Sie einen Gummiring von 18 mm Durchmesser mit chirurgischer Kleber direkt auf den Schädel mit einer kleinen Nadel zu Verteilung zu steuern. Kleben den gesamten Umfang des Gummirings, um das Auslaufen zu verhindern (30 &amp; mgr; l ausreichend sein). </li><li> Reinigen Sie den Schädel unter dem Ring ein letztes Mal mit PBS-getränkten Papiertuch und fügen Sie dann 37 ° C PBS für ein vollständiges Eintauchen derSchädel. Fügen Sie einen Tropfen 0,9% NaCl-Lösung oder bestimmte Augensalbe auf jedem Auge der Maus an Augentrockenheit zu vermeiden. Ziehen Sie den stereotaktischen Halterung im Rahmen des Ziels. </li><li> Etwa positionieren Sie den Bereich mit dem Mikroskop Okular durch direkte Übertragung. </li></ol></li></ol> 2. Zwei-Photonen-Imaging Acquisition <ol><li> Verwenden einer Multiphotonen-Mikroskop in Verbindung mit einem Ti: Saphir-Kristall-Laser, der Impulse von 140fs NIR-Licht enthält, selektiv abstimmbar von 680 bis 1.080 nm und einen akusto-optischen Modulator für die Laserleistungssteuerung. Verwenden Sie eine Konfiguration mit 3 externen nichtdescannten Detektoren (NDD) mit einer Kombination von zwei dichroitischen Spiegel (565 nm und 690 nm), 565/610 und 500/550 Bandpassfilter (die gleichzeitige Aufnahme von 3 Fluoreszenzkanäle zu ermöglichen), und einen 485 Kurzpassfilter, mit einem Plan Achromat × 20 (NA = 1) Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Stellen Sie den Heizraum, gute homeothermy der ANAES ermöglichenthetized Maus., HINWEIS: Temperatur vielleicht 1 Stunde eingestellt werden, bevor die Abbildung Sitzung für eine bessere Stabilität. In unserem Fall 32 ° C wurde gewählt, um eine optimale Körpertemperatur des anästhesierten Maus (36-37 ° C) erhalten und ist für bis zu 4 h gehalten. Diese Temperatur kann mit dem System verwendet (digital Sonde kann verwendet werden, um diesen Punkt zu überprüfen) angepasst werden. Darüber hinaus ist das verwendete Heizkammer dunkel / schwarz und deckt einen Teil des Systems (Ziele und motorisierten Platte) fremdlicht Kontamination zu vermeiden. </li><li> Schalten Sie das System <ol><li> Einschalten des Ti: Saphir-Laser, dann das gesamte Mikroskopsystem. Starten Sie die Erfassungssoftware. Stellen Sie den Laser-Wellenlängenbereich um 870 nm. Wählen Sie die entsprechende NDD für die Aufnahme. HINWEIS: In unserem Fall sind Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) 19 und cyan fluoreszierende Protein (ECFP) durch die NDD nach 485 Kurzpassfilter detektiert. ECFP wird auch durch die NDD detektiert, nachdem die 500/550 Bandpaßfilter und Rhodamin-Dextran wird durch t detektierter NDD nach dem 565/610 Bandpassfilter. </li></ol></li><li> Passen Akquisition Einstellungen <ol><li> Verwenden Sie die &quot;Live-Akquisition&quot; Imaging-Befehl der Software und mit dem Mikroskop Wege, stellen Sie den Fokus auf eine Region mit ECFP und Rhodamin-Signal. Eingestellt, die Laserleistung auf ein Minimum, um das beste Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei minimalen Photoschäden zu erhalten. HINWEIS: Die Leistungseinstellung variiert je nach der Tiefe der Bereich von Interesse. Typischerweise werden die AOM-Einstellungen werden rund 20%, die eine Laserleistung über das Ziel um 15 mW repräsentiert gesetzt. Es ist besser, Gewinn Macht auf den PMTs erhöhen für jeden NDD an Photobleaching und Foto-Schaden zu reduzieren. Typische Erfassungseinstellungen einzigen Abtastung mit einem Pixelverweilzeit von 1,58 &amp; mgr; s und einer Auflösung von 512 x 512 Pixeln mit einer 1,5 Vergrößerung. </li></ol></li><li> Wählen Sie die Regionen von Interesse <ol><li> Sobald die Aufnahme Parameter eingestellt sind, verwenden Sie erneut die &quot;live&quot; Erwerb Befehl,und Erhebung des Gewebes, um eine gewünschte (x, y, z) der Wert in Echtzeit überwacht werden soll. HINWEIS: In der Regel haben wir uns für ein Feld sowohl vaskuläre und parenchymale Bereichen. </li><li> Registrieren Sie das Feld mit der &quot;Position&quot; Softwarebefehl. ANMERKUNG: Dieser Befehl speichert x, y, z-Koordinaten der verschiedenen entfernten Bereichen. </li><li> Wählen und registrieren zusätzliche Felder von Interesse (bis zu 3) nach dem gleichen Verfahren. </li><li> Festlegen eines 3D-Z-Stapel mit dem &quot;Z-Stapel&quot; Softwarebefehl auf der ersten gespeicherten Position entsprechend der gewünschten Lautstärke mit gewählten Vergrößerung. Merken tieferen Position zuerst, und dann die höchste Position. Normalisieren Laserleistung mit der Tiefe. HINWEIS: Bei mehreren gleichzeitigen Feldabbildung, so erwerben wir 5 Scheiben von 3 &amp; mgr; z-Schritte für jedes Feld getrennt werden, um ein Volumen von 12 &amp; mgr; m Dicke zu erwerben. Diese Einstellungen werden auf die Art der Zelle untersucht angepasst werden. </li></ol></li><li> Starten Erwerb <ol><li> Wählen Sie das220, Reihe &quot;Software-Befehl und wählen Sie die Dauer des Zeitintervalls und die Anzahl der Zyklen der Zeit. Beginnen Sie Zeitraffer-Bildgebung nach dem Zeitablauf und Dauer, indem Sie die &quot;Start-Experiment&quot; Software-Befehl erforderlich. HINWEIS: In unserem Fall haben wir ein Volumen jeweils 30 s bei 60 Hz entspricht 30 min Echtzeit zu erwerben. Kleinere Zeitablauf durchgeführt, um schnelle Zellvoll in das Blutgefäß zu verfolgen. In diesem Fall dünner z-Stapels und nicht mehr als 2 verschiedenen Felder können gleichzeitig aufgezeichnet werden. </li><li> Eine regelmäßige Überwachung der Einrichtung. <ol><li> Immer überwachen das Tier, um sicherzustellen, sie bewusstlos ist. HINWEIS: Schütteln der Whisker oder Beine des Tieres sind Indikatoren für die Wiederbelebung. Im Falle des Tieres Atmung ruckartig, kann die Menge von Isofluran leicht reduziert werden. Starke Gewebedrift während Akquisition ist ein Indikator für Maus Revival. </li><li> Stellen Sie sicher, das Ziel richtig eingetaucht. Erneuern 37ºC PBS between zwei Akquisitionen (30 min). HINWEIS: Progressive Verschwinden des Signals während der Erfassung ist Indikator für die PBS Leckage. </li></ol></li></ol></li><li> Ende der Prozedur <ol><li> Wenn die benötigten Videos aufgezeichnet werden, das Tier einschläfern durch Genickbruch schnell vor Reanimation. HINWEIS: Wundheilung führt zur Bildung einer Kruste in 24 bis 48 h, was die Möglichkeit zur Längs- Bildgebung auszuführen begrenzt. </li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Driftkorrektur <ol><li> Verwenden Imaris Bitplane Software für 3D-automatische Verfolgung. </li><li> Öffnen Sie die 3D-Bildfolge auf Imaris. Wählen Sie &quot;Spot&quot; Befehl ein, und erzeugen eine manuelle Spur (Mausklick + Shift) für alle Zeitpunkte für mindestens 4 verschiedene Ankerpunkte, möglichst homogen im Feld verteilt. </li><li> Übernehmen Sie die Driftkorrektur mit dem Befehl &quot;richtigen Drift&quot; im Register &quot;Bearbeitungsspur&quot;. </li><li> Prüfen Sie, ob ter Qualität der Korrektur in x, y und z, um vor allem in Artefakt Schwanken zu vermeiden. HINWEIS: Wenn die Korrektur nicht zufrieden stellend, versuchen andere Ankerpunkte oder ausschließen das Video von der Analyse. </li></ol></li><li> Zellverfolgung <ol><li> Verwenden Sie &quot;add new spots&quot; Befehl und wählen Sie &quot;Spur-Spots im Laufe der Zeit&quot; Algorithmus-Einstellung. Zum nächsten Schritt. </li><li> Bewerben automatischen Zelltrackingverfahren entweder auf der gesamten interessierenden Kanal mit &quot;Quellkanal&quot; -Befehl. Gruppenobjekte (dh Zellen) Durchmesser bis 10 um. Zum nächsten Schritt. HINWEIS: Die Wahl wird auf die Unterscheidung zwischen Objekten und Spezifität des Messsignals abhängen. Kurz gesagt, ist die automatische Verfolgung im ganzen Kanal nur möglich, wenn erfasste Signal spezifisch für das Objekt von Interesse ist. Da sowohl SHG und ECFP werden von der NDD nach 485 Kurzpassfilter erkannt wird, wird Tracking präziser und effizienter mit dem ECFP Signals durch die NDD nach der 5 aufgenommen sein00/550 Bandpassfilter. Gruppierten oder dichtgepackten Objekte manuelle Auswahl der ähnlich wie in Schritt 3.1.2 einzelne Objekte erfordern. </li><li> Wählen Sie &quot;Qualität&quot; Filtertyp können Sie den Schwellwert auf Verfolgung von unspezifischen Objekte ausschließen. Zum nächsten Schritt. </li><li> Wählen Sie &quot;Brownschen Algorithmus Motion&quot; mit genauen Parameter &quot;Max Abstand&quot; und &quot;Gap Größe&quot; zwischen zwei Punkten. Bestätigen Track Generation. </li><li> Sobald Spuren werden automatisch berechnet, &quot;Spurdauer&quot; Filtertyp auswählen, stellen Sie den Schwellenwert auf Spuren zu beseitigen kürzer als 120 Sekunden (die 4 Zeitpunkte). </li><li> Obligatorisch: Nach dem automatischen Verfolgung, prüfen Sie die Qualität der Tracks. <ol><li> Rollen Sie die Zeitleiste, um zu überprüfen, dass die Objekte folgen Bahnverläufe. Wenn nicht, verwenden Sie die Optionen der Spur Punktkorrektur in der Registerkarte &quot;Bearbeiten&quot;: Löschen Sie falsche oder unsachgemäße Spuren mit &quot;Löschen&quot; -Befehl (löschen jede Spur point einzeln mit dem Befehl &quot;Trennen&quot;). Wenn Track-Pfad unterbrochen ist, fügen fehlenden Zeitpunkten (Mausklick + Shift), wählen Sie alle Punkte auf einer bestimmten Spur, und verwenden Sie den Befehl &quot;Verbinden&quot; auf der Registerkarte &quot;Track bearbeiten&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Quantifizierung Parameter <ol><li> Wählen Sie die Registerkarte &quot;Statistik&quot; im Befehl &quot;Einstellungen&quot;, wählen Sie die dynamischen Parameter von Interesse in der Liste. Wählen Sie &quot;Exportieren Sie alle Statistiken in Datei&quot; Befehl und speichern Sie die Excel-Datei erzeugt. HINWEIS: Mehrere dynamische Parameter werden direkt aus der Software erhalten, wie Bahnlängen, momentane Geschwindigkeit, mittlere Geschwindigkeit und verfolgen Geradheit. Motilität Koeffizienten 6, 20 ermittelt werden kann, ist jedoch nicht direkt durch die Software zur Verfügung gestellt. </li><li> Für jede Zelle berechnet den Mittelwert der Verschiebungen für jeden Zeitraum (&amp; dgr; t) (bei einem 30 Sek Zeitrafferfilm, wird &amp; dgr; t 30, 60, 90 Sekunden, usw. sein).Zur Erstellung der Mittelwert der quadratischen Verschiebung als eine Funktion des Zeitintervalls. Erhalten Motilität Koeffizienten durch Berechnen der Steigung des linearen Teils der Kurve. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).</li>
<li>Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages+regulate+immunity+through+dynamic+networks+of+survival+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death.</a> J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19, 71-82 (2003).</li>
<li>Robbins, C. S., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+roles+of+monocyte+subsets+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+and+progenitor+cells+induce+monocyte+emigration+in+response+to+circulating+toll-like+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands.</a> Immunity. 34, 590-601 (2011).</li>
<li>Jacquelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+reduces+Ly6Chigh-monocyte+motility+within+and+release+from+the+bone+marrow+after+chemotherapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice.</a> Blood. 122, 674-683 (2013).</li>
<li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
<li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).</li>
<li>Milo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+reveals+promiscuous+crosspresentation+of+blood-borne+antigens+to+naive+CD8%2B+T+cells+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow.</a> 122, 193-208 (2013).</li>
<li>Cavanagh, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+bone+marrow-resident+memory+T+cells+by+circulating%2C+antigen-bearing+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells.</a> Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J Exp Med. 188, 465-474 (1998).</li>
<li>Rashidi, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+mouse+bone+marrow+reveals+differential+niche+engagement+by+quiescent+and+naturally+activated+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells.</a> Blood. , (2014).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Yost, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+neutrophil+extracellular+trap+%28NET%29+formation%3A+a+novel+innate+immune+deficiency+of+human+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates.</a> Blood. 113, 6419-6427 (2009).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nat Med. 19, 107-112 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die kritischen Punkte der in vivo Bildgebung Methodik, um die Stabilität der Ausrichtung, um die Dauer der Bildgebung zu maximieren und das Risiko einer bakteriellen Kontamination und Entzündungen, die die Dynamik der entzündlichen Zellen auswirken können, zu minimieren gewährleisten. Imaging Schädelknochenmark folgt diese Ziele auf die Operation durchgeführt, um Zugang zu dem Knochenmark zu erhalten, ist minimal. Die Verwendung von sterilem Material und Antiseptika ist wichtig, um das Risiko von Infekti...

Das Knochenmark spielt eine zentrale Rolle bei der Hämatopoese und stellt das Hauptreservoir an Monozyten dar, die konstitutiv zwischen dem Blut und dem medullären Parenchym rezirkulieren, den Pool zirkulierender Monozyten mit einer kurzen Lebensdauer erneuern 2,3 und an der Rekonstitution der Steady-State-Gewebe-Makrophagen und dendritischen Zellen teilnehmen 4. Während einer Entzündung oder nach einer vorübergehenden Aplasie werden Monozyten aktiv entweder aus dem Knochenmark oder der Milz mobilisiert 5, 6, 7 und besiedeln entzündete Organe. Mehrere Chemolockstoffachsen waren am Prozess der Mobilisierung myeloischer Zellen aus dem Knochenmark beteiligt 8, 5, 6,9. Neben dem myeloischen Kompartiment ist das Knochenmark auch ein wichtiger Ort für das T-Lymphozyten-Priming 10 und eine Nische des immunologischen Gedächtnisses 11,12. Damit ist dieses Gewebe zentral für zahlreiche Untersuchungen im Bereich der Hämatologie und Immunologie. Unsere Kenntnisse über die strukturelle Organisation medullärer myeloischer Zellen ergeben sich hauptsächlich aus der Analyse histologischer Schnitte von fixierten Geweben 13. Diese statische Sichtweise erlaubt es nicht, die Dynamik des zellulären Austauschs zwischen den verschiedenen Kompartimenten des Knochenmarks zu untersuchen, die die Grundlage seiner funktionellen Aktivität bildet.
Intravitale Bildgebung stellt einen wichtigen biologischen Input bei der Untersuchung der Zellmobilität, der Zelladhärenz und der Zell-zu-Zell-Interaktionen dar, die bisher nur von in vitro Systemen beschrieben wurden. Zu den technischen Herausforderungen für eine korrekte intravitale Bildgebung gehört die Fähigkeit, das Gewebe aus optischer Sicht zu erreichen und seine Isolierung von physiologischen (Atem-, Muskel- oder peristaltische Kontraktionen) oder mechanischen Drifts (Gewebezerstörung und -erweiterung nach einer Operation und Exposition gegenüber dem Mikroskopobjektiv sowie Temperatur- und Gefäß-/Sauerstoffstörungen) zu maximieren. Mikroskopische Drifts können die Fähigkeit, den Fokus über einen längeren Zeitraum zu halten, einschränken und Artefakte bei der Quantifizierung der Zellmotilität einführen. Eine Alternative, die für mehrere Gewebe validiert wurde, um diese technischen Schwierigkeiten zu reduzieren, besteht darin, an explantiertem Gewebe zu arbeiten, das in einem thermostatisierten und sauerstoffhaltigen Medium inkubiert wird. Problematisch kann jedoch eine vollständige Störung des Lymph- und Gefäßkreislaufs sein. Die intravitale Bildgebung des Schädelknochenmarks hat in dieser Hinsicht mehrere Vorteile. Erstens erfordert es nur minimale chirurgische Eingriffe. Zweitens ermöglicht die Dicke des Knochens in diesem Bereich die direkte Visualisierung von Knochenmarknischen ohne Abrieb, wodurch physiologische Störungen reduziert werden. Das medulläre Netzwerk kann im parasagittalen Bereich des Knochens abgebildet werden; Die Sinusoide sind jedoch im fronto-parietalen Bereich sichtbarer, wo die Knochenmatrix dünner ist 12,14. 
Intravitale Bildgebung beruht auf der Verfügbarkeit des genauesten Fluoreszenzreporters, der die interessierende Population markiert. Die In-vitro-Markierung der gereinigten Zellpopulation vor dem adoptiven Transfer führte zu einer wichtigen Charakterisierung der hämatopoetischen Stammzellnischen 15 oder der endothelialen Mikrodomänen des Knochenmarks, die die Tumortransplantation begünstigen 16, und lieferte mehrere grundlegende Beiträge zu Schlüsselkonzepten der Immunologie 17 . Dieser Ansatz erfordert jedoch in der Regel Hunderttausende von Zellen, um eine Chance zu haben, sie anschließend in vivo nachzuweisen. Dies könnte durch die hohe Mortalitätsrate nach der Färbung, die Verdünnung im ganzen Körper und die Veränderung des Aktivierungszustands erklärt werden, was zu einem verzerrten Homing führen könnte. Die endogene Markierung aus transgenen Maussystemen überwindet diese Einschränkungen erheblich und hat es ermöglicht, das Verhalten von endogenen Osteoblasten 8, Megakaryozyten 18 oder Untergruppen der myeloischen Linie 6 abzubilden. Dennoch muss man vorsichtig sein, wenn man die Spezifität des fluoreszierenden Reporters in der untersuchten Untergruppe betrachtet. 
Die Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, genannt MacBlue Maus 1, ist ein wertvolles transgenes System zur Untersuchung medullärer Monozyten mit Echtzeit-Bildgebung 6. Die intravenöse Injektion von Rhodamin-Dextran mit hohem Molekulargewicht unterscheidet das medulläre Parenchym vom vaskulären sinusoiden Netzwerk des Knochenmarks. Mit diesem Ansatz ist es möglich, das Verhalten der Monozyten in den verschiedenen medullären Kompartimenten in einem spezifischen physiopathologischen Kontext von Interesse zu verfolgen. Darüber hinaus schlagen wir eine zusätzliche Strategie vor, um die Dynamik von Monozyten mit der von Neutrophilen durch in vivo-Markierung mit einem spezifischen Antikörper zu vergleichen.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml, Anästhetikum</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer HealthCare</td><td></td><td>10 mg/ml, Anästhetikum</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td></td><td>2,5%, Anästhetikum</td></tr><tr><td>O2/NO2</td><td></td><td></td><td>70/30 Gemisch, Anästhetikum</td></tr><tr><td>Rhodamin-Dextran</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2 MDa, 10 mg/ml, Gefäßfärbung</td></tr><tr><td>Ly6G-PE</td><td>Becton-Dickinson-Klon</td><td></td><td>1A8, Neutrophilenfärbung</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Halter</td><td>Hausgemachte</td><td></td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td></td><td></td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Sterile Scheren- und Zangenchirurgie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gummiring</td><td></td><td></td><td>18 mm Durchmesser, Chirurgie</td></tr><tr><td>Glubran 2</td><td>Queryo Medizin</td><td></td><td>Chirurgischer Kleber, Fixierung von Gummiringen</td></tr><tr><td>Kleine Nadeln</td><td>Terumo</td><td></td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 NLO Multiphotonenmikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Ti: Saphirkristall-Laser</td><td>Coherent Chameleon Ultra</td><td></td><td>140 fsec Pulse von NIR-Licht</td></tr><tr><td>Zen 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Acquisition Software</td></tr><tr><td>Imaris Bitplane&nbsp;</td><td>Bitplane-Analysesoftware</td><td></td><td>, automatisches 3D-Tracking</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>D. Dutscher-Chirurgie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermostatkammer</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Intravital-Bildgebung</td></tr></tbody></table>

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Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Echtzeit-Multiphotonen-Bildgebung bietet eine großartige Möglichkeit, den Zelltransport und Zell-zu-Zell-Interaktionen in ihrer physiologischen 3-dimensionalen Umgebung zu untersuchen. Die biologische Aktivität von Immunzellen hängt hauptsächlich von ihrer Motilitätsfähigkeit ab. Blutmonozyten haben eine kurze Halbwertszeit im Blutkreislauf; Sie stammen aus dem Knochenmark und werden konstitutiv aus diesem freigesetzt. Im entzündlichen Zustand wird dieser Prozess verstärkt, was zu einer Blutmonozytose und einer anschließenden Infiltration des peripheren Entzündungsgewebes führt. Die Identifizierung der biomechanischen Ereignisse, die den Monozytentransport vom Knochenmark zum Gefäßnetz steuern, ist ein wichtiger Schritt, um die physiopathologische Relevanz der Monozyten zu verstehen. Wir führten eine in vivo Zeitraffer-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie des Schädelknochenmarks der Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) Maus durch. Die MacBlue-Maus exprimiert das fluoreszierende Reporter-verstärkte cyan-fluoreszierende Protein (ECFP) unter der Kontrolle eines myeloischen spezifischen Promotors 1 in Kombination mit der Markierung des vaskulären Netzwerks. Wir beschreiben, wie dieser Ansatz die Verfolgung einzelner medullärer Monozyten in Echtzeit ermöglicht, um das Migrationsverhalten innerhalb des Knochenmarkparenchyms und des Gefäßsystems sowie die Zell-zu-Zell-Interaktionen weiter zu quantifizieren. Dieser Ansatz bietet neue Einblicke in die Biologie der Monozyten-Untergruppen des Knochenmarks und ermöglicht es, weiter zu untersuchen, wie diese Zellen unter bestimmten pathologischen Zuständen beeinflusst werden können.

Mäuseschädelstruktur bietet eine gute Gelegenheit, die Knochenmark Physiologie von Intravital Imaging studieren. Der Knochen dünn um den vorderen Scheitelbereich, ist es möglich, Zugang zur Mark Nischen ohne Abrieb des Knochens zu erhalten. 1 stellt eine breite 2D Bereich des Schädels eines MacBlue transgenen Maus. Die Knochenmatrix wird hauptsächlich aus Kollagen I leicht durch SHG 19 feststellbar. Injektion von Rhodamin-Dextran färbt die Gefäßnetz des Knochenmarks und ermöglicht die Identif...

Monozyten sind Schlüsselregulatoren der angeborenen Immunität und spielen eine entscheidende Rolle bei der Erneuerung des peripheren mononukleären phagozytischen Systems und im Falle von Entzündungen. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Echtzeit-Bildgebung des Schädeldachknochenmarks der Maus, um den Mobilisierungsmechanismus der Monozyten zu untersuchen.

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Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Verkehr von Monozyten im Schädelknochenmark einer lebenden Maus mittels Zwei-Photonen-Bildgebung sichtbar zu machen. Zunächst wird die Maus anästhesiert und mit einer Lösung von rot fluoreszierendem Dextran injiziert, um die Gefäße zu markieren. Anschließend wird die Maus in eine spezielle metallische Halterung platziert, und die Kopfhaut vom Hinterkopf des Parietalbeins bis zum Frontalbein wird entfernt.Ein Gummiring wird dann direkt mit chirurgischem Kleber am Schädel befestigt und die Reservoire mit flüssiger Kochsalzlösung gefüllt. Schließlich wird die Mehrphotonenmikroskopie verwendet, um die fluoreszierende Zellentwicklung im Laufe der Zeit im Knochenmark des Schädels zu verfolgen. Diese Methode kann helfen, eine zentrale Frage im Bereich der Immunhämatologie zu beantworten, beispielsweise den Mechanismus der Monozytenmobilisierung im Ruhezustand oder nach einer Chemotherapie.Daher kann diese Methode Einblicke in das Verhalten modulärer Monozyten liefern. Sie kann auch zur Untersuchung anderer Teilpopulationen von Knochenmarkzellen angewendet werden, abhängig von der Spezifität des verwendeten fluoreszierenden Reporters. Das folgende Protokoll nutzt ein Mehrphotonenmikroskop, das mit einem Titan-Saphir-Laser und einem AOM-Modulator zur Laserleistungsregelung gekoppelt ist.Um die gleichzeitige Aufnahme von drei fluoreszierenden Kanälen zu ermöglichen, sollte die Konfiguration drei externe, nicht DS-Scans detektoren oder NDDs mit einer Kombination aus 565 Nanometer und 690 Nanometer Dichroischen Spiegeln, 565, 610 Nanometer und 500–550 Nanometer Bandpassfiltern sowie einem 485 Kurzpassfilter umfassen. Beachten Sie, dass in diesem Aufbau die zweite harmonische Generierung (SHG) und das cyanfarbene fluoreszierende Protein (CFP) nach dem 485 Kurzpassfilter vom NDD erfasst werden. CFP wird ebenfalls vom NDD detektiert.Nach dem 500-550-Bandpassfilter wird Rod Domine Dextran durch die NDD erfasst. Nach dem 565-610-Bandpassfilter die Heizkammer mehrere Stunden vor der Bildaufnahme auf 32 Grad Celsius einstellen. Diese Temperatur hält die Maus während des gesamten Experiments auf einer optimalen Körpertemperatur.Beachten Sie, dass die hier verwendete Heizkammer dunkel ist und die Objektive sowie die motorisierte Platte des Systems abdeckt. Dies hilft, externe Lichtkontamination zu vermeiden. Um das System einzuschalten, schalten Sie zuerst den Titan-Saphir-Laser ein und danach den Rest des Mikroskopsystems.Starten Sie die Aufnahmesoftware. Hier wird die Zeiss Zen-Software verwendet. Stellen Sie den Laserwellenlängenbereich auf 870 Nanometer ein.Danach die geeignete NDD für die Aufnahme auswählen. Die Maus, die in diesem Experiment verwendet wird, ist eine transgene Maus namens Mac blue, die unter Kontrolle des Promotors des CSF1-Rezeptors cyanfarbenes fluoreszierendes Protein exprimiert. Die empfohlene Anästhesiemethode hängt von der Dauer der Bildgebung ab, daher ist es am besten, das begleitende Dokument für Einzelheiten zu konsultieren.Ein schwieriger Aspekt dieses Verfahrens ist die Injektion in die V. tarsalis, da es ziemlich leicht ist, die Vene zu verfehlen. Falls dies geschieht, führen Sie stattdessen eine retroorbitale Injektion durch. Sobald die Maus anästhesiert ist, überprüfen Sie mit einer Pinzette die Bewusstlosigkeit, indem Sie das Fußpolster reizen. Weiter.Um die Gefäße zu färben, injizieren Sie 200 Mikroliter Rodamin-Dextran in die Schwanzvene oder für die Neutrophilen-Färbung 100 Mikroliter physiologische Kochsalzlösung, die LY6GPE enthält. Nach der Injektion wird der Kopf der Maus zwischen die Halteplatten eines speziell angefertigten stereotaktischen Halterungsgeräts platziert, das an das Mikroskop und den Inhalationsnarkoseapparat angepasst ist.Dadurch wird sichergestellt, dass Atembewegungen die Bildgebung nicht beeinträchtigen. Ziehen Sie die Halteplatten fest, um die Haut zwischen den Ohren und dem Kopf zu straffen. Überprüfen Sie die Stabilität. Wenn man vorsichtig mit einer Pinzette auf den Kopf drückt, sollte sich der Kopf nicht bewegen. Anschließend sicherstellen, dass das Tier normal atmet. Um die Maus für die Zweiphotonen-Bildgebung vorzubereiten, mit einem Finger 70 %igen Ethanol auf das Haar der Kopfhaut auftragen, wobei darauf geachtet werden muss, die Augen zu meiden.Legen Sie dann einen Tuchlappen mit einer Aussparung auf, um die Kopfhaut freizulegen. Schneiden Sie anschließend mit sterilen Scheren und Pinzetten die Haut auf und entfernen Sie die Kopfhaut vollständig vom Hinterhauptbein bis zum Stirnbein. Halten Sie dabei einen Abstand von drei Millimetern zu Augen und Ohren ein, um eine starke Blutung zu vermeiden.Entfernen Sie das lose Bindegewebe oder Periost, das den Schädel bedeckt. Waschen Sie anschließend mit einem mit warmer PBS getränkten Papiertuch die restlichen Haare ab, wie hier gezeigt. Tragen Sie mit einer feinen Nadel chirurgischen Kleber auf den gesamten Rand eines Gummiringes mit einem Durchmesser von 10 Millimetern auf.Danach den Gummiring direkt auf den Schädel legen, mit einem weiteren, in PBS getränkten Papiertuch. Reinigen Sie die Innenseite des Rings ein letztes Mal. Geben Sie warmes PBS hinzu, um den Schädel vollständig zu bedecken.Danach den stereotaktischen Halter unter das Objektiv bringen. Sobald die Maus positioniert ist, das Mikroskopokular mit direkter Transmission verwenden, um den Schädel zu betrachten und grob im Mikroskopfeld zu positionieren. Klicken Sie in der oberen linken Ecke des Fensters der Bildgebungssoftware auf Live-Aufnahme.Mit der Mikroskop-Richtungssteuerung in der Software wird eine Live-Abbildung des Gewebes in der Mitte des Fensters angezeigt. Suchen Sie einen Bereich mit CFP- und Rod-Domänen-Signal, um den Fokus einzustellen. Danach stellen Sie die Laserleistung auf das Minimum ein, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis bei minimaler phototoxischer Schädigung zu erzielen.Klicken Sie anschließend in der Software auf den Kanal-Tab und erhöhen Sie die Verstärkung der PMTs für jedes NDD, um Photobleichen und photoinduzierte Schäden zu verringern. Klicken Sie dann auf den entsprechenden Tab, um die Aufnahmeeinstellungen auf Einzelscan mit einer Pixelverweilzeit von 1,58 Mikrosekunden und einer Auflösung von 512 mal 512 Pixeln bei einer 1,5-fachen Vergrößerung festzulegen. Sobald die Aufnahmeparameter eingestellt sind, klicken Sie auf den Live-Aufnahmefunktion und untersuchen Sie das Gewebe, um ein gewünschtes x-, y-, z-Feld auszuwählen, das in Echtzeit überwacht werden soll. Hier wird ein Feld ausgewählt, das sowohl vaskuläre als auch parenchymale Bereiche umfasst.Als Nächstes die X-, Y- und Z-Koordinaten des im Reiter „Positionen“ angezeigten Feldes speichern oder registrieren. Klicken Sie auf „Hinzufügen“. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit bis zu drei weiteren Feldern, um alle Koordinaten von Interesse zu registrieren.Die Koordinaten erscheinen im Reiter „Positions“ neben der Anweisung an die Software. Um einen dreidimensionalen Z-Stack von Bildern aufzunehmen, klicken Sie im Reiter „Positions“ der Software auf „Move to“, um zur ersten registrierten Position zu wechseln, und wählen Sie „Zack“ im oberen linken Feld der Software aus. Dadurch wird der Reiter „Z Stack“ geöffnet, wechseln Sie zur höchsten Z-Position und stellen Sie die Laserleistung entsprechend ein.Klicken Sie zuerst auf „Letztes festlegen“, dann bewegen Sie sich zur tiefsten Position. Stellen Sie die Laserleistung ein. Klicken Sie anschließend auf „Erstes festlegen“.Die Dicke des zu analysierenden Stapels sollte schnell an die untersuchte Zelle angepasst werden. Schnell bewegende Zellen verlassen den Fokusbereich rasch, weshalb Sie einen dickeren Stapel aufnehmen müssen. Danach nehmen Sie für langsam bewegte Zellen auf.Wählen Sie im oberen linken Feld den Befehl „Zeitreihe“, um die Registerkarte „Zeitreihe“ zu öffnen. Legen Sie die Anzahl der Zyklen und das Zeitintervall fest. Hier wird alle 30 Sekunden über 60 Zyklen hinweg ein Volumen aufgenommen.Dies entspricht 30 Minuten in Echtzeit. Um die Zeitrafferaufnahme im Hauptfenster zu starten, wählen Sie „Experiment starten“. Während des gesamten Verfahrens überwachen Sie weiterhin das Tier, um sicherzustellen, dass es bewusstlos ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Objektiv ordnungsgemäß eingetaucht ist.Nachdem die Sequenz erfasst wurde, warmes PBS mit einer Pipette hinzufügen. Anschließend eine zweite 30-minütige Aufnahme beginnen. Falls während der Aufnahme ein fortschreitendes Verschwinden des Signals beobachtet wird, auf Leckage von PBS prüfen.Nachdem alle erforderlichen Videos aufgezeichnet wurden, wurde die Datenanalyse wie in dem begleitenden Dokument beschrieben durchgeführt, um die Physiologie des Knochenmarks mittels intravitale Bildgebung zu untersuchen. Eine Mac-blue-transgene Maus wurde mit 2 Millionen Dalton schwerem Rodamin-Dextran injiziert und mittels Zweiphotonen-Laser-Scanning-Mikroskopie abgebildet. Wie in diesem Video gezeigt, ist in der resultierenden Mikrografie die mit 2 Millionen Dalton schwerem Rodamin-Dextran angefärbte Gefäßstruktur in Rot dargestellt, während der Knochen in Blau durch die zweite harmonische Generierung sichtbar gemacht wurde. ECFP-positive Monozyten, dargestellt in Cyan, befinden sich in parenchymalen Nischen, die als dunkle Bereiche zwischen Gefäßsystem und Knochen sichtbar sind, sowie innerhalb der Gefäße.Um die Einzelzelltrajektorie zu berechnen, wurde eine Zeitrafferaufnahme durchgeführt. Dieses Video zeigt das Wanderungsverhalten parenchymaler Monozyten. Das ECFP-Signal ist in Cyan dargestellt, und die Wanderwege für jeden roten Punkt erscheinen in Grün.Hier ist das wandernde Verhalten vaskulärer Monozyten zu erkennen. Mithilfe dieser Daten können sowohl die mittlere Geschwindigkeit als auch die mittlere quadratische Verschiebung der Zellen berechnet werden. Beachten Sie, dass die vaskulären Monozyten im Vergleich zu parenchymalen Monozyten sowohl eine erhöhte Verschiebung als auch eine erhöhte Geschwindigkeit aufweisen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Maus-Knochenmark-Monozyten in vivo mithilfe der Zwei-Photonen-Bildgebung nach ihrer Entwicklung verfolgen kann. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, um Zellmigration und -interaktion im Knochenmark zu untersuchen, einem äußerst wichtigen Ort der Hämatopoese, der aber auch andere grundlegende Funktionen wie die Antigenpräsentation und das immunologische Gedächtnis umfasst.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von frischem ganzem Knochenmark aus den Hintergliedmaßen der Maus, um ganze BM-Defekte bei Patienten mit Blutkrankheiten wie Leukämie zu untersuchen.

Knochenmarkentnahme aus der Hintergliedmaße der Maus

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur seriellen Probenahme von Femurknochenmark (BM), ohne dass Mäuse getötet werden müssen. Dieses Verfahren ermöglicht Längsschnittstudien der BM-Zusammensetzung von Mäusen im Zeitverlauf und ermöglicht den seriellen Zugang zu Zellen innerhalb des BM für ex vivo- und Transplantationsstudien.

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Die Art der Wechselwirkung zwischen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) und Knochenmark Nischen schlecht verstanden. Kundenspezifische Hardware-Modifikationen und eine mehrstufige Akquisitionsprotokoll ermöglichen den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Bild ex vivo markierten HSPCs innerhalb des Knochenmarks Bereichen referenziert, Tracking-Wechselwirkungen und Bewegung.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung von frischem Knochenmark (BM) vor, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, um die analyse von Neutrophilenzellen durch die hochdimensionale Massenzytometrie (Cytometrie durch Time-Of-Flight, CyTOF) zu verarbeiten.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der Ultrastruktur der Megakaryozyten in situ mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) vor.  Murine Knochenmarke werden gesammelt, fixiert, in Epoxidharz eingebettet und in ultradünnen Abschnitten geschnitten. Nach der Kontrastfärbung wird das Knochenmark unter einem TEM-Mikroskop bei 120 kV beobachtet.

In situ Erforschung der murinen Megakaryopoese mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Erfahren Sie die Visualisierung von Monozyten-Trafficking im Schädelknochenmark lebender Mäuse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen zur Untersuchung von Mobilisierungsmechanismen im Immunsystem.

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