Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zu untersuchen, wie gewebebesiedelnde Zellen die Fähigkeit vaskulärer endothelialer Zellen beeinflussen, die Rekrutierung von Leukozyten während einer Entzündung zu unterstützen. Dies wird erreicht, indem zunächst Kokulturen von endothelialen Zellen mit mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung eines von zwei in-vitro-Vaskularmodellen etabliert werden: dem Mikroschieber-Modell und dem Filter-Modell. Diese Kulturen werden anschließend vor dem Durchflussassay mit Zytokinen behandelt.

Das strömungsbasierte Aian-System wird dann schrittweise unter Modifikationen, die je nach verwendetem Modellsystem vorgenommen werden, zusammengesetzt. Im letzten Schritt werden Leukozyten über die Endothelzellen perfundiert und deren Rekrutierung aus der Strömung sowie ihr anschließendes Verhalten beobachtet. Letztendlich haben diese multizellulären, strömungsbasierten Adhäsionsassays gezeigt, dass eine Interaktion zwischen mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen die Rekrutierung von Neutrophilen während einer Entzündung unterdrückt.

Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich des Leukozyten-Traffickings beantwortet werden, beispielsweise wie Gewebe-residente Zellen wie mesenchymale Stammzellen diesen Prozess verändern. Verändert sich dieser Vorgang bei Erkrankungen wie chronischer Entzündung oder Krebs? Können wir dieses Wissen nutzen, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln? Beginnen Sie damit, Kokulturen von Endothelzellen mit mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung des Mikro-Objektträger-Modells oder des Filter-Modells gemäß dem schriftlichen Protokoll aufzubauen, um das Durchflusssystem zusammenzustellen.

Schalten Sie zuerst den Heizer ein und stellen Sie ihn auf 37 Grad Celsius. Befestigen Sie dann eine 20-Milliliter-Spritze ohne Kolben sowie eine 5-Milliliter-Spritze an einem Dreiwegehahn. Messen und schneiden Sie anschließend ein langes Stück 2,4-Millimeter-Schlauch auf die ungefähre Entfernung zwischen dem Ventil und dem Dreiwegehahn zu.

Schneiden Sie ein 8 bis 10 Millimeter langes Stück 1,3-Millimeter-Schlauch ab und führen Sie es in eines der Enden des dicken Schlauchs ein. Befestigen Sie das Ende des dicken Schlauchs an dem Drei-Wege-Hahn und verbinden Sie den dünnen Schlauch mit einem Anschluss des elektronischen Drei-Wege-Mikroventils, um das Spülreservoir zu bilden.

Befestigen Sie dann das Ventil mit Micropore-Klebeband an der Plexiglaskammer. Gießen Sie anschließend ein sechs bis acht Millimeter langes Stück dickes und dünnes Schlauchmaterial und führen Sie das dünne Schlauchende in eines der Enden des dicken Schlauchs ein. Bringen Sie das Ende des dicken Schlauchs an einer 2-Milliliter-Spritze ohne Kolben an.

Verbinden Sie nun das dünne Schlauchende der 2-Milliliter-Spritze mit einem Anschluss des elektronischen Mikroventils, um das Probenreservoir herzustellen. Danach messen und schneiden Sie ein langes Stück dünnes Schlauchmaterial ab, dessen Länge der Distanz zwischen dem Mikroventil und der Mitte des Mikroskoptischs entspricht. Bei dem Mikroobjektträgermodell wird am Ende des dünnen Schlauchs ein 8 bis 10 Millimeter langes Stück dicken Schlauchs angebracht.

Danach einen L-förmigen Verbinder an das Ende des dicken Schlauchs anbringen. Dieser wird mit dem Mikroschlitten oder dem Filtermodell verbunden. Ein 8 bis 10 Millimeter langes Stück Portex-Blau-Schlauch für den Manometeranschluss an das Ende des dünnen Schlauchs anschließen.

Bringen Sie anschließend das dünne Schlauchende auf das Mikroventil auf. Der Schlauch wird zum gemeinsamen Ausgang für die Wasch- und Probenreservoirs. Befüllen Sie die Reservoirs mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die Rinderserumalbumin enthält.

Kurzes PBSA spült das Schlauchsystem, um Luftblasen zu entfernen; anschließend wird der Manometerschlauch an eine 50-Milliliter-Glasspritze angeschlossen. Während am Mikroschieber-Modell nur ein 10 bis 12 Millimeter langes Stück dickes Schlauchmaterial an das Ende des Manometerschlauchs angebracht wird, das zur Glasspritze führt, wird ein T-förmiger Verbinder an das Ende des dicken Schlauchs gesetzt.

Spülen Sie die Spritze, indem Sie sie mit 10 Milliliter PBSA füllen. Drehen Sie die Spritze um, sodass das mit dem Schlauch verbundene Ende nach oben zeigt, und drücken Sie alle Luftblasen heraus, bevor Sie erneut mit fünf Milliliter PBSA auffüllen. Schließlich setzen Sie die Glasspritze in eine Spritzenpumpe zur Infusion und Entnahme ein.

Stellen Sie die Nachfüllrate und den Durchmesser der Glas-Spritze ein, um die Mikro-Objektträger für den Durchfluss einzurichten. Platzieren Sie den Mikro-Objektträger auf dem Objekttisch eines invertierten Phasenkontrastmikroskops. Drehen Sie das Dreiweg-Hahn, um PBSA durch die Zulaufschläuche laufen zu lassen.

Verbinden Sie den L-förmigen Anschluss mit dem Einlasshafen eines Mikrokanals. Bringen Sie anschließend den L-förmigen Anschluss der Spritzenpumpe in den Auslasshafen des Kanals ein. Reinigen Sie jegliches PBSA, das auf den Mikrokanal getropft ist.

Alternativ schneiden Sie für das Filtermodell zunächst mithilfe einer Metallschablone ein Stück Parafilm in der gleichen Größe wie die Glasdecke. Anschließend schneiden Sie mit der Metallschablone einen 20 mal vier Millimeter großen Schlitz in das Parafilm, um den Strömungskanal zu erzeugen. Verwenden Sie die Paraform-Dichtung, um den Strömungskanal auf der Glasdecke zu markieren.

Richten Sie die Kanten des Sechsfilters auf dem Glasdeckel aus. Achten Sie darauf, dass der Filter die Markierungen des Flusskanals vollständig abdeckt. Schneiden Sie den Filter vorsichtig mit einem Skalpell vom Typ 10 aus.

Decken Sie den Filter anschließend vorsichtig mit einer Paraform-Dichtung ab und stellen Sie sicher, dass der Durchflusskanalschlitz in der Mitte des Filters liegt. Verwenden Sie ein sauberes Papiertuch und drücken Sie alle Luftblasen heraus. Legen Sie nun den Deckgläser in die Aussparung der unteren Platte der Plexiglas-Durchflusskammer.

Platzieren Sie die obere Plexiglasplatte über der Dichtung und schrauben Sie die Platten zusammen. Drehen Sie das Dreiwegventil, um den PBSA-Waschpuffer durch das Ventil fließen zu lassen. Schließen Sie anschließend den Manometeranschluss an die Einlassöffnung der oberen Plexiglasplatte an.

Führen Sie PBSA durch den Flusskanal, um Blasen den Durchtritt zu ermöglichen. Anschließend verbinden Sie das Manometerröhrchen der Spritzenpumpe mit der Auslassöffnung der Plexiglasplatte. Entfernen Sie jegliches PBSA, das auf die obere Platte der Kammer getropft ist.

Schließlich wird die Kammer auf den Objekttisch eines invertierten Phasenkontrastmikroskops gestellt und die Fokussierung so eingestellt, dass die endothelialen Zellen oberhalb der Filter sichtbar werden, um Leukozyten über die endothelialen Zellen zu perfundieren. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf Nachfüllen und drücken Sie „Start“, sobald die Fokussierung abgeschlossen ist. Um die endotheliale Zellschicht sichtbar zu machen, geben Sie zwei Milliliter gereinigter Neutrophile in das Probenreservoir und lassen Sie diese zwei Minuten lang erwärmen.

Waschen Sie das Endothel anschließend zwei Minuten lang mit PBSA. Öffnen Sie das Ventil, um die Neutrophilen über das Endothel zu perfundieren. Führen Sie die Neutrophilen-Bolusgabe vier Minuten lang durch.

Schalten Sie das Ventil aus und perfundieren Sie PBSA aus dem Waschbehälter für den Rest des Experiments. Stellen Sie während des Experiments sicher, dass keine Luftblasen zu irgendeinem Zeitpunkt während des Assays durchlaufen, da dies die endotheliale Zellschicht stören und zur Ablösung adhärenter Neutrophile führen würde. Nehmen Sie die Rekrutierung von Neutrophilen entweder während des Neutrophilenflusses oder nach der Perfusion mithilfe einer Software zur digitalen Bildaufnahme auf.

Bestimmen Sie die Mitte des Kanals, indem Sie das Objektiv an den Rand des Kanals am Einlassanschluss bewegen und die Mitte des Anschlusses identifizieren. Nehmen Sie digitale Aufnahmen von mindestens fünf bis zehn Feldern in der Mitte des Strömungskanals auf, während die Neutrophilen strömen. Machen Sie alle zehn Sekunden ein Bild eines einzelnen Feldes über eine Minute lang, bewegen Sie sich dann entlang des Kanals und nehmen Sie ein weiteres Feld eine Minute lang auf.

Wiederholen Sie diesen Vorgang während der gesamten Dauer des Bolus, um die Aufzeichnung nach der Perfusion durchzuführen. Nehmen Sie zehn Sekunden lang fünf bis 10 Felder in der Mitte des Strömungskanals auf, um das Verhalten der Leukozyten zu bewerten. Erstellen Sie innerhalb des zehnsekündigen Intervalls jede Sekunde ein Bild.

Dies bietet ausreichend Zeit, um Zellen aus der Strömung zu erfassen, und ermöglicht die Analyse des Verhaltens adhärenter Neutrophiler. Nehmen Sie ein einzelnes Feld mit mindestens 10 transmigrierten Neutrophilen fünf Minuten lang auf, wobei alle 30 Sekunden Bilder aufgezeichnet werden. Damit kann die Migrationsgeschwindigkeit der Zellen berechnet werden; nehmen Sie zusätzlich eine weitere Serie von zehnsekündigen Aufnahmenfeldern auf.

Dadurch erhalten die Neutrophilen Zeit, durch die endotheliale Monoschicht zu migrieren. Schließlich stoppen Sie die Spritzenpumpe, entfernen Sie das Auslassrohr und danach das Einlassrohr, bauen Sie die Durchflusskammer auseinander und spülen Sie das Probenreservoir mit PBSA aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang für nachfolgende Filter und Mikroobjektträgerkanäle, bevor Sie mit der Analyse der Leukozytenrekrutierung und -aktivität fortfahren, wie im Textprotokoll beschrieben. Im Mikroobjektträgermodell führte die Zytokinstimulation mit Tumor-Nekrose-Faktor-alpha zu einer signifikanten, dosisabhängigen Erhöhung der Neutrophilenadhäsion an das Endothel.

Außerdem wurde eine dosisabhängige Abnahme des Prozentsatzes an neutrophilen Zellen beobachtet, die auf der endothelialen Oberfläche rollen. Dies spiegelte sich in einem dosisabhängigen Anstieg des Prozentsatzes an neutrophilen Zellen wider, die durch die endotheliale Zellschicht migrieren und somit eine transendotheliale Migration durchlaufen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem filterbasierten Durchfluss-Assay beobachtet.

Beispielsweise erhöhte eine TNF-alpha-Stimulation die Neutrophilenadhäsion in dosisabhängiger Weise. Die Kokultur von Endothelzellen mit aus dem Knochenmark stammenden mesenchymalen Stammzellen verringerte die Neutrophilenadhäsion signifikant im Vergleich zu Endothelzellen, die allein kultiviert wurden, wie für das Mikroschiebemodell erwartet.

Auch hier wurden ähnliche Effekte beobachtet, als das Filter-basierte Modell verwendet wurde, wobei eine geringere Adhäsion in der Kokultur im Vergleich zur Monokultur festgestellt wurde. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man untersucht, wie Stromazellen mit endothelialen Zellen kommunizieren, um die Rekrutierung von Leukozyten während einer Entzündung zu beeinflussen.