Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Simulation und Ubiquitinierung der knospenden kinetischen Kernproteine der Hefe, NDC 10 und NDC 80, zu detektieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Hefezellen geerntet werden, die Hiss-Flagge exprimieren, die mit SMT 3 und MT markiert sind, NDC 10 oder NDC 80, und Proteinextrakte aus diesen Zellen hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht in der Aufreinigung von Hiss-Flag-markierten SMT-3-Konjugaten für den Nachweis der Summation oder der Immunpräzipitation von Mik-Tagg-kinetischen Kernproteinen für den Nachweis der Ubiquitinierung.

Anschließend wird die Summierung oder Ubiquitinierung durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Letztendlich bestätigt das Vorhandensein eines Leitermusters für NDC 10 und NDC 80, dass diese Proteine simuliert und ubiquitiniert sind. Das beschriebene Proteinaufreinigungsverfahren ermöglicht den Nachweis sowohl der Simulation als auch der Ubiquitinierung der Connico-Proteine ND C 10 und NDC 80 im knospenden Hefesakro.

Mein cci. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der von uns entwickelte Stamm zwei Epitopangriffe hat, einen auf das Testprotein und den anderen, der den Nachweis der Simulation ermöglicht. Die Verwendung dieser Tags reduziert den Hintergrund aufgrund der Kreuzreaktivität, die häufig bei der Verwendung von polyklonalem Serum beobachtet wird.

Die Demonstration dieses Verfahrens wird von Canero Uni, einem Forschungsstipendiaten in meinem Labor, durchgeführt. Die interessierenden Proteine werden aus Hefezellpellets extrahiert, die zuvor hergestellt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert wurden. Resus, suspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern eiskaltem Puffer.

Verwenden Sie Guine-Puffer, wenn der Extrakt für einen Pull-Down-Assay mit Nickelnitril-, Triessigsäure- oder Nickel-NTA-Superflow-Kügelchen bestimmt ist. Verwenden Sie Puffer A, wenn der Extrakt für die Immunpräzipitation bestimmt ist. Halten Sie die Röhren immer auf Eis.

Übertragen Sie die Zellsuspensionen auf zwei Milliliter. Schrauben Sie zwei Verschlüsse an jedes Röhrchen. Fügen Sie ein Volumen Glasperlen hinzu, das dem Volumen der Zellsuspensionsperle entspricht.

Schlagen Sie die Zellen in einem Mini-Rührbesen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur und legen Sie die Röhrchen dann für zwei bis drei Minuten auf Eis. Wiederholen Sie das Schlagen und Glasieren der Perlen dreimal. Vortex auf hoher Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten.

Überprüfen Sie die Zellen durch Visualisierung unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen lysiert sind. Lysierte Zellen erscheinen als dunkle Geister und haben keine Grenze oder definierte Form. Optimalerweise sollten mindestens 80% der Zellen gelegt werden.

Als nächstes stichst du mit einer Stecknadel ein Loch in den Boden des Rohrs. Setzen Sie den Schraubverschluss locker auf und legen Sie das Röhrchen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Eine Minute lang bei 1000 mal G zentrifugieren.

Um das Lysat zu sammeln, überführen Sie das Lysat in eine Mikrozentrifugenröhrchenzentrifuge bei 15.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um die extrahierten Proteine zu sammeln. Nachdem Sie die Konzentration der extrahierten Proteine mit einem Protein-Assay-Kit gemessen haben, normalisieren Sie alle Extrakte so, dass jeder die gleiche Menge an Protein enthält. Bringen Sie das Gesamtvolumen mit dem entsprechenden Puffer auf einen Milliliter.

Ungefähr fünf Milligramm Gesamtprotein werden aus 50 OD 600 Zellen gewonnen. Bewahren Sie 50 Mikroliter des extrahierten Proteins als Ganzzellextrakt ein. Die restlichen 950 Mikroliter Proteinextrakt werden später für die Proteinreinigung oder Immunpräzipitation von MT-markierten Proteinen verwendet.

Geben Sie 50 Mikroliter von zwei x laly Probenpuffer zu den 50 Mikrolitern Ganzzellextrakt. Inkubieren Sie die Proben drei bis fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius in einem Wärmeblock, bevor Sie sie mit einem Western Blot analysieren. Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Vorbereitung der für die Reinigung erforderlichen Nickel-NTA-Superflow-Kügelchen.

Ermitteln Sie die benötigte Menge an Kügelchen durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Kügelchen mit PBS. Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und drehen Sie das Röhrchen von oben nach unten um, bis die Kügelchen wieder aufgewirbelt sind.

Die Kügelchen werden durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit aufgefangen und der Überstand entfernt. Waschen Sie die Perlen auf diese Weise insgesamt fünfmal. Die Kügelchen werden in einem Milliliter Guineenpuffer suspendiert und in die Anzahl der Röhrchen aliquotiert, die den zu verarbeitenden Proben entspricht.

Sammeln Sie die Kügelchen durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und entfernen Sie den Überstand für jede Probe. Fügen Sie 950 Mikroliter des gesamten Zellextrakts hinzu. Früher auf 100 Mikroliter der Kügelchen vorbereitet.

Inkubieren Sie auf einer schaukelnden Plattform bei vier Grad Celsius für mindestens vier Stunden oder über Nacht. Zentrifugieren Sie bei 800 bis 1500 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius. Sparen Sie 50 Mikroliter des Überstands.

Geben Sie 50 Mikroliter von zwei x laly Probenpuffer zu diesem Überstand und inkubieren Sie bei 100 Grad Celsius in einem Wärmeblock für drei bis fünf Minuten. 10 Mikroliter jeder Probe werden später mit Western Blot analysiert. Waschen Sie die Nickel-NTA-Superflow-Kügelchen einmal mit einem Milliliter Guine-Puffer für fünf bis 10 Minuten auf einer Schaukelplattform bei Raumtemperatur.

Als nächstes waschen Sie die Kügelchen fünfmal mit einem Milliliter Brechpuffer, nach dem letzten Waschen mit Brechpuffer resuspendieren Sie die Kügelchen in 90 Mikrolitern von zwei x Laly Probenpuffer. Fügen Sie 10 Mikroliter eines molaren Iols hinzu, um das his markierte Protein vom Nickel NT zu trennen. Eine Kugel inkubiert bei 100 Grad Celsius in einem Wärmeblock für drei bis fünf Minuten. Der Vortex zentrifugiert dann 30 Sekunden lang bei 13.000 mal G.

Den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie die erforderliche Menge an Anti-CMIC-Aero-Affinitätsgel-Antikörpern durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit. Entfernen Sie den Überstand, waschen Sie das Harz mit Puffer A. Fügen Sie einen Milliliter Puffer A hinzu und drehen Sie von oben nach unten, bis das Harz wieder suspendiert ist.

Das Harz wird durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit aufgefangen und der Überstand entfernt. Waschen Sie insgesamt fünfmal. Das Harz wird in einem Milliliter Puffer A suspendiert und in die Anzahl der Röhrchen aliquotiert, die den zu verarbeitenden Proben entspricht.

Das Harz wird durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit aufgefangen und der Überstand entfernt. Fügen Sie 950 Mikroliter Ganzzellextrakt zu 25 Mikrolitern Harz hinzu Inkubieren Sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer schaukelnden Plattform. Zentrifugieren Sie bei 800 bis 1500 mal G für eine Minute bei vier Grad Celsius.

Sparen Sie 50 Mikroliter des Überstands. Gib 50 Mikroliter von zwei x hellen Probenpuffer zu diesem Überstand und inkubiere bei 100 Grad Celsius in einem Heizblock für drei bis fünf Minuten. Waschen Sie das Harz mit Puffer und fügen Sie einen Milliliter Puffer hinzu, wobei Sie die Oberseite über die Unterseite umkehren, bis das Harz wieder suspendiert ist.

Sammeln Sie das Harz durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und entfernen Sie den Überstand, nachdem Sie den Überstand aus der Endwäsche entfernt haben. Resuspendieren Sie das Harz in 100 Mikrolitern Sume-Probenpuffer und inkubieren Sie bei 100 Grad Celsius in einem Wärmeblock für drei bis fünf Minuten. Der Vortex zentrifugiert dann 30 Sekunden lang bei 13.000 mal G.

Den Überstand in ein frisches Röhrchen umfüllen. Laden Sie abschließend alle Proben, die aus diesem Protokoll entnommen wurden. Auf einer SDS-Seite, Gel für die Western-Blot-Analyse, wurden Hefestämme, die Polyhistamin-Flag exprimieren, die mit SMT drei oder HF SMT drei und MT markiert sind, NDC 80 und NDC 10 exprimieren, verwendet, um die Simulation von Kinetico-Proteinen nachzuweisen.

HF SMT drei Substrate wurden mit Hilfe von Nickelkügelchen affinitätsgereinigt und mit einem Anti-Flag-Antikörper detektiert. Die Summe von NDC 80 wurde in den drei Substraten des HF-SMT detektiert, wenn es mit einem Anti-Mikrofon-Antikörper untersucht wurde. Das Fehlen modifizierter Proteine in den Kontrollstämmen ohne HF SMT drei deutet auf die Spezifität der Interaktion zwischen HF SMT drei und seinen Zielproteinen hin.

Darüber hinaus wird die Summierung von NDC 80 und NDC 10 in NOCO-desolebehandelten Zellen reduziert, um die Ubiquitinierung von NDC 80 und NDC 10 nachzuweisen. Mick-markiertes ND C 80 oder ND C 10 wurde immunpräzipitiert und eine Western-Blot-Analyse wurde mit Anti-MIC- und Anti-Ubiquitin-Antikörpern durchgeführt: Die Analyse des Ganzzellextrakts und des Überstands bestätigte die Expression von NDC 80 M und NDC 10 M. Immunpräzipitierte Proben, die mit Anti-MIC untersucht wurden, zeigten mehrere Banden mit hohem Molekulargewicht, was darauf hindeutet, dass NDC 80 und NDC 10 posttranslationale Modifikationen enthalten. Ein Leitermuster von immunpräzipitierten Proben, die mit Anti-Ubiquitin untersucht wurden, zeigte, dass ND C 80 und ND C 10 ubiquitiniert sind.

Die Laddering-Muster von NDC 80 und NDC 10 wurden durch die Behandlung mit einem Proteasom-Inhibitor MG 1 32 verstärkt. Weitere Bestätigung, dass diese Polyubiquitinierung darstellen Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis der Proteinreinigungstechnik haben, die den Nachweis der Mation und Impfung von Fledermaus-NN ermöglicht.