Name: Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Lernen Sie die Dedifferenzierung reifer Adipozyten zu multipotenten Stammzellen durch Deckenkultur. Diese Methode liefert homogene fibroblastenähnliche Zellpopulationen für die Stammzellforschung.

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Diese Studie wurde unterstützt durch den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (371697-2011, AT). Die Autoren möchten sich für die Hilfe der bariatrischen Chirurgen Dr. S. Biron, F-S. bedanken. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau sowie Christine Racine und Caroline Gagnon von der IUCPQ Tissue Bank. Wir danken Herrn Jacques Cadorette von den audiovisuellen Diensten der IUCPQ für die Videodreharbeiten und -bearbeitung.

Ethics Statement: Das Projekt wurde von Forschungsethikkommission IUCPQ die vor der Rekrutierung von Patienten zugelassen. Für die Zwecke dieses Artikels / Video, erhalten wir Gewebe von 2 Patienten: 1) ein 62 Jahre alten männlichen Patienten mit einem BMI von 50,7 kg / m 2 und 2) eine 35-jährige Patientin mit einem BMI von 57 kg / m 2. Experimente können mit beiden Fettkompartimente geführt werden, sondern müssen eine Fettkammer für die Zwecke dieser Video beschränkt. Technische Aspekte der Video wurden mit Patienten-1 durchgeführt, und FABP4 Immunofluoreszenz wurde mit undifferenzierten Zellen von Patienten 2 durchgeführt. 1. Probenbearbeitung <ol><li> Frag Chirurgen Fettgewebe aus den omentalis und subkutane Fett Fächer bei der laparoskopischen Adipositaschirurgie zu sammeln. </li><li> Bringen schnell adipose Proben an das Labor bei RT und sofort verarbeitet. </li><li> Führen Verdauung im Labor, in einer nicht sterilen Atmosphäre. DieZellen werden schließlich zu dem Kulturraum überführt und unter sterilen Bedingungen kultiviert werden. Um Verunreinigungen zu vermeiden, bereiten KRH-Puffer mit destilliertem Wasser und filtriert, und folgen Sie durch eine Filtration (0,22 um Filter) vor dem Aufschluss. Gründlich reinigen Rohre mit Ethanol vor Transfer in die Zellkultur Haube für Kolben und Plattenherstellung. </li><li> Zeigen Fettgewebe auf einem bereits gewichtet Gericht und Rekordgewicht. Fix ein kleines Stück von jeder Gewebeprobe (weniger als 1 cm 2) in 10% Formalin-Puffer bei Raumtemperatur mindestens 24 Stunden vor der Paraffineinbettung. Verwenden Sie diese eingebetteten Probe für die Immunhistochemie Experimente (Technik nicht gezeigt). </li><li> Stellen Sie ein weiteres Stück in einem 50-ml-Tube und Flash-freeze in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei -80 ° C für weitere Studien auf ganzen Fettgewebe (zB Genexpression - Technik nicht gezeigt). </li></ol> 2. Kollagenaseverdau <ol><li> Legen Sie die übrigen Fettgewebe Stück in einem 50 ml-tuist für die Verdauung. </li><li> 4 ml KRH-WB mit Collagenase (350 U / ml) ergänzt pro Gramm Probe in dem Aufschlußbehälter. </li><li> Hackfleisch Fettgewebe mit einer Schere. </li><li> Platzieren Hackfleisch Fettgewebe Suspension in einem Schüttler bei 37 ° C, 90 Upm maximale, für eine 45-minütige Inkubation (für 1 h). </li></ol> 3. Reinigung von Adipozyten und Präadipozyten <ol><li> Gießen Sie das durchscheinende Lösung mit wenigen Stücke von Fett durch ein 400 &amp; mgr; M Nylon Netz in einen Kunststoffbecher. </li><li> Mit Pinzette, reiben Sie die Zellpräparation auf der Nylon-Mesh und wäscht mit 5 ml KRH-WB. </li><li> Die filtrierte Zellsuspension in ein 50 ml Röhrchen mit dem Kunststoffschlauch in ihm und einer 60 cm³-Spritze am Rohrglied befestigbar zart zu übertragen. </li><li> Lassen Sie die Suspension mit reifen Fettzellen stehen für etwa 10 Minuten, so dass die Zellen an die Spitze des Puffers durch Flotation zu erreichen. </li><li> Langsam absaugen Puffer am Boden des Röhrchens mit 60cc syringe Absaugung. </li><li> 20 ml KRH-WB zu waschen. Wiederholen Sie ab Schritt 3.4 für 2 zusätzliche Wäschen. </li><li> Sammeln Sie den Puffer, um die Adipozyten Suspension bis zu einem Endvolumen von 5 bzw. 10 ml zu bringen, abhängig von der Zellmenge. Verfolgen Sie mit den Schritten in Abschnitt 5. </li><li> Wiederherstellen des Stroma-Kreisfraktion aus der mit dem 60 cm³-Spritze durch Zentrifugation (3000 rpm, RT, 5 min) zur weiteren primären Zellkultur gesammelt falls Puffer (Technik nicht gezeigt). </li></ol> 4. Mature Adipocyte Zellzahl <ol><li> Last 10 ul sanft geschüttelt Adipozyten-Suspension in einer Zählkammer (Hämozytometer). Führen Zellzahl in vierfacher Ausfertigung. </li><li> Berechnung der Anzahl der isolierten reifen Zellen. </li></ol> 5. Mature Adipocyte Dedifferenzierung in T-25-Kolben <ol><li> Ein 25 cm 2 Zellkulturflasche auf das Volumen mit DMEM / F12-20% Kälberserum ¾ füllen. </li><li> Nach Zellzahl, gießen 500.000 reifen Zellen in den Kolben. </li&gt; <li> Der Kolben wird komplett mit einem 50 ml Röhrchen mit Medium Füllen Sie und entfernen Sie so viele Blasen wie möglich. </li><li> Schrauben Sie den unbelüfteten Kappe auf den Kolben. </li><li> Der Kolben wird mit Ethanol vor der Inkubation zur Vermeidung von Verunreinigungen zu säubern. </li><li> Die Flasche auf den Kopf für eine Woche Inkubation ohne es zu berühren, um eine Bewegung in der Kultur, die Zelladhärenzfaktor stören könnten. </li><li> Vor der Umkehr des Kolbens bei 7 Tagen nach der umgekehrten Kultur vorsichtig die Flasche zu manipulieren und entfernen Sie alle Medium im Kolben durch Aspiration, die Vermeidung abrupter Bewegungen. </li><li> Fügen Sie 12 ml DMEM-F12-20% Kälberserum und pflegen Zellen mit Standardtechniken. Eine gefilterte, belüfteten Kappe kann in den Kolben gegeben werden. </li></ol> 6. Mature Adipocyte Dedifferenzierung in einer 6-Well-Platte <ol><li> Legen Sie ein Deckglas auf dem Boden jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen </li><li> Fügen Sie einen ½ &quot;Kunststoffbuchse auf der jeweils Deckglas. </li><li> Füllen Vertiefungen mit 8 ml 20% Kälberserum-DMEM Medium. </li><li> Setzen Sie ein Deckglas auf jedem Kunststoffbuchse. </li><li> Legen Pipettenspitze zwischen dem Schieber und dem Rohr, Zellen unter dem Objektträger zu injizieren (50.000 Zellen pro Vertiefung). </li><li> Platten in einem Standardzellkulturbrutschrank bei 37 ° C mit 5% CO 2 für eine Woche. </li><li> Reverse Deckglas mit anhaftenden Zellen in jeder Vertiefung, die 2 ml Medium mit 20% Kälberserum und verfolgen Kultur. </li><li> Verwenden Deck mit Zellen, die eine Dedifferenzierung für mehrere Zwecke, einschließlich Immunfluoreszenz (Technik nicht gezeigt). </li></ol>

<ol><li>Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceiling+culture+of+mature+human+adipocytes%3A+use+in+studies+of+adipocyte+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions.</a> J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Poloni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dedifferentiated+adipocytes+show+similar+properties+to+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).</li>
<li>Perrini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+and+cytokine+release+profiles+highlight+the+heterogeneity+of+distinct+subsets+of+adipose+tissue-derived+stem+cells+in+the+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans.</a> PLoS One. 8 (3), e57892(2013).</li>
<li>Kishimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoblastic+differentiation+ability+of+human+dedifferentiated+fat+cells+is+higher+than+that+of+adipose+stem+cells+from+the+buccal+fat+pad%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Investig%22%5BJournal%5D)">The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad.</a> Clin Oral Investig. , (2013).</li>
<li>Kou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+and+tissue-specific+nature+of+multipotent+cells+derived+from+human+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+and+human+white+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).</li>
<li>Sugawara, A., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+dedifferentiated+fat+cells+for+periodontal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration.</a> Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).</li>
<li>Kikuta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+effects+of+dedifferentiated+fat+cell+transplantation+in+rabbit+models+of+bone+defect+and+ovariectomy-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis.</a> Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).</li>
<li>Obinata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+%28DFAT%29+cells+improves+urethral+sphincter+contractility+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model.</a> Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+fat+cells+convert+to+cardiomyocyte+phenotype+and+repair+infarcted+cardiac+tissue+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).</li>
<li>Ohta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+cells%2C+dedifferentiated+fat+cells+%28DFAT%29%2C+promoted+functional+recovery+from+spinal+cord+injury-induced+motor+dysfunction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats.</a> Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).</li>
<li>Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Navarrete%2C+JMF-r+%22Adipose+Tissue+Biology%22">Adipose Tissue Biology</a>. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).</li>
<li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+models+for+differentiation%3A+preadipocytes+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%22%5BJournal%5D)">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li>
<li>Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+an+adipose+tissue+depot+for+sampling%3A+factors+in+selection+and+depot+specificity%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity).</a> Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).</li>
<li>Tchernof, A., Despres, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+human+visceral+obesity%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of human visceral obesity: an update.</a> Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).</li>
<li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Watson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Markers+and+Functional+Attributes+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+and+Dedifferentiated+Adipocyte+Cells+from+Subcutaneous+Fat+of+an+Obese+Diabetic+Donor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor.</a> Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Entdifferenzierung von reifen Fettzellen mit der Decke Kulturtechnik ist ein neues Konzept für die Fettgewebestammzellen aus einer kleinen Probe von einheimischen Fettgewebe erhalten. Aufgrund unserer Erfahrungen und die der anderen 2 ist ein Gramm Gewebe ausreichend, um eine 25-cm 2-Kolben Platte und eine Bevölkerung von DFAT Zellen, für die Homogenität von Poloni und Mitarbeiter 3 gezeigt zu erhalten. Adipocyte Entdifferenzierung scheint mit Zellen von jedem Spender möglich, unabhängig...

Die In-vitro-Dedifferenzierung reifer Adipozyten wird durch eine Technik namens Deckenkultur1 erreicht. Aufgrund ihrer natürlichen Tendenz, in wässrigen Lösungen zu schwimmen, haften isolierte reife Adipozyten an der Oberfläche eines umgedrehten Kolbens, der vollständig mit Kulturmedium gefüllt ist. Im Laufe weniger Tage verändern die Zellen ihre kugelförmige Morphologie und werden zu fibroblastenähnlichen Zellen. Die daraus resultierenden Zellen, die als dedifferenzierte Fettzellen (DFAT) bezeichnet werden, sind multipotent2. Forschungsartikel zur Dedifferenzierung von Adipozyten, insbesondere an menschlichen Zellen, sind begrenzt. Sie haben jedoch bereits interessante Informationen über die Multipotenz, den Zellphänotyp und die Replikationskapazität von DFAT-Zellen geliefert2. Reife Adipozyten, die aus verschiedenen Fettkompartimenten stammen, wurden erfolgreich dedifferenziert, einschließlich solcher, die aus dem menschlichen viszeralen und subkutanen Fettgewebe stammen2-4. Zusätzlich zu diesen Depots nahmen Kishimoto und Mitarbeiter Proben von Fettgewebe aus den bukkalen Fettpolstern und dedifferenzierten Adipozyten in DFAT-Zellen5. Matsumoto und seine Mitarbeiter erzeugten erfolgreich subkutane DFAT-Zellen von Patienten unterschiedlichen Alters, und die Mehrheit der Zellen wies selbst nach 10 Passagen in Kultur2 eine hohe proliferative Rate und eine Seneszenz von weniger als 6 % auf.
DFAT-Zellen wurden erfolgreich in mehrere Linien redifferenziert, darunter adiogene, osteogene, chondrogene und neurogene Linien2,3,6. Diese Zellen exprimieren mehrere embryonale Stammzellmarker wie Nanog und die vier identifizierten pluripotenten Faktoren Oct4, c-myc, Klf4 und Sox23. Sie exprimieren auch Marker, die für jeden der drei Keimblätter spezifisch sind7. Darüber hinaus ähneln DFAT-Zellen aufgrund ihrer epigenetischen Signatur den aus dem Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (BM-derived MSC)3. Unter Ausnutzung der Stammzellkapazität von DFAT-Zellen haben viele Gruppen ihr Potenzial zur Behandlung oder Verbesserung verschiedener Krankheiten untersucht8,9. Verbesserungen pathologischer Zustände, wie z. B. gestörtes Herzgewebe, Rückenmarksverletzungen und Harnröhrenschließmuskeldysfunktion, wurden mit DFAT-Zellinjektionen in Rattenmodellen der Krankheit10-12 beobachtet. 
Zusätzlich zu den Stammzelleigenschaften von DFAT-Zellen könnten sie ein neues zelluläres Modell für Studien zur Adipozytenphysiologie darstellen. Zu diesem Zweck wird häufig die 3T3-L1-Zelllinie verwendet, da sich diese Zellen unter adipogener Stimulation in adhärente, lipidspeichernde Adipozyten differenzieren13. Diese Zellen stammen jedoch aus dem Gewebe von Mausembryonen13. Auch die Depotspezifität kann mit diesem Modell nicht untersucht werden und spiegelt möglicherweise nicht vollständig die Physiologie der menschlichen Adipozytenwider 14. Andere Laboratorien arbeiten mit isolierten Fettzellen aus murinen Fettdepots, aber die Fettverteilung ist bei Mäusen nicht dimorph und die anatomische Konfiguration der Bauchhöhle des Nagetiers verhindert eine direkte Extrapolation auf den Menschen15. Um Adipozyten im Rahmen der Physiopathologie der menschlichen Adipositas zu untersuchen, ist die Berücksichtigung der Körperfettverteilung und der Fettdepot-spezifischen Unterschiede unerlässlichgeworden 16. Einige Einschränkungen primärer Präadipozytenkulturen, einschließlich der Zellmengen aus Fettgewebebiopsieproben und ihrer Seneszenz nach einigen Passagen in Kultur, machten alternative Modelle erforderlich. Perrini und seine Mitarbeiter untersuchten die Depotspezifität in der Genexpression von DFAT-Zellen, die aus viszeralem und subkutanem Fett stammen, und verglichen sie mit aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) aus demselben Fettdepot. Sie zeigten, dass Unterschiede in der Genexpression und -funktion hauptsächlich zwischen den Depots als zwischen den Zelltypen zu finden sind, was darauf hindeutet, dass DFAT-Zellen physiologisch nahe an ASC aus demselben Depot sind. DFAT-Zellen könnten eine interessante Alternative zu verfügbaren Modellen für Studien zur Fettverteilung in der Pathophysiologie der menschlichen Adipositas darstellen. Darüber hinaus ist die Deckenkultur eine vielversprechende Methode, um adulte Stammzellen für Tissue Engineering-Zwecke zu gewinnen. 
Hier beschreiben wir den Kollagenase-Verdau, eine weit verbreitete Technik zur Isolierung reifer Adipozyten aus den subkutanen und/oder viszeralen Fettproben17, und die nachfolgenden Schritte zur Durchführung einer Deckenkultur und zur Dedifferenzierung dieser Zellen in multipotente, fibroblastenähnliche Zellen.

<table><tbody><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td></td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Glukose</td><td></td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ I</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS-004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, kein Phenolrot</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Zu Medium hinzufügen : 20% Kälberserum, Gentamicin (50 &; Mikro; g/ml) und Fungizone (2,5 & Mikro; g/ml)</td></tr><tr><td>Kälberserum, Eisenzusatz, von mit Säuglingsnahrung gefütterten Kälbern</td><td>Sigma</td><td>C8056-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>1/2 In Kunststoffbuchse</td><td>Iberville</td><td>2704-CP</td><td>Artikelnummer:1000120918 (Home Depot)</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formalin gelöster Stoff, neutral gepuffert, 10%</td><td>SIGMA</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc Spritzen</td><td>BD Spritze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffschläuche</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Ringer-Henseleit Stammpuffer (KRH)</td><td></td><td></td>Bereiten Sie den <td>Stoffpuffer wie folgt vor: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2,5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.</td></tr><tr><td>Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)</td><td></td><td></td><td>Geben Sie die folgenden Komponenten frisch zum KRH-Puffer: 4% Rinderserumalbumin, 5 mM Glukose, 0,1 &; Mikro; M Adenosin, 560 & Mikro; M Ascorbinsäure</td></tr><tr><td>KRH-WB, ergänzt mit Kollagenase</td><td></td><td></td> Typ I, <td>350 U/ml Kollagenase Typ I,</td></tr><tr><td>T25, unbelüftete Kappen-Gewebekulturflasche</td><td>Sarsted oder eine andere Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Gewebekulturplatte</td>, <td>BD Falcon oder eine andere Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas 22x22</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Becher</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation of human fettgewebestammzellen durch dedifferenzierung der reife adipozyten in decken kulturen

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Reife Adipozyten haben gezeigt, dass sie ihren Phänotyp in vitro durch eine Technik namens Deckenkultur in Fibroblasten-ähnliche Zellen umkehren. Reife Adipozyten können auch aus frischem Fettgewebe isoliert werden, um ihre Funktion und metabolischen Eigenschaften depotspezifisch zu charakterisieren. Hier beschreiben wir ein gut etabliertes Protokoll zur Isolierung reifer Adipozyten aus Fettgewebe mittels Kollagenase-Verdau und nachfolgende Schritte zur Durchführung von Deckenkulturen. Kurz gesagt, wird das Fettgewebe in einem Krebs-Ringer-Henseleit-Puffer inkubiert, der Kollagenase enthält, um die Gewebematrix zu stören. Schwimmende reife Adipozyten werden auf der Oberseite des Puffers gesammelt. Reife Zellen werden in einem T25-Kolben, der vollständig mit Medien gefüllt ist, plattiert und eine Woche lang kopfüber inkubiert. Ein alternativer 6-Well-Plattenkulturansatz ermöglicht die Charakterisierung von Adipozyten, die sich einer Dedifferenzierung unterziehen. Die Morphologie der Adipozyten ändert sich im Laufe der Zeit der Kultur drastisch. Die Immunfluoreszenz kann problemlos an Objektträgern durchgeführt werden, die in 6-Well-Platten kultiviert werden, wie die FABP4-Immunfluoreszenzfärbung zeigt. Das FABP4-Protein ist in reifen Adipozyten vorhanden, wird aber durch Dedifferenzierung der Fettzellen herunterreguliert. Die Dedifferenzierung reifer Adipozyten könnte einen neuen Weg für die Zelltherapie und das Tissue Engineering darstellen.

Wichtige morphologische Veränderungen auftreten, um Fettzellen während der Entdifferenzierung (Abbildung 1) zu reifen. Wie in Figur 2 gezeigt ist, wurden Zellen, die eine Dedifferenzierung mit einem Anti FABP4 Antikörper zur Fluoreszenz-Analyse gefärbt. Zellen mit einem runden Morphologie äußerte die FABP4 Protein, während die Mehrheit der Fibroblasten-ähnlichen Zellen nicht. Nach Entdifferenzierung kann DFAT Zellen mit Standardverfahren für mehrere Passagen kultiviert werden. Wir sind ...

Reife Adipozyten können durch Dedifferenzierung eine reichhaltige Quelle für Stammzellen darstellen, was zu einer homogenen Population von Fibroblasten-ähnlichen Zellen führt. Der Kollagenaseverdau wird verwendet, um reife Adipozyten aus menschlichem Fett zu isolieren. Das Ziel unseres Protokolls ist es, multipotente, dedifferenzierte Fettzellen aus humanen reifen Adipozyten zu gewinnen.

Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Reife Depozyten besitzen die Fähigkeit, sich in vitro in Vorläuferzellen zu differenzieren. Dies wird durch die Sealkultur erreicht, eine Technik, bei der reife Zellen in einem Kolben kultiviert werden, der vollständig mit Medium gefüllt und auf dem Kopf stehend inkubiert wird. Die schwimmenden Zellen lagern sich am Kolben an und verändern ihre Morphologie von einer runden, lipidgefüllten Zelle hin zu einer langgestreckten, fibroblastenähnlichen Zelle. Homogen.Populationen von länglichen Zellen können gewonnen und verarbeitet werden, sobald die Gewebeproben im Labor eingegangen sind. Wiegen Sie das Fettgewebe abhängig von der benötigten Anzahl an Adipozyten ab und geben Sie eine geeignete Menge der Probe in ein 50-ml-Gefäß. Bei der Verdauung können Sie etwa 1 Million Zellen pro Gramm Gewebe erhalten.Deckkulturansätze werden mit 500.000 Zellen pro 25 cm²-Flasche und 50.000 Zellen pro Vertiefung einer Sechs-Vertiefungs-Platte durchgeführt; fügen Sie KRH-Arbeitspuffer, der mit Kollagenase ergänzt wurde, hinzu, zerkleinern das Gewebe mit einer Schere und inkubieren die Zubereitung 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Während der Inkubation bereiten Sie die Schlauch- und Spritzenanordnung vor. Gießen Sie die durchsichtige Lösung mithilfe einer Pinzette durch ein Nylonnetz in einen Plastikbecher.Reiben Sie die Zellpräparation durch die Masche und waschen Sie sie vorsichtig mit fünf ml KRH-Arbeitspuffer. Überführen Sie die filtrierte Zellsuspension in ein 50-ml-Gefäß mit Röhrchen und Spritze. Lassen Sie die reifen Adipozyten etwa 10 Minuten lang stehen.Die Zellen erreichen durch Aufschwimmen die Spitze der Pufferlösung. Aspirieren Sie langsam den Puffer von unten. Geben Sie mithilfe einer Spritze und Schlauch 20 ml KRH-Arbeitspuffer zum Waschen hinzu.Wiederholen Sie die Waschschritte zweimal. Sammeln Sie das Puffermedium, um die Adipozytensuspension auf ein Endvolumen von fünf ml einzustellen, und zählen Sie anschließend die Zellen mithilfe eines Hämozytomters. Füllen Sie einen T25-Flasche zu drei Vierteln ihres Volumens mit D-MEM-F12, das mit 20 % Kälberserum ergänzt wurde. Überführen Sie 500.000 reife Adipozyten in die Flasche. Auffüllen der Flasche mit Medium und Entfernen von Luftblasen von der Oberfläche.Schrauben Sie einen eigens angefertigten Verschluss auf den Kolben. Inkubieren Sie den Kolben für eine Woche verkehrt herum in einem Zellkultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Vermeiden Sie Bewegungen des Kolbens, da verbleibende Blasen die Zelladhärenz stören könnten.Legen Sie einen Deckglaser auf den Boden der Vertiefungen. Fügen Sie die Kunststoffhülse in die Vertiefung ein und füllen Sie diese mit acht ml Medium. Achten Sie darauf, dass keine Blasen entstehen.Legen Sie ein Deckglas auf die Hülse, wobei ein Zwischenraum verbleiben sollte, um die Pipettenspitze einzuführen. Probieren Sie 50.000 Zellen ab und injizieren Sie sie, indem Sie die Spitze zwischen Deckglas und Hülse platzieren. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für eine Woche oder weniger.Abhängig vom experimentellen Design sind mindestens drei Tage erforderlich, damit die Zellen in einer anderen Platte an dem Deckglas haften. Inkubieren Sie die Deckgläser in zwei Milliliter Medium. Im Anschluss können die Deckgläser in der Fortführung der Kultur für Immunfluoreszenzexperimente oder für DNA-RNA- und Proteinextraktionen in Formalin fixiert werden.Die Differenzierung reifer Adipozyten führt zu erheblichen Veränderungen in der Zellmorphologie. Während dieses Prozesses verlieren Adipozyten ihr Phänotyp und verringern die Expression von Transkripten, die gewöhnlich mit ihrer Lipidspeicherfunktion assoziiert sind. Dieses Immunfluoreszenzbild zeigt Fettzellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung.Die Zellen mit der runden Morphologie exprimieren weiterhin FABP4, einen Marker für reife Adipozyten, während die langgestreckten Zellen diesen gemäß der Literatur nicht mehr exprimieren. Differenzierte Fettzellen, oft als D-Fettzellen bezeichnet, können von jungen, älteren, schlanken oder adipösen Patienten gewonnen werden. Ihre langfristige Kulturkapazität und ihre nachgewiesene Multipotenz.Ich schätze auch ihr Potenzial für das Gewebegengineering und die Zelltherapie. Sie könnten ein neues Modell für die gezielte Untersuchung der Physiologie von Adipozyten darstellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Lernen Sie die Dedifferenzierung reifer Adipozyten zu multipotenten Stammzellen durch Deckenkultur. Diese Methode liefert homogene fibroblastenähnliche Zellpopulationen für die Stammzellforschung.

Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

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