Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten In-vivo-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Monozytentransport im Schädelknochenmark einer lebenden Maus mit Hilfe von Zwei-Photonen-Bildgebung sichtbar zu machen. Zuerst wird die Maus betäubt und mit einer Fäulnislösung, Pansendextran, injiziert, um das Gefäßsystem zu markieren. Die Maus wird dann in eine spezielle Metallstütze gelegt, und die Kopfhaut von der Rückseite des Scheitelknochens bis zum Stirnbein wird entfernt.

Anschließend wird ein Gummiring mit chirurgischem Kleber direkt auf den Schädel aufgetragen und die Reservoire mit flüssiger Kochsalzlösung gefüllt. Schließlich wird die Multiphotonenmikroskopie verwendet, um die Entwicklung fluoreszierender Zellen im Laufe der Zeit im Schädelknochenmark zu verfolgen. Dies kann helfen, eine Schlüsselfrage im Bereich der Immunhämatologie zu beantworten, wie z.B. den Mechanismus der Monozytenmobilisierung im Steady State oder nach Chemotherapie.

Diese Methode kann also einen Einblick in das Verhalten modularer Monozyten geben. Es kann auch angewendet werden, um andere Untergruppen von Knochenmarkzellen zu untersuchen, abhängig von der Spezifität des verwendeten Grippereporters. Das folgende Protokoll verwendet ein Multiphotonenmikroskop, das mit einem Titan-Saphirkristalllaser gekoppelt ist, und einen Op-Modulator zur Steuerung der Laserleistung.

Um die gleichzeitige Aufzeichnung von drei Fluoreszenzkanälen zu ermöglichen, sollte die Konfiguration drei externe Nicht-DS-Scan-Detektoren oder NDS mit einer Kombination aus 565 Nanometern und 690 Nanometern, dichroitischen Spiegeln 565, 610 Nanometern und 500, 550 Nanometer-Bandpassfiltern und einem 485er Kurzpassfilter umfassen. Beachten Sie, dass in diesem Aufbau die zweite harmonische Erzeugung (SHG) und das cyanfarbene fluoreszierende Protein (CFP) vom NDD nach dem 485-Kurzpassfilter erkannt werden. CFP wird auch von der NDD erkannt.

Nach dem 500 550 Bandpassfilter und Rod Domine wird Dextran vom NDD detektiert. Nach dem Bandpassfilter 565 610 wurde die Heizkammer einige Stunden vor der Bildgebung auf 32 Grad Celsius eingestellt. Diese Temperatur hält die Maus während des gesamten Experiments auf einer optimalen Körpertemperatur.

Beachten Sie, dass die hier verwendete Heizkammer dunkel ist und die Objektive und die motorisierte Platte des Systems abdeckt. Dies hilft, eine Kontamination durch externes Licht zu vermeiden. Um das System zuerst einzuschalten, schalten Sie den Titan-Saphir-Laser und dann den Rest des Mikroskopsystems ein.

Starten Sie die Akquisitionssoftware. Hier kommt die Zeiss Zen-Software zum Einsatz. Stellen Sie den Wellenlängenbereich des Lasers auf 870 Nanometer ein.

Wählen Sie dann die passende NDD für die Aufnahme aus. Bei der Maus, die in diesem Experiment verwendet wird, handelt es sich um eine transgene Maus namens Mac blue, die unter der Kontrolle des Liquor-1-Rezeptor-Promotors cyanfluoreszierendes Protein exprimiert. Die empfohlene Anästhesiemethode hängt von der Dauer der Bildgebung ab, daher ist es am besten, das Begleitdokument für Details zu konsultieren.

Ein schwieriger Aspekt dieses Verfahrens ist die T-Venen-Injektion, da es ziemlich leicht ist, die Vene zu übersehen. Führen Sie in diesem Fall stattdessen eine retroorbitale Injektion durch. Sobald die Maus betäubt ist, verwenden Sie eine Zange, um die Bewusstlosigkeit zu überprüfen, indem Sie den Fußballen stimulieren. Nächster.

Zur Färbung des Gefäßsystems injizieren Sie 200 Mikroliter Rod Domine Dextran in die Schwanzvene, oder zur Neutrophilenfärbung. Injizieren Sie 100 Mikroliter Kochsalzlösung mit LY sechs GPE. Platzieren Sie nach der Injektion den Kopf der Maus zwischen den Halteplatten eines speziell angefertigten stereotaktischen Halters, der an das Mikroskop und den Anästhesiegasinhalator angepasst ist.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Atembewegungen die Bildgebung nicht beeinträchtigen. Ziehen Sie die Halteplatten fest, um die Haut zwischen den Ohren und dem Kopf zu dehnen. Überprüfen Sie die Stabilität.

Durch leichtes Drücken des Kopfes mit einer Zange sollte sich der Kopf nicht bewegen. Stellen Sie dann sicher, dass das Tier normal atmet. Um die Maus auf die Zwei-Photonen-Bildgebung vorzubereiten, tragen Sie mit einem Finger 70% Ethanol auf das Haar der Kopfhaut auf und achten Sie darauf, die Augen zu vermeiden.

Legen Sie dann ein Tuch mit einem Ausschnitt an, um die Kopfhaut freizulegen. Schneiden Sie anschließend mit einer sterilen Schere und Zange die Haut und entfernen Sie die Kopfhaut vollständig von der Rückseite des Scheitelknochens bis zum Stirnbein. Halten Sie einen Abstand von drei Millimetern zu Augen und Ohren ein, um starke Blutungen zu vermeiden.

Entfernen Sie das lose Bindegewebe oder die Knochenhaut, die den Schädel bedeckt. Waschen Sie dann mit einem warmen, mit PBS getränkten Papiertuch die restlichen Haare aus, wie hier gezeigt. Tragen Sie mit einer kleinen Nadel chirurgischen Kleber auf den gesamten Umfang eines Gummirings mit einem Durchmesser von 10 Millimetern auf.

Lege dann den Gummiring mit einem weiteren PBS-getränkten Papiertuch direkt auf den Schädel. Reinigen Sie die Innenseite des Rings ein letztes Mal. Fügen Sie warmes PBS hinzu, um den Schädel vollständig einzutauchen.

Platzieren Sie dann die stereotaktische Halterung unter dem Ziel. Sobald die Maus an Ort und Stelle ist, verwenden Sie das Mikroskop-Okular mit direkter Übertragung, um den Schädel zu betrachten und ihn grob im Sichtfeld des Mikroskops zu positionieren. Klicken Sie oben links im Fenster der Imaging-Software auf Live-Erfassung.

Ein Live-Scan des Gewebes wird in der Mitte des Fensters mit der Richtungssteuerung des Mikroskops in der Software angezeigt. Lokalisieren Sie einen Bereich mit CFP- und Rod-Domine-Signal, um den Fokus anzupassen. Stellen Sie dann die Laserleistung auf ein Minimum ein, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis bei minimalem Lichtschaden zu erzielen.

Klicken Sie anschließend in der Software auf die Registerkarte Kanal und erhöhen Sie die Verstärkungsleistung der PMTs für jeden NDD, um Photobleiche und Lichtschäden zu reduzieren, und klicken Sie dann auf die entsprechende Registerkarte, um die Aufnahmeeinstellungen auf Einzelscannen mit einer Pixelverweilzeit von 1,58 Mikrosekunden und einer Auflösung von 512 x 512 Pixeln mit einer 1,5-fachen Vergrößerung einzustellen. Sobald die Aufnahmeparameter eingestellt sind, klicken Sie auf den Live-Aufnahmebefehl und untersuchen Sie das Gewebe, um ein gewünschtes x-, y- und z-Feld auszuwählen, das in Echtzeit überwacht werden soll. Dabei wird ein Feld gewählt, das sowohl Gefäß- als auch Parenchymbereiche umfasst.

Klicken Sie auf Hinzufügen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit bis zu drei zusätzlichen Feldern, um alle gewünschten Koordinaten zu registrieren.

Die Koordinaten werden auf der Registerkarte Positionen neben angezeigt, um die Software anzuweisen. Um einen Stapel von Bildern mit drei DZ aufzunehmen, klicken Sie auf der Registerkarte "Positionen" in der Software auf "Verschieben nach", um zur ersten registrierten Position zu gelangen, und wählen Sie Zack im oberen linken Feld der Software aus. Dadurch wird die Registerkarte "Z-Stapel" geöffnet, zur höchsten Z-Position gewechselt und die Laserleistung entsprechend angepasst.

Klicken Sie auf Zuletzt einstellen und bewegen Sie sich dann in die tiefste Position. Passen Sie die Laserleistung an. Klicken Sie dann zuerst auf Setzen.

Die Dicke der Stack-Analyse sollte schnell an die untersuchte Zelle angepasst werden. Bewegliche Zellen gehen schnell aus dem Französischen, daher müssen Sie einen dickeren Stapel erwerben. Dann erwerben Sie für sich langsam bewegende Zellen.

Wählen Sie im oberen linken Feld den Befehl Zeitreihe aus, um die Registerkarte Zeitreihe zu öffnen. Legen Sie die Anzahl der Zyklen und das Zeitintervall fest. Dabei wird alle 30 Sekunden für 60 Zyklen ein Volume erfasst.

Dies entspricht 30 Minuten in Echtzeit. Um die Zeitrafferbildgebung im Hauptfenster zu starten, wählen Sie während des gesamten Vorgangs Experiment starten und überwachen Sie das Tier weiter, um sicherzustellen, dass es bewusstlos ist. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Objektiv richtig eingetaucht ist.

Nachdem die Sequenz erfasst wurde, verwenden Sie eine Pipette, um warmes PBS hinzuzufügen. Beginnen Sie dann mit einer zweiten 30-minütigen Akquise. Wenn während der Erfassung ein fortschreitendes Verschwinden des Signals zu beobachten ist, prüfen Sie, ob PBS-Lecks vorhanden sind.

Nachdem alle erforderlichen Videos aufgezeichnet und eine Datenanalyse durchgeführt wurde, wie im Begleitdokument beschrieben, um die Knochenmarkphysiologie durch intravitale Bildgebung zu untersuchen, wurde einer transgenen Mac-Maus mit 2 Millionen Dalton-Stäbchen-Domine-Dextran injiziert und durch Zwei-Photonen-Laserscanning-Mikroskopie abgebildet. Wie in diesem Video gezeigt, ist in der resultierenden Mikroaufnahme das mit 2 Millionen Dalton-Stäbchen-Domine-Dextran gefärbte Gefäßsystem in rotem Knochen dargestellt, das in Blau dargestellt ist und durch die zweite harmonische Generation sichtbar ist. ECFP-positive Monozyten, die in Cyan dargestellt sind, befinden sich in parenchymalen Nischen, die als dunkle Bereiche zwischen Gefäßen und Knochen gesehen werden, und innerhalb der Gefäße.

Um die individuelle Zelltrajektorie zu berechnen, wurde eine Zeitrafferbildgebung durchgeführt. Dieses Video zeigt das Migrationsverhalten von parenchymalen Monozyten. Das ECFP-Signal ist in Cyan und die Migrationspfade für jeden roten Fleck erscheinen in grün.

Hier ist das Wanderverhalten von vaskulären Monozyten zu sehen. Diese Daten können verwendet werden, um sowohl die mittlere Geschwindigkeit als auch die mittlere quadratische Verschiebung der Zellen zu berechnen. Es ist zu beachten, dass die vaskulären Monozyten im Vergleich zu parenchymalen Monozyten sowohl eine erhöhte Verschiebung als auch eine erhöhte Geschwindigkeit aufweisen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Knochenmarkmonozyten von Mäusen in vivo mit Hilfe von zwei Fotobildern nach seiner Entwicklung verfolgt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, um die Zellmigration und -interaktion im Knochenmark zu erforschen, das einen sehr wichtigen Ort der Hämatopoese darstellt, aber auch andere grundlegende Funktionen wie Antigen-Priming und immunologisches Gedächtnis