Name: Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine Ndc10 und Ndc80 Erlaubt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Erfahren Sie eine Proteinreinigungsmethode zur Detektion von Sumoylierung und Ubiquitinierung der Kinetochor-Proteine Ndc10 und Ndc80 in Saccharomyces cerevisiae. Western Blot-Analyse bestätigt Modifikationen.

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Wir danken Dr. Oliver Kerscher für die Unterstützung und Beratung und den Mitgliedern des Basrai-Labors für ihre Unterstützung und Kommentare zum Papier. Diese Arbeit wurde vom Intramural Research Program der National Institutes of Health unterstützt.

1. Wachstum von Hefezellen, <ol><li> Inokulieren Hefezellen in 30 ml YPD (Tabelle 1) in einem kleinen Kolben. Inkubation bei 30 ° C über Nacht unter Schütteln. </li><li> Verdünne die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 0,2 bei 600 nm (OD 600 = 0,2) in 50 ml YPD und Inkubieren bei 30 ° C unter Schütteln inkubiert. </li><li> Die Kultur auf eine optische Dichte von 1,0 bei 600 nm (OD 600 = 1,0). </li><li> Centrifuge Zellen für 5 min bei 2.000 xg und den Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 40 ml sterilem Wasser und Zentrifuge für 5 min bei 2.000 xg, um die Zellen zu waschen. Überstand verwerfen und speichern Sie das Zellpellet bei -20 ° C. </li></ol> 2. Extraktion von Proteinen <ol><li> Die Zellen in 0,5 ml eiskaltem Guanidinpuffer (Tabelle 1) für die Pull-Down-Assay unter Verwendung von Ni-NTA-Superflow Perlen oder Puffer A (Tabelle 1) für die Immunfällung. Halten Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Transfer zu 2 ml Schraubverschluss Röhrchen. </li><li> In die gleiche Menge Glasperlen (Table of Materials). </li><li> Bead-schlagen, die Zellen in einem Mini Bead Beater (Table of Materials) für 2 Minuten bei Raumtemperatur, dann auf Eis legen für 2-3 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. </li><li> Wirbel mit hoher Geschwindigkeit bei 4 ° C für 30-60 min. Überprüfen Sie die Zellen durch Visualisierung unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, daß die Zellen lysiert. Hinweis: lysierten Zellen werden als dunkle Geister erscheinen und es fehlt ihnen eine Grenze oder definierte Form. In optimaler Weise mindestens 80% der Zellen lysiert werden sollte. </li><li> Punktion ein Loch in den Boden des Röhrchens mit einem Push-Pin und Ort in einer Sammlung enthalten 15 ml konischen Rohr (Schraubdeckel sollte locker sein). </li><li> Zentrifuge bei 1000 × g für 1 min, um das Lysat zu sammeln. </li><li> Transfer des Lysats auf einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 15.000 g für 30 min bei 4 ° C, um die extrahierten Proteine ​​zu sammeln. </li><li> Messung der Konzentration der extrahierten Proteine ​​mit dem Protein assay Kit (Table of Materials) und normalisieren extrakte, um die gleiche Menge an Protein enthalten. Bringen des Gesamtvolumens auf 1 ml mit einem geeigneten Puffer. Anmerkung: Etwa 5 mg Gesamtprotein aus 50 OD 600-Zellen erhalten. </li><li> Sparen Sie 50 ul (250 ug Protein, wenn das Gesamtprotein aus Schritt 2.10 extrahiert ist 5 mg) als Gesamtzellextrakt (WCE). Dann werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer (Tabelle 1) und Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. Last 10 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse). </li></ol> 3. Reinigung von HF-Smt3 Konjugate <ol><li> Besorgen Sie sich die Ni-NTA-Superflow-Perlen (Table of Materials) für die Versuche (100 &amp; mgr; l Kügelchen pro Probe) durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (800-1500 xg) für 1 min notwendig. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Wash Perlen 5x mit 1 ml PBS (Table of Materials): Invert top-Über-unten, bis die Kügelchen wieder suspendiert werden, sammeln Perlen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Aussetzen Kügelchen in 1 ml Guanidin-Puffer (Tabelle 1) und aliquotiert sie in der Anzahl der Rohre entsprechenden Proben zu verarbeiten. Sammle Perlen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. Mischen Sie die Perlen auch durch Umdrehen über top-bottom. Hinweis: Mischen Sie Perlen gut durch Umkehren oben über Boden. </li><li> Für jede Probe wird mit 950 &amp; mgr; l der verbleibenden WCE (aus Schritt 2.11: Extraktion der Proteine) zu 100 ul Ni-NTA Superflow Beads. </li><li> Inkubieren auf einer Schüttelplattform bei 4 ° C für mindestens 4 Stunden oder über Nacht. </li><li> Zentrifuge bei 800-1500 x g für 1 Minute bei 4 ° C. </li><li> Sparen Sie 50 ul als Überstand (SUP). Dann werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer und Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. Last 10 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-anallyse). </li><li> Wasch Kügelchen einmal mit 1 ml Guanidin-Puffer für 5-10 min auf einer Schwingplattform. </li><li> Wash Perlen 5x mit 1 ml Aufbruchpuffer (Tabelle 1) für 5-10 min auf einem Wippschüttler. </li><li> Resuspendieren Perlen in 90 ul 2x Laemmli-Probenpuffer. </li><li> Zugabe von 10 ul 1 M Imidazol. Hinweis: Imidazol hilft, die His-Tag-Protein aus der Ni-NTA-Perlen aufgrund konkurrierender Wechselwirkungen zwischen Imidazol und die Perlen zu distanzieren. </li><li> Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. </li><li> Vortex, dann bei 13.000 xg zentrifugieren für 30 Sekunden. Den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li><li> Last 10-20 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse). Anmerkung: 10-20 ul entspricht 0,5-1,0 mg Eingang, wenn 5 mg WCE verwendet. </li></ol> 4. Immunpräzipitation von Myc-markierten Proteine ​​Kinetochor <ol><li> Erhalten anti-c-Myc Agarose Affinitätsgel eintibody (Table of Materials) für die Versuche (25 ul Harz pro Probe) durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (800-1500 xg) notwendig. Entfernen Sie den Überstand. </li><li> Wash Harz 5x mit 1 ml Puffer A: Invert Top-über-Boden, bis das Harz suspendiert, sammeln Harz durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Aussetzen Harz in 1 ml Puffer A und aliquotiert sie in der Anzahl der Rohre entsprechenden Proben zu verarbeiten. Sammeln Harz durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. Hinweis: Mischen Sie das Harz auch durch Umkehren Top-über-Boden. </li><li> Add 950 ul der verbleibenden WCE (aus Schritt 2.11: Extraktion der Proteine) zu 25 &amp; mgr; l des Harzes. </li><li> Inkubieren auf einer Schüttelplattform bei 4 ° C über Nacht. </li><li> Zentrifuge bei 800-1500 x g für 1 Minute bei 4 ° C. </li><li> Sparen Sie 50 ul als Überstand (SUP). Dann werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer und Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. Load 10 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse). </li><li> Wash Harz 5x mit 1 ml Puffer A: Invert Top-über-Boden, bis das Harz suspendiert, sammeln Harz durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Resuspendieren des Harzes in 100 ul SUMEB Probenpuffer (Tabelle 1). Hinweis: SUMEB Probenpuffer enthält 8 M Harnstoff und 1% SDS (starke Denaturierung Bedingung). </li><li> Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. </li><li> Vortex, dann bei 13.000 xg zentrifugieren für 30 Sekunden. Den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li><li> Last 10-20 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse). Anmerkung: 10-20 ul entspricht 0,5-1,0 mg Eingang, wenn 5 mg WCE verwendet. </li></ol> 5. Western Blot-Analyse <ol><li> Laden Sie die Proteinextrakte auf 4-12% Bis-Tris-Gelen (Table of Materials) und perform Elektrophorese bei 120 V für 90 Minuten (Laufpuffer: Table of Materials). </li><li> Übertragen Sie die Proteine ​​aus Gel auf eine Nitrocellulosemembran (Table of Materials) mit einem Übertragungsgerät bei 30 V für 90 min (Transfer-Puffer: Table of Materials). </li><li> Blockieren die Membran in 5% Milch / 1x TBST (Tabelle 1) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Membran mit dem primären Antikörper (Table of Materials) in 5% Milch / 1x TBST über Nacht bei 4 ° C. Für primäre Antikörper, verwenden Sie eine Verdünnung von 1: 1000 (Anti-Flag und Anti-Ub-Antikörper) oder 1: 5000 (Anti-Myc-Antikörper). </li><li> Für jeweils 10 min mit 1x TBST waschen Membran 3x. </li><li> Inkubieren Membran mit Sekundärantikörper (Table of Materials) in 5% Milch / 1x TBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine 1: 5000 Verdünnung des sekundären Antikörper. </li><li> Für jeweils 10 min mit 1x TBST waschen Membran 3x. </li><li> Inkubieren Membran mit ECL working-Lösung (Table of Materials) für 5 min. </li><li> Setzen Sie die Membran auf blauempfindlichen Röntgenfilm (Table of Materials) und die Entwicklung unter Verwendung einer automatischen Entwickler (Table of Materials). </li></ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
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<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Epitop-Tags, wie HA, Myc, Flagge, und GST sind weit verbreitet für die biochemische Analyse von Proteinen verwendet. Konstruktion von Stämmen mit HF-Smt3 und Myc-markierten kinetochore Proteine ​​wie Ndc10 und Ndc80, erleichtert den Nachweis von PTMs wie sumoylation und Ubiquitinierung. HF-Smt3 Pulldown Assay erlaubt den Nachweis von sumoyliert Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80 (Abbildung 1). Der Affinitätsreinigungsprotokoll und Western Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Flag-Antikörper stellen...

Ubiquitinierung und sumoylation ermöglicht die Konjugation von Ubiquitin and Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO; Smt3 in S. cerevisiae 1) an ein Zielprotein auf. PTMs der Kinetochor-Proteinen beeinflussen ihre zellulären Ebenen und Protein-Protein-Interaktionen in verschiedenen Zellzyklusphasen treu Chromosomensegregation zu gewährleisten. Beispielsweise sind Zellebenen Cse4 / CENP-A und äußeren Kinetochorenprotein DSN1 durch Ubiquitin-vermittelte Proteolyse zur Sicherstellung Genomstabilität 2-5 geregelt. Destabilisierung der falsche Kinetochor-Mikrotubuli-Anhänge erfordert die Ipl1 / Aurora B-Kinase, die Dam1 und Ndc80 Komplexe, die direkt mit den Mikrotubuli interagieren 6-8 phosphoryliert. Obwohl die Identifizierung von mehr als siebzig kinetochore Proteinen gibt es sehr wenige Untersuchungen, die die Modifikationen dieser Proteine ​​mit PTMs zB Ubiquitin und SUMO untersuchen. Eine wichtige Einschränkung ist die Fähigkeit, die PTM zu bewahrens während der Reinigung und dem Mangel an individuelle Antikörper zum Nachweis von PTMs wie sumoylation, Phosphorylierung, Methylierung, und andere. Charakterisierung von sumoyliert Kinetochor-Proteinen Ndc10, Cep3, genutzt Bir1 und Ndc80 eine benutzerdefinierte Antikörpers 9. Zusätzlich hat Ndc10 als Substrat für Ubiquitinierung 10 in Verbindung gebracht. Menschliche Hec1 (Ndc80 in S. cerevisiae) wird auch für die Ubiquitinierung Substrat durch APC / C-hCdh1 E3-Ligase 11 geregelt. Daher Ndc10 und Ndc80 sind gute Kandidaten für die Optimierung des Protokolls sowohl sumoylation und Ubiquitinierung in S. erkennen cerevisiae. Um die Identifizierung von Sumoylierung zu erleichtern, konstruierten wir Stämme, die HF-Smt3 und Myc-tagged Ndc10 oder Ndc80 auszudrücken. Die Verwendung von Epitop-Tags (HF: His6-Flag) minimiert den Hintergrund aufgrund von Kreuzreaktivität, die häufig in polyklonales Serum gegen einen Kandidaten-Protein erzeugt wurden beobachtet. Wir entwickelten ein Protokoll zur Affinitätsreinigen HF-Smt3 Konjugate und dann verwendet kommerziellen anti-Flag und Anti-Myc-Antikörper, die Anwesenheit von sumolyated Ndc10 und Ndc80 im gereinigten Präparat Smt3 detektieren. Für Ubiquitinierung, entwickelten wir eine modifizierte Immunpräzipitationsprotokoll die Ubiquitinierung des Myc-tagged Kinetochor-Proteinen konserviert und Western Blot-Analyse durchgeführt, mit kommerziellen anti-Ub-Antikörper gegen Ubiquitinierung von Ndc10 und Ndc80 zu erkennen.

<table><tbody><tr><td>Glasperlen</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0,5 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8-Zell-Disruptor</td></tr><tr><td>Ni-NTA-Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc-Agarose-Affinitätsgel-Ameisenkörper, hergestellt im Kaninchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-Flag M2-Antikörper, hergestellt in Maus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Primärer Antikörper, Verdünnung 1:1.000</td></tr><tr><td>c-Myc-Antikörper (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Primärer Antikörper, Verdünnung 1:5.000</td></tr><tr><td>Gereinigter Maus-Antikörper monoklonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Primärer Antikörper, Verdünnung 1:5.000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) monoklonaler Antikörper</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Primärer Antikörper, Verdünnung 1:1.000</td></tr><tr><td>ECL Kaninchen IgG, HRP-linked whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Sekundärer Antikörper, Verdünnung 1:5.000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-linked Whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Sekundärer Antikörper, Verdünnung 1:5.000</td></tr><tr><td>DC Proteinassay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0,45 mm Porengröße</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gele</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1,0 mm, 10 well</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemilumineszenzsubstrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Blauer empfindlicher Röntgenfilm</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Entwickler</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404 50</td><td>mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

protein purification technik, die erkennung von sumoylierung und ubiquitinierung von bäckerhefe kinetochor proteine ​​ndc10 und ndc80 erlaubt

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translationale Modifikationen (PTMs), wie Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung, Ubiquitinierung und sumoylation, regulieren die zelluläre Funktion von vielen Proteinen. PTMs der Kinetochor-Proteinen, die mit Centromer-DNA assoziieren vermitteln treu Chromosomensegregation auf Genomstabilität zu gewährleisten. Biochemischen Ansätzen wie Massenspektrometrie und Western-Blot-Analyse werden am häufigsten für die Identifizierung von PTMs verwendet. Dabei wird ein Protein-Reinigungsverfahren beschrieben, das den Nachweis von sowohl sumoylation und Ubiquitinierung des kinetochore Proteinen Ndc10 und Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae ermöglicht. Ein Stamm, der zum Ausdruck bringt Polyhistidin-Flag-markierten Smt3 (HF-Smt3) und Myc-tagged Ndc10 oder Ndc80 wurde gebaut und für unsere Studien verwendet. Für den Nachweis von Sumoylierung erarbeiteten wir ein Protokoll zur Affinitätsreinigung His-Tag sumoyliert Proteinen durch Verwendung von Nickel Perlen und verwendet Western Blot-Analyse mit Anti-Myc-Antikörper zu erkennen sumoyliert Ndc10 einnd Ndc80. Für den Nachweis von Ubiquitinierung, entwickelten wir ein Protokoll für die Immunpräzipitation von Myc-markierte Proteine ​​verwendet und Western-Blot-Analyse mit anti-Ub-Antikörper zeigen, dass Ndc10 und Ndc80 werden ubiquitinierten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Epitop-markiertes Protein von Interesse in der His-Flag markiert Smt3 Stamm erleichtert den Nachweis mehrerer PTMs. Künftige Studien ermöglichen sollten Ausnutzung dieser Technik zur Identifizierung und Charakterisierung Protein-Wechselwirkungen, die abhängig von einem bestimmten PTM sind.

Zu sumoylation von kinetochore Proteine ​​Ndc80 und Ndc10 detektieren Stämme mit HF-Smt3 und Myc-markierten kinetochore Proteine ​​(Ndc80 oder Ndc10) konstruiert (Tabelle 2), wie zuvor beschrieben, 9,12. HF-Smt3 Konjugate wurden Affinität mit Ni-NTA-Perlen gereinigt. Western Blot-Analyse von gereinigtem HF-Smt3 mit einem Anti-Flag-Antikörper erlaubt Detektion sumoylierten Formen SUMO Substrate, die in dem Kontrollstamm ohne HF-Smt3 (1A und 1B, linkes Feld) ab...

Diese Handschrift beschreibt den Nachweis von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80, in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Sumylierung und Ubiquitinierung der kinetischen Kernproteine NDC 10 und NDC 80 aus Hefe (Budding Yeast) nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst Hefezellen geerntet werden, die His-Flag-markiertes SMT3 sowie MT-markiertes NDC 10 oder NDC 80 exprimieren, und anschließend Proteinextrakte aus diesen Zellen hergestellt werden. Im zweiten Schritt werden die His-Flag-markierten SMT3-Konjugate gereinigt, um die Sumylierung nachzuweisen, oder die MT-markierten kinetischen Kernproteine immunpräzipitiert, um die Ubiquitinierung zu detektieren.Anschließend wird Sumoylierung oder Ubiquitinierung durch eine Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Letztendlich bestätigt das Vorhandensein eines Laddering-Musters für NDC 10 und NDC 80, dass diese Proteine sumoyliert und ubiquitiniert sind. Die beschriebene Proteinreinigungsmethode ermöglicht den Nachweis sowohl der Sumoylierung als auch der Ubiquitinierung der konischen Proteine ND C 10 und NDC 80 in der Sprosspflanze Hefe sacro.Mein cci. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der von uns erzeugten Stammzelle, die zwei Epitop-Markierungen besitzt: eine an dem Testprotein und eine weitere, die den Nachweis der Expression ermöglicht. Die Verwendung dieser Markierungen verringert den Hintergrund durch Kreuzreaktivität, der häufig beobachtet wird, wenn polyklonales Serum verwendet wird.Die Demonstration dieses Verfahrens wird von Canero Uni, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter in meinem Labor, durchgeführt. Die Proteine von Interesse werden aus zuvor hergestellten und bei minus 20 Grad Celsius gelagerten Hefezellpellets extrahiert. Resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Milliliter eiskaltem Puffer.Verwenden Sie Guan-Puffer, wenn der Extrakt für einen Pull-down-Assay mit Nickel-Nitrilotriessigsäure oder Nickel-NTA-Superflow-Kügelchen verwendet wird. Verwenden Sie Puffer A, wenn der Extrakt für eine Immunpräzipitation bestimmt ist. Halten Sie die Röhrchen stets auf Eis.Überführen Sie die Zellsuspensionen auf zwei Milliliter. Schrauben Sie die Verschlusskappen auf jedes Röhrchen. Geben Sie ein Volumen an Glasperlen hinzu, das dem Volumen der Zellsuspension entspricht.Schlagen Sie die Zellen zwei Minuten lang in einem Mini-Bead-Beater bei Raumtemperatur und stellen Sie die Röhrchen anschließend zwei bis drei Minuten auf Eis. Wiederholen Sie den Bead-Beating- und Kühlvorgang dreimal. Vortexen Sie bei vier Grad Celsius mit hoher Geschwindigkeit für 30 bis 60 Minuten.Überprüfen Sie die Zellen durch mikroskopische Visualisierung, um sicherzustellen, dass die Zellen lysiert sind. Lysierte Zellen erscheinen als dunkle Geisterzellen und weisen keine Begrenzung oder definierte Form auf. Optimalerweise sollten mindestens 80 % der Zellen lysiert sein.Verwenden Sie anschließend einen Nadelpin, um ein Loch in den Boden des Röhrchens zu stechen. Setzen Sie die Schraubkappe locker auf und stellen Sie das Röhrchen in ein 15-Milliliter-Konischglas. Zentrifugieren Sie eine Minute lang mit 1000 × g.Um das Lysat zu gewinnen, überführen Sie das Lysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 15.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um die extrahierten Proteine zu pelletieren. Nach der Bestimmung der Konzentration der extrahierten Proteine mithilfe eines Protein-Assay-Kits, normalisieren Sie alle Extrakte, sodass jeder die gleiche Menge an Protein enthält. Stellen Sie das Gesamtvolumen mit dem geeigneten Puffer auf einen Milliliter ein.Etwa fünf Milligramm Gesamtprotein werden aus 50 OD 600 Zellen gewonnen. Heben Sie 50 Mikroliter des extrahierten Proteins als Gesamtzell-Extrakt auf. Die verbleibenden 950 Mikroliter Proteiniextrakt werden später für die Proteinreinigung oder die Immunpräzipitation von MT-markierten Proteinen verwendet.Fügen Sie 50 Mikroliter zweifach konzentrierten Probelösepuffer zu 50 Mikrolitern Zellgesamtextrakt hinzu. Inkubieren Sie die Proben drei bis fünf Minuten bei 100 Grad Celsius in einem Heizblock, bevor Sie sie mittels Western Blot analysieren. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die zur Reinigung erforderlichen Nickel-NTA-Superflow-Kügelchen vorbereiten.Die benötigte Menge an Kügelchen durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit für eine Minute gewinnen. Den Überstand entfernen und die Kügelchen mit PBS waschen. Ein Milliliter PBS hinzufügen und das Gefäß mehrmals umgestülpt, bis die Kügelchen resuspendiert sind.Sammeln Sie die Kügelchen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Kügelchen auf diese Weise insgesamt fünfmal. Suspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter Guanin-Puffer und portionieren Sie sie in die Anzahl an Röhrchen, die den zu verarbeitenden Proben entspricht.Sammeln Sie die Kügelchen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit und entfernen Sie den Überstand für jede Probe. Geben Sie 950 Mikroliter des zuvor hergestellten Zellgesamtextrakts zu 100 Mikrolitern der Kügelchen.Inkubieren Sie auf einer schwingenden Plattform bei vier Grad Celsius für mindestens vier Stunden oder über Nacht. Zentrifugieren Sie bei 800 bis 1500 ×g für eine Minute bei vier Grad Celsius. Heben Sie 50 Mikroliter des Überstandes auf.Fügen Sie 50 µL zweifach konzentrierten Probelösestoffpuffer zu diesem Überstand hinzu und inkubieren Sie drei bis fünf Minuten bei 100 °C in einem Wärmeprotokollblock. Später werden 10 µL jeder Probe mittels Western Blot analysiert. Waschen Sie die Nickel-NTA-Superflow-Perlen einmal mit einem Milliliter Guanin-Puffer fünf bis zehn Minuten lang auf einer schaukelnden Plattform bei Raumtemperatur.Als Nächstes waschen Sie die Kügelchen fünfmal mit je einem Milliliter Aufbrechpuffer. Nach dem letzten Waschschritt mit Aufbrechpuffer resuspendieren Sie die Kügelchen in 90 Mikrolitern 2x Laemmli-Probelösung. Geben Sie 10 Mikroliter einer einmolarigen Iolösung hinzu, um die Dissoziation des His-markierten Proteins von den Nickel-NTA-Kügelchen zu unterstützen. Inkubieren Sie drei bis fünf Minuten bei 100 Grad Celsius in einem Heizblock. Vortexen Sie anschließend und zentrifugieren Sie 30 Sekunden bei 13.000 × g.Überführen Sie das Überstand in ein frisches Gefäß. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die erforderliche Menge an Anti-Cmic-Aero-Affinitätsgele-Antikörper durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit gewinnen. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Harz mit Puffer A. Geben Sie ein Milliliter Puffer A hinzu und invertieren Sie das Gefäß mehrmals, bis das Harz resuspendiert ist.Sammeln Sie die Harzperlen durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie insgesamt fünfmal. Suspendieren Sie das Harz in einem Milliliter Puffer A und portionieren Sie es in die Anzahl an Röhrchen, die den zu verarbeitenden Proben entspricht.Sammeln Sie die Harzperlen durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 950 Mikroliter Zellgesamtextrakt zu 25 Mikrolitern Harz. Inkubieren Sie über Nacht auf einer schwingenden Plattform bei vier Grad Celsius und am folgenden Tag. Zentrifugieren Sie bei 800 bis 1500 × g für eine Minute bei vier Grad Celsius.Speichern Sie 50 Mikroliter des Überstandes. Geben Sie 50 Mikroliter 2x Laemmli-Probelösungspuffer zu diesem Überstand hinzu und inkubieren Sie drei bis fünf Minuten bei 100 Grad Celsius in einem Heizblock. Waschen Sie die Harzphase mit Puffer A, indem Sie ein Milliliter Puffer A hinzufügen und den Behälter mehrmals umgedreht von oben nach unten schwenken, bis das Harz resuspendiert ist.Sammlen Sie das Harz durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und entfernen Sie den Überstand, nachdem Sie den Überstand nach der letzten Waschung abgenommen haben. Resuspendieren Sie das Harz in 100 Mikrolitern Pufferpuffer, inkubieren Sie für drei bis fünf Minuten bei 100 Grad Celsius in einem Heizblock. Vortexen Sie anschließend und zentrifugieren Sie 30 Sekunden bei 13.000 ×g.Überführen Sie das Überstand in ein frisches Röhrchen. Zuletzt werden alle in diesem Protokoll gesammelten Proben auf ein SDS-Page-Gel für die Western-Blot-Analyse aufgetragen. Zur Detektion der Simulation von Kinetikoproteinen wurden Hefe-Stämme verwendet, die mit einem Polyhistidin-Flag-Tag markiertes SMT drei bzw. HF SMT drei sowie mit einem MT-Tag markiertes NDC 80 und NDC 10 exprimieren.HF SMT drei Substrate wurden mittels Nickelperlen affinitätsreinigt und mit einem Anti-Flag-Antikörper nachgewiesen. Sumoyliertes NDC 80 wurde in den HF SMT drei Substraten detektiert, wenn mit einem Anti-Myc-Antikörper probed wurde. Das Fehlen modifizierter Proteine in den Kontrollstämmen ohne HF SMT drei weist auf die Spezifität der Interaktion zwischen HF SMT drei und seinen Zielproteinen hin.Außerdem ist die Summation von NDC 80 und NDC 10 in NOCO desole behandelten Zellen verringert, um die Ubiquitinierung von NDC 80 und NDC 10 nachzuweisen. Mit Mick markiertes ND C 80 oder ND C 10 wurde immunpräzipitiert, und eine Western-Blot-Analyse wurde mit Anti-Mic- und Anti-Ubiquitin-Antikörpern durchgeführt. Die Analyse von Gesamtzelllysaten und Überstand bestätigte die Expression von NDC 80 M und NDC 10 M. Immunpräzipitierte Proben, die mit Anti-MIC untersucht wurden, zeigten mehrere Banden mit hohem Molekulargewicht, was darauf hindeutet, dass NDC 80 und NDC 10 posttranslationale Modifikationen enthalten. Ein Bandenmuster in immunpräzipitierten Proben, die mit Anti-Ubiquitin untersucht wurden, zeigte, dass ND C 80 und ND C 10 ubiquitiniert sind.Die Laddering-Muster von NDC 80 und NDC 10 wurden durch die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG 132 verstärkt. Dies bestätigt weiter, dass es sich hierbei um Polyubiquitinierung handelt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der Proteinreinigungstechnik besitzen, die die Detektion der Modifikation und Impfung von bat NN ermöglicht.

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Vergleichende Strategien zur Nachweisung der Uquitination in Säugetierzelllysaten unter Verwendung von SMAD2/SMURF2 als Modell

Erfahren Sie eine Proteinreinigungsmethode zur Detektion von Sumoylierung und Ubiquitinierung der Kinetochor-Proteine Ndc10 und Ndc80 in Saccharomyces cerevisiae. Western Blot-Analyse bestätigt Modifikationen.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt (Video) | JoVE Journal

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

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