Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, menschliche Inventuren aus Darmgewebe zu generieren. Dazu wird zunächst die Darmschleimhaut vom darunter liegenden submukösen Gewebe getrennt. Der zweite Schritt besteht darin, die Schleimhaut mit EDTA zu inkubieren, um die Dissoziation des Epithels vom Bindegewebe zu fördern.

Als nächstes werden die Darmkrypten vom dissoziierten Epithel getrennt. Schließlich werden die Darmkrypten in einer Basalmembranmatrix kultiviert. Letztendlich werden immunhistochemische Techniken verwendet, um die epitheliale Organisation sowie spezifische epitheliale Marker der kultivierten OIDs zu zeigen.

Die Implikation dieser Methode ist die Tatsache, dass wir jetzt OIDs aus patientenspezifischen Biopsien generieren können, was bedeutet, dass wir dieses Gewebe jetzt im Labor verwenden können, um Darmerkrankungen und Diagnosen zu untersuchen, was wir bisher noch nicht konnten. Nach der Vorbereitung der Puffer und Reagenzien gemäß dem Textprotokoll tauen Sie die Basalmembran auf Eis auf und inkubieren Sie eine 24-Well-Platte in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, wenn das Gewebe aufgenommen wurde. Verwenden Sie KO's PBS ohne Kalzium und Magnesium oder DPBS, um das Gewebe zu waschen, bis das DPBS klar ist.

Legen Sie das Gewebe in eine mit eiskaltem DPBS gefüllte Petrischale aus silikonbeschichtetem Glas, mit der Schleimhautseite nach oben und mit Minuchinnadeln, die das Gewebe durch Dehnen und Feststecken sichern. Verwenden Sie anschließend unter einem Präpariermikroskop eine Mikro-Präparierschere und eine fein gekrümmte Pinzette, um die darunter liegende Schleimhaut aus der Submukosa und dem Bindegewebe zu entfernen. Dehnen Sie dann mit der Schleimhautseite nach oben die präparierte Schleimhaut und stecken Sie sie flach auf die silikonbeschichtete Glas-Petrischale.

Kratzen Sie mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig über die Oberfläche der Schleimhaut. Dieser Schritt ist notwendig, um die Qualität der Zubereitung zu verbessern. Bedecken Sie die Schleimhaut mit frisch zubereitetem zwei millimolaren EDTA-Chelatpuffer.

Nachdem Sie das Gewebe drei- bis viermal gemäß dem Textprotokoll unter einem Präpariermikroskop auf Eis gewaschen haben, kratzen Sie mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig die Schleimhaut ab, um die Darmkrypten mit einer Pipette freizugeben. Entfernen Sie vorsichtig die Kryptensuspension aus der Petrischale und geben Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Überprüfen Sie dann das Gewebe, um sicherzustellen, dass fast alle Krypten von der Schleimhaut entfernt wurden.

Filtern Sie die Kryptensuspension zweimal durch einen 150-Mikrometer-Filter und verwenden Sie ein Mikroskop, um den Durchfluss zu überprüfen. Nach dem Waschen der Kryptensuspension und dem Übertragen der benötigten Anzahl von Krypten in ein Fünf-Milliliter-Rundbodenröhrchen gemäß dem Textprotokoll zentrifugieren Sie die Kryptenfraktion 10 Minuten lang bei 150 G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand mit vorgekühlten Pipettenspitzen und Basalmembranmatrix Resuspend. Das Gruft-Pellet.

Tragen Sie 50 Mikroliter Crypt-Suspension in der Basalmembranmatrix pro Vertiefung auf die vorwarme Platte auf, indem Sie die Basalmembranmatrix in der Mitte der Vertiefung langsam auswerfen. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator, um eine vollständige Polymerisation der Basalmembranmatrix zu ermöglichen. Überlagern Sie dann die Basalmembranmatrix mit 500 Mikrolitern vollständigem humanen Mini-Darmmedium, ergänzt mit je 2,5 Mikromolaren CHIR 9 0 2 2 1.

Und Thien inkubiert das Gewebe und wechselt das Medium nach zwei Tagen, danach jeden zweiten Tag. Diese Abbildung zeigt ein typisches Beispiel für frisch isolierte Krypten aus ganzem Gewebe. Die Anzahl der Krypten, die aus einer Biopsie isoliert werden, ist kleiner als im ganzen Gewebe.

In der Regel werden zwei Biopsiestiche in einem einzigen Durchgang durchgeführt. Jeder Biopsiestich ergibt eine 10 Quadratmillimeter große Oberfläche mit durchschnittlich 50 bis 100 Crups pro Biopsie. Nach fünf bis sechs Tagen Kultur und Basalmembranmatrix runden sich die Crips zu Enterosphären für den Dünndarm und Kolonkugeln für den Dickdarm auf und werden nach sieben Tagen passageiert.

Die hier gezeigten Enters oder OIDs, die aus Biopsien gebildet wurden, durchlaufen bei der Aussaat die gleiche Entwicklung bei geringerer Dichte. Daher erfolgt die Verpackung in der Regel nach 10 bis 12 Tagen in Kultur. Wie hier gezeigt, weisen sowohl OIDs als auch OIDs eine luminale Seite auf und sind mit einem Epithel ausgekleidet.

Proliferative Zellen können innerhalb der OIDs beobachtet werden und befinden sich in den Knospenspitzen. Die konfokale Bildgebung von OIDs, die mit e Catrin gefärbt wurden, hier in grün, zeigt die Epithelzellen. Diese Abbildung zeigt das Wachstum eines Patienten mit Mukoviszidose und einer Tufting-Enteropathie aufgrund einer angeborenen Mutation im Gen des Epithelzelladhäsionsmoleküls.

Nach diesem Verfahren oder einer Methode wie real-time PCR oder westlichem Blut können zusätzliche Fragen zu einem Gen oder Prob von Interesse beantwortet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie menschliche Crips konsistent isolieren können, um in Ihrem Labor effizient Einträge generieren zu können, um Ihre patientenspezifischen Fragen zu beantworten.