Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn
22. Dezember 2014
Unter Ausnutzung einer binären genetischen Strategie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verfolgung neuronaler Schaltkreise in Mäusen zur Verfügung, die komplementäre transsynaptische Tracer nach Cre-vermittelter Rekombination exprimieren. Da die zellspezifische Tracerproduktion genetisch kodiert ist, ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung des embryonalen Gehirns von Mäusen mit einer Einzelzellauflösung zu untersuchen.
Das Ziel des folgenden Experiments ist es, die Entwicklung neuronaler Schaltkreise im embryonalen Mausgehirn unter Verwendung von drei verschiedenen Zellmarkierungssystemen zu visualisieren, indem ein transsynaptischer Tracer verwendet wird, der sich bidirektional bewegt, ein zweiter Tracer, der sich nur retrograd bewegt, und ein dritter Marker, der nicht von der Zielzelle entfernt ist. Es ist möglich, das Zielneuron stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Neuronen zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass dieses experimentelle Protokoll verwendet werden kann, um die Bildung neuronaler Schaltkreise im embryonalen weiblichen Mausgehirn mit einer Einzelzellauflösung zu analysieren.
Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsneurowissenschaften zu beantworten, z. B. wann bestimmte neuronale Schaltkreise gebildet werden und wie sie während der Embryonalentwicklung organisiert sind. Diese Methode kann auch verwendet werden, um neuronale Schaltkreise in erwachsenen Mäusen zu verfolgen. Insbesondere kann es verwendet werden, um die synaptische Aktivität zwischen genetisch identifizierten Neuronen zu analysieren, und es kann verwendet werden, um zu analysieren, wie verschiedene experimentelle Bedingungen einen neuronalen Schaltkreis im Laufe der Zeit modulieren können.
Beginnen wir mit einer gerade eingeschläferten schwangeren Maus. Reinigen Sie die Bauchseite mit 70%igem Ethanol und machen Sie dann einen vertikalen Schnitt, um die Embryonen freizulegen. Entferne die Kette der Embryonen und übertrage sie in eine Schale mit eiskaltem PBS in der Schale.
Entnehmen Sie die einzelnen Embryonen mit einer abgestumpften Pinzette. Trennen Sie die einzelnen Embryonen in Lösung mit einer feinen Schere und Pinzette und entfernen Sie dabei überschüssiges Gewebe, wenn die Embryonen vollständig gereinigt sind. Entnehmen Sie von jedem Embryo eine kleine Schwanzbiopsie und geben Sie sie in ein Röhrchen mit Lysepuffer, um DNA für die Geschlechtsbestimmung und Genotypisierung zu sammeln.
Übertragen Sie dann den Embryo in frisch gemachte eiskalte, 4%ige PFA auf Eis. Lassen Sie jeden Embryo nach der Verarbeitung je nach Größe mindestens 1,5 Stunden lang unter Rühren im PFA inkubieren. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist.
Waschen Sie das fixierte Taschentuch dreimal mit eiskaltem PBS für mindestens fünf Minuten pro Waschgang. Übertragen Sie dann die Embryonen in eine 30%ige Saccharoselösung, die bei vier Grad Celsius aufbewahrt wird. Wenn das Gewebe vollständig in der Lösung versunken ist, fahren Sie mit der Kryosektion fort.
Beginnen Sie zunächst mit der Markierung einer Kryoform mit einem permanenten alkoholbeständigen Marker. Bereiten Sie anschließend eine Aufschlämmung aus zerstoßenem Trockeneis in 100%igem Ethanol in einem Eiskübel vor, indem Sie die Aufschlämmung in einem Glasbecherglas mit Isop Pentan etwa 10 Minuten abkühlen lassen. Entfernen Sie während des Wartens das Gewebe aus der Saccharoselösung und wischen Sie die überschüssige Saccharose mit einem handelsüblichen Labortuch ab.
Übertragen Sie dann das Gewebe in eine vorbeschriftete Kryoform. Mit genügend OCT, um das Gewebe zu bedecken. Bilden Sie im OCT keine Luftblasen, insbesondere nicht um das Gewebe herum.
Richten Sie das Gewebe anschließend mit einer federleichten Entomologie-Pinzette aus, um minimalen Schaden zu verursachen. Frieren Sie die Kryoformen im abgekühlten ISO-Pentanbad ein, ohne bei Bedarf Spritzer zu verursachen. Die gefrorenen Formen können eingewickelt und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, um die Formen zu schneiden.
Schneiden Sie sie in 14 Mikrometer dicke Serienabschnitte in Fünferreihen. Sammeln Sie jeweils fünf Scheibenserien auf einem Super Frost Plus Glasobjektträger. Achten Sie bei der Zubereitung der Lösung für dieses Protokoll darauf, den Tween 20 langsam zum TNT-Puffer zu geben, der frisch zubereitet werden muss.
Spülen Sie dann die Lösung langsam auf und ab, um sie zu mischen. Bei der Zubereitung des TNB-Puffers das Blockierungsreagenz langsam in kleinen Schritten unter Rühren hinzufügen. Anschließend die Lösung mit einem Wasserbad auf 55 Grad Celsius erhitzen.
Die Lösung wird milchig. Um nun mit der Arbeit am Gewebe zu beginnen, verwenden Sie zunächst ein Skalpell, um das überschüssige OCT zu entfernen, das die Gewebeabschnitte umgibt. Markieren Sie dann die Grenzen der einzelnen Abschnitte mit einem Pap-Stift
.Lassen Sie die Dias auf Zimmertemperatur kommen. Waschen Sie sie dann bei Raumtemperatur mit einem XPBS-Puffer, dreimal sollte jede Wäsche fünf Minuten lang sein. Als nächstes löschen Sie die endogene Peroxidaseaktivität, indem Sie die Objektträger eine halbe Stunde lang in eiskaltem, 0,3%igem Wasserstoffperoxid in Methanol inkubieren.
Folgen Sie mit drei Wäschen in PBS bei Raumtemperatur für fünf Minuten pro Waschgang. Inkubieren Sie dann die Objektträger 10 Minuten lang in PBST, um das Gewebe zu permatisieren. Waschen Sie die Objektträger dieses Mal dreimal mit TNT.
Blockieren Sie nun in einer befeuchteten Kammer das Gewebe mit genügend TNB, um jeden Objektträger zu bedecken. Lassen Sie den Block eine halbe Stunde bei Raumtemperatur ziehen. Lassen Sie die Objektträger nicht austrocknen.
Nach dem Entleeren des Blockierungspuffers wird der Objektträger vollständig mit dem primären Antikörper in TNB bedeckt, um den Tracer zu binden. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei RT oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Um den primären Antikörper zu entfernen, waschen Sie den Objektträger dreimal fünf Minuten lang pro Waschgang bei Raumtemperatur mit TNT.
Wenden Sie während dieser Wäschen etwas sanftes Rühren an. Inkubieren Sie anschließend die Abschnitte eine Stunde lang in der sekundären Antikörperlösung. Verwenden Sie später bei Raumtemperatur drei TNT-Waschungen, um den ungebundenen Sekundärantikörper zu entfernen.
Inkubieren Sie dann in einer befeuchteten Kammer das Gewebe in einem bis 100 gestreiften Have in konjugierter Meerrettichperoxidase in TNB für 30 Minuten bei Raumtemperatur, während Sie die Objektträger in TNT waschen. Nach der Inkubation eine frische Verdünnung der TSA-Lösung vornehmen. Tragen Sie nun die frisch hergestellte TSA-Verdünnung für genau 10 Minuten bei Raumtemperatur auf das Gewebe auf.
Der genaue Zeitpunkt der TSA-Inkubation ist entscheidend. Versuchen Sie daher nicht, zu viele Dias auf einmal in unserer Hand zu verarbeiten. Bis zu 10 Objektträger können in einem Arbeitsgang bearbeitet werden.
Zusätzliche Objektträger können im TNT-Waschpuffer warten, bis sie nach einer weiteren Waschrunde verarbeitet werden. Inkubieren Sie die Gewebe mit einem bis 500 Alexa Boden 5 46 abgestreift. Nehmen Sie es 30 Minuten lang in TNB konjugiert.
Entfernen Sie bei Raumtemperatur das abgestreifte Bewohnerkonjugat mit drei weiteren TNT-Bädern. Tragen Sie dann für die Kernfärbung 5%ige BIS-Benzalösung in PBS bei Raumtemperatur für 10 Minuten auf und entfernen Sie den BIS-Benzo-Fleck mit drei TNT-Wäschen. Montieren Sie dann die Objektträger mit Fluoro-Halterung G und fahren Sie mit der Analyse fort.
Unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurde die Reifung der neuronalen Schaltkreise, die die Fortpflanzungsachse regulieren, in Mäusen analysiert, die die R 26 BIZ- und die R 26 GTT-Allele trugen. Die Expression der Transgene wurde durch Creed-abhängige Rekombination in embryonalen Kisspeptin-Neuronen im Nucleus arcuatus aktiviert, wobei eine Kisspeptin-spezifische Creed-Treiberlinie verwendet wurde: doppelte Immunfluoreszenz für Kisspeptin in grün und BL in rot aus einem Kuss. IC R 26 BIZ.
Die Maus zeigt die Aktivierung von BL im KISS IC R 26 GTT, die doppelte Immunfluoreszenz der Maus zeigt KISSPEPTIN in grün und GTT aktiviert durch den Cree-Treiber in rot. Diese und andere Diagnosen zeigten, dass die Transgene in experimentellen Embryonen von E 18,5 funktionsfähig waren. Es wurde festgestellt, dass seine Pepin-Neuronen im Nucleus arcuatus bereits mit GNRH kommunizieren.
Neuronen, denen Z fehlte, war auf die CRE-exprimierenden Kisspeptin-Neuronen beschränkt, während BL transsynaptisch auf vor- und nachgelagerte Neuronen übertragen wurde. Einige, aber nicht alle. GNRH-Neuronen enthielten bl.
Daher ist nur eine Untergruppe der embryonalen GNRH-Neuronen synaptisch mit den Kisspeptin-Neuronen des Nucleus arcuatus verbunden. GNRH-Neuronen enthielten den retrograden Tracer nicht. GTT zeigt, dass diese Neuronen den Kisspeptin-Neuronen nachgeschaltet sind.
Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie nach diesem Verfahren an einem Tag durchgeführt werden. Andere Methoden wie die duale Immunfluoreszenz können verwendet werden, um die biochemische Natur verbundener Neuronen zu identifizieren. Diese Technik sollte Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und der Entwicklungsbiologie den Weg ebnen, die neuronale Konnektivität mit einer einzigen Zellauflösung sowohl während der Entwicklung als auch bei erwachsenen Tieren zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise bei Mäusen visualisieren können.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Verfolgung neuronaler Schaltkreise im embryonalen Mausgehirn mithilfe genetisch kodierter transsynaptischer Tracer vor. Die Methode ermöglicht die Visualisierung der Entwicklung neuronaler Schaltkreise mit Einzelzellauflösung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Neuronale Verschaltung
Hintergrund
- Das Verständnis der Entstehung neuronaler Schaltkreise ist entscheidend für die Entwicklungsneurowissenschaft.
- Transsynaptische Tracer ermöglichen die Untersuchung der neuronalen Vernetzung.
- Das embryonale Maushirn dient als Modell zur Erforschung der neuralen Entwicklung.
- Die zellspezifische Produktion von Tracern erlaubt eine gezielte Analyse.
Zweck der Studie
- Um die Entwicklung neuronaler Schaltkreise im embryonalen Mausgehirn sichtbar zu machen.
- Um die Organisation spezifischer neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung zu analysieren.
- Um ein Protokoll bereitzustellen, das sowohl für embryonale als auch für erwachsene Mäuse anwendbar ist.
Verwendete Methoden
- Nutzung von drei verschiedenen Zellmarkierungssystemen.
- Anwendung eines bidirektionalen transsynaptischen Tracers.
- Verwendung eines retrograden Tracers und einer nicht-wandernden Markierung.
- Analyse neuronaler Schaltkreise mit Einzelzellauflösung.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll identifiziert erfolgreich upstream- und downstream-Neurone.
- Die Ergebnisse belegen die Bildung neuronaler Schaltkreise im embryonalen weiblichen Mausgehirn.
- Die Methode kann synaptische Aktivität in genetisch identifizierten Neuronen analysieren.
- Sie ermöglicht die Untersuchung, wie experimentelle Bedingungen die neuronalen Schaltkreise über die Zeit beeinflussen.
Schlussfolgerungen
- Dieses experimentelle Protokoll eignet sich zur Untersuchung der Entwicklung neuronaler Schaltkreise.
- Es liefert Einblicke in die zeitliche Abfolge und Organisation neuronaler Schaltkreise.
- Die Methode ist vielseitig einsetzbar für die Analyse neuronaler Schaltkreise sowohl bei Embryonen als auch bei Erwachsenen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der Bildung neuronaler Schaltkreise während der embryonalen Entwicklung liefert mechanistische Einblicke in neurodevelopmentale Störungen und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in der Wirkstoffforschung für das zentrale Nervensystem. Dieser genetisch kodierbare transsynaptische Tracing-Ansatz ermöglicht die aktivitätsabhängige Kartierung synaptischer Verbindungen mit Einzelzellauflösung und bietet ein reproduzierbares System zur Absicherung therapeutischer Hypothesen im Zusammenhang mit der neuronalen Vernetzung. Durch den Verzicht auf stereotaktische Injektion verbessert die Methode die Standardisierung und Skalierbarkeit über verschiedene Entwicklungszeitpunkte und genetische Hintergründe hinweg und unterstützt so eine konsistente Assay-Vorbereitung für Target-Engagement-Studien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung der synaptischen Konnektivität zwischen genetisch definierten neuronalen Populationen während kritischer Entwicklungsphasen.
- Operationaler Wert: Bietet ein genetisch kodiertes, injektionsfreies System, das eine gleichmäßige Tracer-Expression sicherstellt und die Variabilität in Experimenten zur Schaltkreisabbildung verringert.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, aktivitätsabhängige transsynaptische Signalnachweise, die die funktionelle synaptische Kommunikation zwischen vorgeschalteten und nachgeschalteten Neuronen widerspiegeln.
- Operativer Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch Cre-abhängige, locus-spezifische Expression aus dem ROSA26-Locus und ermöglicht so die reproduzierbare Aufbereitung von Nervengewebe für nachfolgende Analysen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Risiken, indem Forscher verfolgen können, wie genetische oder pharmakologische Störungen die Bildung neuronaler Schaltkreise im Laufe der Zeit in krankheitsrelevanten embryonalen Modellen beeinflussen.
- Operationaler Wert: Bietet einen plattformkompatiblen Workflow, der in Immunfluoreszenz-, Genotypisierungs- und Bildgebungs-Pipelines integriert werden kann, um eine multiparametrische Validierung der Zielinteraktion durchzuführen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode unterstützt frühe Entdeckungsworkflows, indem sie eine hypothesengetriebene Schaltkreisabbildung vor der Identifizierung von Leitverbindungen ermöglicht, wobei die Ergebnisse die Zielvertrauenswürdigkeit und die Bereitschaft für phänotypische Bildschirmung in neurodevelopmentalen Programmen beeinflussen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die biologische Entrisikung, indem die Bildung und Reifung spezifischer neuronaler Schaltkreise – wie jener, die die Fortpflanzungsachse regulieren – mit Einzelzellauflösung sichtbar gemacht wird.
- Screening: Ermöglicht die Herstellung standardisierter, genetisch nachverfolgbarer neuronaler Systeme, die zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die synaptische Konnektivität im embryonalen oder adulten Gehirn geeignet sind.
- Analytik: Erzeugt quantitative, fluoreszenzbasierte Messgrößen (z. B. BL, GTT-Signalübertragung), die den Vergleich synaptischer Aktivität zwischen verschiedenen Bedingungen, Genotypen oder Entwicklungsstadien ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Schaltkreisbildung im Embryo mit der postnatalen Funktion, indem eine Längsschnittanalyse ermöglicht wird, wie frühe Entwicklungsstörungen die adulte neuronale Konnektivität beeinflussen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die dualen ROSA26-Knock-in-Stämme stellen eine wiederverwendbare genetische Plattform dar, die auf mehrere ZNS-Ziele und Krankheitsmodelle anwendbar ist, ohne dass wiederholte chirurgische Eingriffe erforderlich sind.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vorhersagevertrauen bei der Zielvalidierung, indem direkte, aktivitätsabhängige Nachweise der synaptischen Konnektivität zwischen genetisch definierten Neuronenpopulationen bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher und verringert technische Variabilität durch Cre-abhängige, lokuskontrollierte Expression, wodurch inkonsistente Injektionsergebnisse eliminiert werden.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Weiterentwicklung oder Abbruch bei der Auswahl zentralnervöser Zielstrukturen, indem frühzeitige Visualisierung zirkuitarer Effekte genetischer oder pharmakologischer Modulation ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem mechanistische Daten zur neuronalen Schaltkreisbildung generiert werden, die die Priorisierung von Zielstrukturen bei neurodevelopmentellen und psychiatrischen Indikationen leiten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Maus-Embryologie, Genotypisierung und Fluoreszenzmikroskopie für eine sachgemäße Handhabung, Einbettung und Signaldetektion von Embryonen.
- Setzt die Verfügbarkeit von Cre-Treiberlinien und fluoreszierenden Reportersystemen voraus, um zellspezifische Markierungen und multimodale Validierungen durchzuführen.
- Benötigt standardisierte Protokolle für Fixierung, Kryoschnitte und immunhistochemische Verfahren, um das Tracersignal zu erhalten und reproduzierbare Schnittqualität sicherzustellen.
- Die Übertragbarkeit auf andere Modellsysteme hängt von der Erhaltung der transsynaptischen Tracer-Funktionalität und der Promotorspezifität in nicht-murinen Arten ab.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die Abhängigkeit des Tracertransfers von synaptischer Aktivität, was die Empfindlichkeit in wenig aktiven oder unreifen Verschaltungen beeinträchtigen kann.
