Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen
7. März 2015
Reife Adipozyten können durch Dedifferenzierung eine reichhaltige Quelle für Stammzellen darstellen, was zu einer homogenen Population von Fibroblasten-ähnlichen Zellen führt. Der Kollagenaseverdau wird verwendet, um reife Adipozyten aus menschlichem Fett zu isolieren. Das Ziel unseres Protokolls ist es, multipotente, dedifferenzierte Fettzellen aus humanen reifen Adipozyten zu gewinnen.
Reife Depozyten besitzen die Fähigkeit, sich in vitro in Vorläuferzellen zu differenzieren. Dies wird durch die Sealkultur erreicht, eine Technik, bei der reife Zellen in einem Kolben kultiviert werden, der vollständig mit Medium gefüllt und auf dem Kopf stehend inkubiert wird. Die schwimmenden Zellen lagern sich am Kolben an und verändern ihre Morphologie von einer runden, lipidgefüllten Zelle hin zu einer langgestreckten, fibroblastenähnlichen Zelle. Homogen.
Populationen von länglichen Zellen können gewonnen und verarbeitet werden, sobald die Gewebeproben im Labor eingegangen sind. Wiegen Sie das Fettgewebe abhängig von der benötigten Anzahl an Adipozyten ab und geben Sie eine geeignete Menge der Probe in ein 50-ml-Gefäß. Bei der Verdauung können Sie etwa 1 Million Zellen pro Gramm Gewebe erhalten.
Deckkulturansätze werden mit 500.000 Zellen pro 25 cm²-Flasche und 50.000 Zellen pro Vertiefung einer Sechs-Vertiefungs-Platte durchgeführt; fügen Sie KRH-Arbeitspuffer, der mit Kollagenase ergänzt wurde, hinzu, zerkleinern das Gewebe mit einer Schere und inkubieren die Zubereitung 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Während der Inkubation bereiten Sie die Schlauch- und Spritzenanordnung vor. Gießen Sie die durchsichtige Lösung mithilfe einer Pinzette durch ein Nylonnetz in einen Plastikbecher.
Reiben Sie die Zellpräparation durch die Masche und waschen Sie sie vorsichtig mit fünf ml KRH-Arbeitspuffer. Überführen Sie die filtrierte Zellsuspension in ein 50-ml-Gefäß mit Röhrchen und Spritze. Lassen Sie die reifen Adipozyten etwa 10 Minuten lang stehen.
Die Zellen erreichen durch Aufschwimmen die Spitze der Pufferlösung. Aspirieren Sie langsam den Puffer von unten. Geben Sie mithilfe einer Spritze und Schlauch 20 ml KRH-Arbeitspuffer zum Waschen hinzu.
Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal. Sammeln Sie das Puffermedium, um die Adipozytensuspension auf ein Endvolumen von fünf ml einzustellen, und zählen Sie anschließend die Zellen mithilfe eines Hämozytomters. Füllen Sie einen T25-Flasche zu drei Vierteln ihres Volumens mit D-MEM-F12, das mit 20 % Kälberserum ergänzt wurde. Überführen Sie 500.000 reife Adipozyten in die Flasche. Auffüllen der Flasche mit Medium und Entfernen von Luftblasen von der Oberfläche.
Schrauben Sie einen eigens angefertigten Verschluss auf den Kolben. Inkubieren Sie den Kolben für eine Woche verkehrt herum in einem Zellkultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Vermeiden Sie Bewegungen des Kolbens, da verbleibende Blasen die Zelladhärenz stören könnten.
Legen Sie einen Deckglaser auf den Boden der Vertiefungen. Fügen Sie die Kunststoffhülse in die Vertiefung ein und füllen Sie diese mit acht ml Medium. Achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen.
Legen Sie ein Deckglas auf die Hülse, wobei ein Zwischenraum verbleiben sollte, um die Pipettenspitze einzuführen. Probieren Sie 50.000 Zellen ab und injizieren Sie sie, indem Sie die Spitze zwischen Deckglas und Hülse platzieren. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für eine Woche oder weniger.
Abhängig vom experimentellen Design sind mindestens drei Tage erforderlich, damit die Zellen in einer anderen Platte an dem Deckglas haften. Inkubieren Sie die Deckgläser in zwei Milliliter Medium. Im Anschluss können die Deckgläser in der Fortführung der Kultur für Immunfluoreszenzexperimente oder für DNA-RNA- und Proteinextraktionen in Formalin fixiert werden.
Die Differenzierung reifer Adipozyten führt zu erheblichen Veränderungen in der Zellmorphologie. Während dieses Prozesses verlieren Adipozyten ihr Phänotyp und verringern die Expression von Transkripten, die gewöhnlich mit ihrer Lipidspeicherfunktion assoziiert sind. Dieses Immunfluoreszenzbild zeigt Fettzellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung.
Die Zellen mit der runden Morphologie exprimieren weiterhin FABP4, einen Marker für reife Adipozyten, während die langgestreckten Zellen diesen gemäß der Literatur nicht mehr exprimieren. Differenzierte Fettzellen, oft als D-Fettzellen bezeichnet, können von jungen, älteren, schlanken oder adipösen Patienten gewonnen werden. Ihre langfristige Kulturkapazität und ihre nachgewiesene Multipotenz.
Ich schätze auch ihr Potenzial für das Gewebegengineering und die Zelltherapie. Sie könnten ein neues Modell für die gezielte Untersuchung der Physiologie von Adipozyten darstellen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie untersucht die Dedifferenzierung reifer Adipozyten in multipotente Stammzellen. Mithilfe von Kollagenase-Digestion und der Abdeckplatten-Kulturtechnik können Forscher diese Zellen isolieren und kultivieren, um eine homogene Population fibroblastenähnlicher Zellen zu erhalten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Stammzellforschung
- Adipozytenbiologie
- Zellkultivierungstechniken
Hintergrund
- Reife Adipozyten können sich in Vorläuferzellen zurückentwickeln.
- Dieser Prozess kann in vitro mithilfe spezifischer Kultivierungsmethoden durchgeführt werden.
- Die Isolierung von Adipozyten ist entscheidend für die Gewinnung von Stammzellen.
- Die Kollagenaseverdauung ist eine Standardmethode zur Zellisolierung.
Zweck der Studie
- Gewinnung von multipotenten, dedifferenzierten Fettzellen aus menschlichen reifen Adipozyten.
- Entwicklung eines Protokolls zur Isolierung und Kultivierung dieser Zellen.
- Untersuchung der morphologischen Veränderungen während der Dedifferenzierung.
Verwendete Methoden
- Kollagenase-Digestion zur Isolierung reifer Adipozyten.
- Abdichtungs-Kultivierungstechnik zur Förderung der Dedifferenzierung.
- Beurteilung der Zellmorphologie zur Bestätigung der Dedifferenzierung.
- Quantifizierung der Zellausbeute basierend auf dem Gewebegewicht.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von etwa einer Million Zellen pro Gramm Fettgewebe.
- Die dedifferenzierten Zellen zeigten eine langgestreckte, fibroblastenähnliche Morphologie.
- Homogene Zellpopulationen wurden durch die beschriebenen Methoden gewonnen.
- Nachweis des Potenzials reifer Adipozyten als Quelle von Stammzellen.
Schlussfolgerungen
- Reife Adipozyten können effektiv in multipotente Stammzellen umgewandelt werden.
- Die beschriebenen Methoden bieten einen zuverlässigen Ansatz für die Stammzellforschung.
- Diese Studie trägt zum Verständnis der Adipozyten-Plastizität bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Dedifferenzierung reifer Adipozyten in multipotente Stammzellen bietet eine neuartige Quelle für Anwendungen in der regenerativen Medizin und Gewebeengineering. Dieser Ansatz ermöglicht die depotspezifische Charakterisierung der Funktion und metabolischen Eigenschaften von Adipozyten und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in der Forschung zu Stoffwechselerkrankungen. Die Methode stellt eine skalierbare Plattform zur Erzeugung fibroblastenähnlicher Zellen mit nachgewiesener Multipotenz bereit und erleichtert die Entwicklung präklinischer Modelle sowie die mechanistische Risikominimierung bei der entdeckungsorientierten Erforschung adipozytenbasierter Therapien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Adipozytenplastizität und die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Stoffwechselkrankheitswegen.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares System zur funktionellen Zielvalidierung durch depotspezifische Adipozytenisolierung.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Vorhersagegenauigkeit, indem homogene Populationen dedifferenzierter Zellen zur Aufklärung von Signalwegen erzeugt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe durch standardisierte Kollagenase-Digestion und Deckenkultur-Techniken vor.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch kontrollierte Adipozytenausbeute (etwa 1 Million Zellen pro Gramm Gewebe).
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht zuverlässige Wirkstoffevaluierung unter Verwendung fibroblastenähnlicher Zellen mit nachgewiesener Herabregulation von FABP4 als Differenzierungsmarker.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Entwicklung krankheitsrelevanter Systeme zur standortspezifischen Untersuchung der Adipozytenphysiologie.
- Operationaler Wert: Gewährleistet eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch die Langzeitkulturkapazität dedifferenzierter Fettzellen.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem die Multipotenz und das Gewebeengineering-Potenzial von D-Fettzellen aufgezeigt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zu präklinischen Studien, insbesondere für Programme im Bereich Stoffwechselerkrankungen und regenerative Medizin.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Hypothesenprüfung und biologische Risikominderung durch Modellierung der Adipozyten-Dedifferenzierung in vitro.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays und quantitative Ausgaben durch standardisierte Zellisolierung und Beurteilung der Morphologie.
- Analytik: Bietet messbare Messgrößen wie Veränderungen der FABP4-Expression, um Dedifferenzierungszustände unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung Schließt an die präklinische Kontinuität an durch nachgewiesene Langzeitkultur und Multipotenz dedifferenzierter Adipozyten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Ermöglicht eine wiederverwendbare Methode zur Gewinnung von adipocytenabgeleiteten Stammzellen in mehreren depotspezifischen Untersuchungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch Verringerung mechanistischer Uneindeutigkeiten beim Phänotypwechsel von Adipozyten.
- Operativer Wert: Standardisierung und Skalierbarkeit durch definierte Kollagenaseverdauung und invertierte Kultivierungsprotokolle.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch die Möglichkeit, depotspezifische metabolische Eigenschaften vor der Lead-Optimierung zu charakterisieren.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung durch validierte Beurteilung von Stammzellausbeute und Differenzierungspotenzial.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolation primärer Adipozyten und in Kollagenase-Digestions-Techniken.
- Setzt eine Zellkultur-Infrastruktur voraus, die in der Lage ist, Deckelkulturen in umgekehrten Flaschen oder 6-Well-Platten zu betreiben.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um eine konsistente Ausbeute an Adipozyten und eine vergleichbare Beurteilung der Dedifferenzierung zwischen verschiedenen Laboren zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn das Protokoll auf Fettgewebe aus verschiedenen Depotregionen oder mit unterschiedlichen Spendermerkmalen angewendet wird.
- Umfasst praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit einer exakten Befüllung des Kulturmediums, um Blasenbildung und damit verbundene Störungen während der umgekehrten Kultur zu vermeiden.
