Name: Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur bedingten genetischen transsynaptischen Tracing in embryonalen Mausgehirnen. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung neuronaler Schaltkreise mit Einzelzellauflösung.

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Wir danken Michael Candlish für kritische Kommentare zum Manuskript. Dieses Projekt wurde gefördert durch die Förderungen BO1743/6 der Deutschen Forschungsgemeinschaft und SFB/TRR 152 P11 und Z02 an Ulrich Boehm.

HINWEIS: Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Tierschutzkommission der Universität Hamburg und der Universität des Saarlandes genehmigt. 1. Vorbereitung und Fixierung von embryonalem Gewebe <ol><li> Vereinbaren Sie alle mussten sezieren die Embryonen und die Lösungen für die anschließende Fixierung des Gewebes vor dem Töten der Tiere Ausrüstung. HINWEIS: Immer eine frische 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung (4% PFA in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert auf 7,4). </li><li> Euthanize zeitlich schwangere Frau Maus mit einer ethisch genehmigten Verfahren. </li><li> Übertragen Sie die Maus auf eine Plattform. Befeuchten Sie die Bauchseite des Bauches mit 70% Ethanol und einen vertikalen Schnitt mit scharfen Schere, um die Bauchhöhle aus. </li><li> Identifizieren Sie die embryonalen Kette und ziehen Sie sie vorsichtig mit stumpfen Pinzette und legen Sie sie in eiskaltem PBS. </li><li> Holen Sie die einzelnen Embryonen ausdie embryonalen Kette mit einer feinen Schere und Pinzette. Entfernen Sie die zusätzlichen Gewebe um die Embryonen und waschen Sie sie in eiskaltem PBS. </li><li> Nehmen Sie eine kleine Schwanzbiopsie (vor der Übertragung des Embryos in PFA) und Inkubation in Schwanz Lysepuffer für die Geschlechteridentifikation und Tracer-Allel Genotypisierung PCR. </li><li> Starten Sie aus dem Embryo am meisten lateralen Seite und übertragen jedes Embryo getrennt in ein Röhrchen mit eiskaltem 4% PFA auf Eis auf einem Schüttler. </li><li> Weichen Sie die Embryonen im Alter von E13.5 oder jünger 1,5 h auf Eis mit konstantem Schütteln. Weichen Sie die Embryonen im Alter von E14.5 und E15.5 2,5 h auf Eis mit konstantem Schütteln. </li><li> Für Embryonen Alter E16.5 oder älter, enthaupten und entfernen Sie die Außenhaut vor dem Eintauchen des Kopfes in PFA-Lösung. Leiter der E16.5 Embryonen 4,5 h auf Eis mit konstantem Schütteln eingeweicht werden. </li><li> Nach entsprechender Fixierung, waschen Sie die Embryonen dreimal mit eiskaltem PBS. Übertragen Sie die Embryonen in 30% Saccharose in PBS-Lösung bei 4 ° C, bis sie sinkennach unten. </li></ol> 2. Einfrieren <ol><li> Vereinbaren Sie alle vor dem Start des Gefrierprozesses benötigten Materialien: Kryo-Schimmel, Kryo-Handschuhe, Feder Entomologie Zangen, Textmarker und optimale Schnitttemperatur Verbindung (OCT) </li><li> Beschriften Sie die Kryo-Form mit einem permanenten alkoholbeständigen Marker (erwähnen Sie die Ausrichtung des Gewebes, das Datum und Genotyp). Bereiten Sie eine Matsch zerstoßenes Trockeneis und 100% Ethanol in einem Eiskübel. Stellen Sie ein Becherglas innen Isopentan enthält. Nach 10 min für die Isopentan abkühlen. </li><li> In der Zwischenzeit nehmen Sie die Gewebe aus dem Saccharoselösung, wischen Sie überschüssige Saccharose um das Gewebe mit Hilfe von Labortücher. Übertragen Sie das Gewebe in eine vorge beschriftet Kryo-Form mit ausreichend Oktober, um das Gewebe zu bedecken. Vermeiden Sie Luftblasen im Oktober; vor allem rund um das Gewebe. </li><li> Richten Sie das Gewebe in OCT mit Feder Entomologie Pinzette zu Gewebeschäden zu vermeiden. Starten Sie das Einfrieren durch die Übertragung der Kryo-mold in das vorgekühlte Isopentan Badewanne. Isopentan in den Oktober spritzen Sie nicht, da es nicht richtig einfrieren. Wickeln Sie die Proben in Aluminiumfolie und bei -80 ° C. </li></ol> 3. Kryoschneiden <ol><li> Cut 14 um dünne Schnittserien in Serie von fünf mit einem Kryostaten und sammeln auf SuperFrost® Plus-Glasobjektträger für Immunfluoreszenz (IF) Analyse. Bewahren Sie die Objektträger bei -80 ° C bis genutzt. </li></ol> 4. Tracer Visualisierung Mit dem Tyramid Signalverstärkung (TSA) Protokoll <ol><li> Bereiten Sie die Puffer und Reagenzien für die Färbung erforderlich. Immer frisch und die Tris-NaCl-Tween (TNT) Puffer vorzubereiten am Tag der Nutzung. <ol><li> Bereiten TNT Puffer unter Verwendung von 100 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml 5 M NaCl und ddH 2 O bis zu einem Endvolumen von 1 l In 500 ul Tween 20 unter Verwendung einer 1 ml Pipette. Fügen Sie die Tween 20 langsam und spülen Sie die Pipette auf und ab mehrmals, um sicherzustellen, dass alle Tween 20 ist inLösung. </li><li> Bereiten Tris-NaCl-Blocking (TNB) Puffer mit 100 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 30 ml 5 M NaCl und ddH 2 O bis zu einem Gesamtvolumen von 1 l 5 g Blocking Reagenz (mit der vorgesehenen Kit) langsam in kleinen Schritten an den Puffer unter Rühren. Die Lösung wird langsam auf 55 ° C unter kontinuierlichem Rühren, um das Blockierungsmittel vollständig zu lösen (dies sollte nicht länger als 30-60 Minuten). Um dies zu erreichen homogene Erwärmung mit einem Wasserbad bei 55 ° C. Die Lösung wird milchig erscheinen. Bringen Sie die Lösung auf Raumtemperatur, bevor Sie. Aliquotieren und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung. </li><li> Rekonstituieren Biotin Tyramid Reagenz (im Kit enthalten) in Molecular Biology / HPLC-Qualität DMSO. Je nachdem, welcher Kit verwendet die entsprechende Menge DMSO kann variieren. Bewahren Sie die Stammlösung bei 4 ° C. HINWEIS: Teile von Tieren, die heterozygot für die jeweiligen Cre und R26 Allele für die Schaltungsanalyse verwendet werden. Mit sReflexionen von Wurf Durchführung einer Cre oder ein Allel R26 jeweils als negative Kontrollen. Gönnen negativen Kontrollobjektträger genau wie Folien aus doppelt heterozygote Tiere. Darüber hinaus sind in einem Steuerschieber aus einem Doppel heterozygoten Tier, sondern lassen Sie das TSA-Reagenz (nicht verstärkte Kontrolle). </li></ol></li><li> Mit einem scharfen frische Skalpell entfernen überschüssiges Oktober die Gewebeschnitte Umgebung und markieren die Grenze um die Abschnitte mit einem PAP Stift. </li><li> Trocknen Sie die Objektträger für 2-3 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Für jede 5 min Waschen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur 3x mit TNT. Die Folien bei RT Inkubation 30 min in 0,3% H 2 O 2 -Lösung in eiskaltem Methanol, um endogene Peroxidase-Aktivität zu quenchen. </li><li> Jeweils 3x mit PBS für jeweils 5 min bei RT. Inkubieren für 10 min in 0,5% Triton-X-100 in PBS für Gewebe Permeabilisierung. Für jede 5 min Waschen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur 3x mit TNT. </li><li> Block mit TNB (Blockierungslösung, 200 bis 300 &amp; mgr; l pro Folie) 30min bei RT in einer feuchten Kammer. Sicherstellen, dass alle Teile vollständig von TNB bedeckt. Lassen Sie die Objektträger trocknen in den Zwischenbereichen. </li><li> Abfließen überschüssiges Blockierungspuffers und Anwendung des primären Antiserum erkennt den Tracer (1: 1.000 Ziegen-Anti-WGA für BL, 1: 15.000 Kaninchen-Anti-GFP für GTT) in TNB für 2 h bei RT, verdünnt oder über Nacht bei 4 ° C. Achten Sie darauf, genug Volumen, um den Gewebeschnitt (200 bis 300 &amp; mgr; l pro Folie) vollständig bedecken. HINWEIS: Die primären Antiseren Verdünnungen hier empfohlen werden, können angepasst werden. </li><li> Jeweils unter Rühren 5 Minuten waschen Sie die Folien bei RT 3x mit TNT. </li><li> Inkubieren der Schnitte mit biotinylierten sekundären Antiserum erkennt den Host des ersten Antiserum (1: 500 Pferd-Anti-Ziegen-IgG Anti-WGA, 1: 5.000 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-anti-GFP in TNB für 1 h bei RT). </li><li> Jeweils 3x mit TNT bei RT jeweils unter Rühren 5 min. Inkubation in 1: 100 Streptavidin (SA) konjugierte Meerrettichperoxidase (SA-HRP, sofern with das Kit) in TNB für 30 min bei RT in einer feuchten Kammer. Für jede 5 min Waschen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur 3x mit TNT. Unterdessen tauen die TSA. </li><li> Verdünnen TSA 01.50 in TSA Verstärkung Verdünnungsmittel (im Kit enthalten, verwenden Sie das TSA-Kit für die Visualisierung von BL und der TSA + Kit für GTT). Die Gewebeschnitte in verdünnter TSA inkubieren genau 10 min bei RT. Verdünnen TSA kurz vor der Verwendung, im Idealfall während der vorhergehenden Waschschritt, verwenden Sie keine verbleibenden verdünnten TSA Reagenz für zukünftige Experimente; immer frisch zubereiten. </li><li> Jeweils unter Rühren 5 Minuten waschen Sie die Folien bei RT 3x mit TNT. Inkubieren mit 1: 500 Alexa Fluor ® 546-Streptavidin-Konjugat in TNB für 30 min bei RT. Jeweils unter Rühren 5 Minuten waschen Sie die Folien bei RT 3x mit TNT. </li><li> Inkubieren für 10 min in 5% Bisbenzimid-Lösung in PBS bei RT für die Kernfärbung. Jeweils unter Rühren 5 Minuten waschen Sie die Folien bei RT 3x mit TNT. Montieren Sie mit Fluromount G und führen Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie. <em&gt; Fehlerbehebung: Wirksamkeit von Tracer Übertragung auf dem Expressionsspiegel des ROSA26 Locus in den produzierenden Zellen (durch die Cre Treiberleitung verwendet wird, bestimmt) abhängen und von der neuronalen Schaltung analysiert (zB Anzahl der Neuronen Herstellung des Tracers Konvergenz etc.). Deshalb sind die primären Antiseren Verdünnungen hier empfohlenen müssen möglicherweise angepasst werden, um Unter- oder Übersignal zu verhindern. Hintergrund sollten immer mit geeigneten Kontrollobjektträger (siehe oben) untersucht werden. </li></ol> 5. τlacZ Färbung für Embryonale Bereiche <ol><li> Bereiten Sie die Puffer und Reagenzien für die Färbung erforderlich. Immer frisch bereiten die LacZ Puffer C vor dem Gebrauch. <ol><li> Bereiten 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) Stammlösung (40 mg / ml) durch Zugabe von 40 g X-gal zu 1 ml 70% Dimethylformamid (DMF). Mit Alufolie abdecken und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung. </li><li> Bereiten Nitroblautetrazolium (NBT) stock-Lösung (50 mg / ml) durch Zugabe von 50 g NBT zu 1 ml 70% DMF. Mit Alufolie abdecken und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung. </li><li> Bereiten LacZ Fixativ mit 80 ul 25% Glutaraldehyd, 5 ml einer 4% PFA, 20 ul 1 M MgCl 2, 100 &amp; mgr; l 500 mM EGTA, 1 ml 1 M Phosphatpuffer pH 7,4 und ddH 2 O bis zu einem letzten Volumen von 10 ml. </li><li> Bereiten LacZ Puffer A mit 1 ml von 1 M MgCl 2, 5 ml 500 mM EGTA, 50 ml 1 M Phosphatpuffer pH 7,4 und ddH 2 O bis zu einem Endvolumen von 500 ml. </li><li> Bereiten LacZ Puffer B unter Verwendung von 1 ml von 1 M MgCl 2, 5 ml 500 mM EGTA, 5 ml 1% Natriumdeoxycholat, 100 ml 10% NP-40, 50 ml 1 M Phosphatpuffer pH 7,4 und ddH 2 O bis zu einem Endvolumen von 500 ml. </li><li> Bereiten LacZ Puffer C durch Zugabe von 10 ul NBT-Stammlösung und 12,5 ul der X-gal-Stammlösung zu 1 ml LacZ Puffer B Stellen frisch kurz vor dem Gebrauch und mit Alufolie abdecken. </li></ol&gt; </li><li> Trocknen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur mindestens 10-15 min (mittlerweile die Folien mit einem PAP Pen vorzubereiten). </li><li> Fixieren der Abschnitt mit LacZ Fixiermittel für 2 min bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer innerhalb einer chemischen Abzugshaube. Waschen 3x mit PBS, ergänzt mit 2 mM MgCl 2. </li><li> Spülen Sie die Folien mit LacZ Puffer A waschen die Dias mit LacZ Puffer A 3 mal für 10 Minuten jeweils bei RT. Für jede 5 min Waschen 2 mal mit LacZ Puffer B. Die Folien in LacZ Puffer C Inkubieren bei 30-37 ° C für 6 Stunden oder über Nacht in einer befeuchteten Kammer. HINWEIS: In ausreichendes Volumen an LacZ-Puffer C; Folien sollten nicht austrocknen während der Inkubation. </li><li> Nach entsprechender Inkubation die Objektträger mit PBS, ergänzt mit 2 mM MgCl 2. Kurz mit ddH 2 O spülen Abschnitte Deckglas mit Mayers Glycin Gelatine. Geeignet für ein Lichtmikroskop mit einem Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bild Einrichtung ausgestattet. </li></ol> 6. Gender und Tracer-Genotypisierung <ol><li> Bereiten Schwanz Lysepuffer mit 1 ml 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ul 500 mM EGTA, 200 ul 10% SDS, 400 &amp; mgr; l 5 M NaCl und ddH 2 O, um ein Endvolumen von 10 ml. </li><li> Fügen Sie 500 ul Lysepuffer Schwanz zu jedem Eppendorf-Röhrchen, die einen Schwanz Biopsie. Hinzufügen Proteinase K bis zu einer Endkonzentration von 100 mg / ml. Inkubieren über Nacht auf einem Schüttler bei 55 ° C. </li><li> Zentrifuge Proben bei 17.000 xg für 10 min bei RT. Den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Gib 500 ul Isopropanol zu dem Überstand. Mischen Sie für mindestens 5 Minuten mit dem Umdrehen der Röhrchen auf und ab. </li><li> Spin in Zentrifuge bei 17.000 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie den Überstand. Nach Zugabe von 200 ul 70% Ethanol. Schütteln für mindestens 5 min. </li><li> Zentrifugieren bei 17.000 × g für 5 min. Überstand entfernen mit einem Pipetman (nicht gießen nicht aus). Trocknen des Pellets in einer warmen Kammer (37 ° C) für 15-30 min. </li><li> Pellet in 100 &amp; mgr;niedriger TE pH 8,0 oder Wasser mit weiter Bohrung Filterspitzen. In 55 ° C Setzen Sie für 1 Stunde und bei 37 ° C über Nacht für die richtige Lösung. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Verwenden 1 ul DNA für die PCR-Reaktion (50 &amp; mgr; l Reaktionsgemisch, enthaltend 1 ul Schwanz-DNA, 2,5 &amp; mgr; l DMSO, 10 pM jedes Primers, 25 &amp; mgr; M von jedem dNTP und 1 M Betain). PCR-Primer für die Genotypisierung und Geschlechtsidentität sind in der Tabelle aufgeführten Materialien. </li></ol>

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</ol>

Es wurde kein Interessenkonflikt erklärt.

Ausdruck transsynaptische Tracer als Transgene, die neuronale Schaltkreise genetisch definierten neuronalen Populationen verfolgen hat mehrere Vorteile gegenüber dem stereotaktische Injektion von Tracern oder neurotopic Viren. Zuerst wird der Tracer als endogenes Protein erzeugt und daher keine Immunantwort hervorzurufen und eine selektive neuralen Weg kann in verschiedenen Tieren, die mit hoher Reproduzierbarkeit zu analysieren. Zweitens, weil dies eine nicht-invasive Methode kann verwendet werden, um die Schaltungen v...

Anatomische Pfadverfolgung ist eine der am häufigsten verwendeten Werkzeuge, um die Beziehung zwischen Gehirn und Verhalten 1 entziffern. Fortschritt in neuronalen Schaltkreis Tracing Technologien hat Neurowissenschaftler mit der Fähigkeit, neuronale Schaltkreise genetisch identifiziert Neuronenpopulationen in Mäusen 2 Spuren verliehen. Trotz dieser technischen Fortschritt bleibt es schwierig, die Bildung von neuronalen Schaltkreisen vor allem während der embryonalen Reifung zu entwirren. Das ist, weil die meisten der bisher entwickelten Tracing-Verfahren basieren auf stereotaktische Injektion von transsynaptische Tracer oder gentechnisch veränderten neurotropen Viren (Abbildung 1) 2,3 basierend. Während diese Techniken zu erreichen räumliche und zeitliche Auflösung der Konnektivität, mehrere inhärente Beschränkungen wie technisch anspruchs Tracer Injektionen in das sich entwickelnde Gehirn, die Reproduzierbarkeit der Injektionsstelle, potenzielle Entzündung an der Injektionsstelle und wich-tantly Zytotoxizität von neurotropen Viren verursacht begrenzen ihre Verwendung 4. Eine alternative Methode ist es, die transsynaptische Tracer als Transgene in genetisch veränderten Mäusen exprimieren. Vor kurzem haben wir diese Technik modifiziert und eine binäre genetische transsynaptische Tracing-System, um die neuronalen Schaltkreise eines genetisch identifiziert neuronalen Population 5 Karte entwickelt. Unsere experimentellen Strategie basiert auf zwei neuen Knock-in Mausstämme, die entweder die bidirektionale Tracer Gerstenlektin (BL) 6 oder die retrograde Tracer-Tetanustoxin-Fragment C bis GFP (GTT) 7 von der ROSA 26 Ort verschmolzen Ausdruck basiert nach Cre-vermittelte Rekombination. Hier verwendeten wir diese Mäusestämme, selektiv auszudrücken BL und GTT in Neuronen, kisspeptin erzeugen, ein Neuropeptid, das bei der Regulierung der Reifung des reproduktiven Achse 8,9 gebracht wird. Wir zeigen, dass diese Technik geeignet ist, die Entwicklung und Reifung der Kuss visualisierenPeptin neuronalen Schaltkreise während der embryonalen Entwicklung des weiblichen Maushirn 5. Zuchtstrategie Die R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) und die R26-GFP-TTC (GTT) Begleitheizungsleitungen sind Knock-in-Stämme, die rekombinante 5 ROSA26 Allele tragen. Die R26-BIZ und die R26-GTT Allele transkriptional stumm aufgrund der Gegenwart einer starken Transkriptionsstoppsignal, das von zwei loxP-Stellen flankiert ist 5. Expression des BIZ und GTT Transgen durch Cre-vermittelte Entfernung des transkriptionellen Stop-Signal aktiviert. Die R26-BIZ und R26 GTT-Allele können unabhängig voneinander einfach durch Kreuzung mit einem Cre Fahrer verwendet werden. Zur Analyse Tiere, die heterozygot für die jeweiligen Cre und R26 Allele verwendet werden. Wurf Durchführung einer Cre oder ein Allel R26 jeweils als Kontrollen verwendet werden. Alternativ ist es auch möglich, zu erzeugen triple Knock-in Tiere, die die Cre, R26 und R26-BIZ-GTT-Allele jedoch wird dies eine zusätzliche Quer erfordern.

<table><tbody><tr><td>Bisbenzimid (Hoechst 33258 Farbstoff)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kryo-Form (Peel-a-way)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20 mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamid (DMF)</td><td>VWR Chemicals</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan (Methyl-2-butan)</td><td>Sigma</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser's Glycin Gelatine</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Ersatz</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Rutschen</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>TSA Kit</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA plus Kit</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop ausgestattet mit DIC-Bildgebung</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 ausgestattet mit Axio Vision Software</td><td></td></tr><tr><td>Fluroszenz Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 ausgestattet mit Axio Vision Software</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-WGA (erkennt BL)</td><td>Vector Laboatories</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylayted Pferd Anti-Ziegen-IgG-Vektor</td><td>Laboatories</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyliertes Kaninchen Anti-Kaninchen Anti-Kaninchen IgG</td><td>Vektor Laboatories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-GFP (erkennt GTT)</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-GnRH</td><td>Affinity Bio Reagenz</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-Esel Anti-Kaninchen-IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Primer</td></tr><tr><td>BL Fwd (für BIZ-Genotypisierung)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (für BIZ-Genotypisierung)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (für Cre-Genotypisierung)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (für Cre-Genotypisierung)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (für GTT-Genotypisierung)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (für GTT-Genotypisierung)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (für Geschlechtsgenotypisierung)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (für die Geschlechtsgenotypisierung)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

bedingte genetische transsynaptische tracing in der embryonalen maus-gehirn

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomische Pfadverfolgung ist von entscheidender Bedeutung, um die Beziehung zwischen Gehirn und Verhalten zu entschlüsseln. Die Entschlüsselung der Bildung neuronaler Schaltkreise während der embryonalen Reifung des Gehirns ist jedoch eine technische Herausforderung, da die meisten bisher entwickelten transsynaptischen Tracing-Methoden auf stereotaktischer Tracer-Injektion basieren. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine binäre genetische Strategie für die bedingte genetische transsynaptische Nachverfolgung im Gehirn von Mäusen entwickelt. Zu diesem Zweck haben wir zwei komplementäre Knock-in-Mausstämme generiert, um selektiv den bidirektionalen transsynaptischen Tracer Gerstenlektin (BL) und den retrograden transsynaptischen Tracer Tetanustoxin Fragment C aus dem ROSA26-Locus nach Cre-vermittelter Rekombination zu exprimieren. Die zellspezifische Tracerproduktion in diesen Mäusen ist genetisch kodiert und hängt nicht von einer mechanischen Tracer-Injektion ab. Daher ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung neuronaler Schaltkreise im embryonalen Gehirn von Mäusen zu untersuchen. Da der Tracer-Transfer zwischen Synapsen von der synaptischen Aktivität abhängt, können diese Mausstämme außerdem verwendet werden, um die Kommunikation zwischen genetisch definierten neuronalen Populationen während der Gehirnentwicklung mit einer Einzelzellauflösung zu analysieren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für das transsynaptische Tracing in Mausembryonen unter Verwendung der neuartigen rekombinanten ROSA26-Allele zur Verfügung. Wir haben diese experimentelle Technik verwendet, um die neuronalen Schaltkreise zu beschreiben, die der Reifung der Fortpflanzungsachse im sich entwickelnden weiblichen Mäusegehirn zugrunde liegen.

Dieser Abschnitt zeigt repräsentative Ergebnisse, die erhalten wird, kann die Arbeit mit dem R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) und der R26-GTT (G FP TT C) Allele werden. Hier verwenden wir die R26-BIZ und der R26-GTT-Allele, die Reifung der neuronalen Schaltkreise Regulierung der reproduktiven Achse analysieren. Die Vervielfältigung in Wirbeltieren wird zentral von einer kleinen Untergruppe von Neuronen im Hypothalamus, die Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) abs...

Unter Ausnutzung einer binären genetischen Strategie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verfolgung neuronaler Schaltkreise in Mäusen zur Verfügung, die komplementäre transsynaptische Tracer nach Cre-vermittelter Rekombination exprimieren. Da die zellspezifische Tracerproduktion genetisch kodiert ist, ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung des embryonalen Gehirns von Mäusen mit einer Einzelzellauflösung zu untersuchen.

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Entwicklung neuronaler Schaltkreise im embryonalen Mausgehirn mithilfe von drei unterschiedlichen Zellmarkierungssystemen sichtbar zu machen, und zwar unter Verwendung eines transsynaptischen Tracers, der in beide Richtungen transportiert wird, eines zweiten Tracers, der ausschließlich retrograd transportiert wird, sowie einer dritten Markierung, die sich nicht von der Zielzelle aus ausbreitet. Es ist möglich, die Zielneuronen, vorgeschalteten Neuronen und nachgeschalteten Neuronen zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigen, dass dieses experimentelle Protokoll verwendet werden kann, um die Bildung neuronaler Schaltkreise im embryonalen weiblichen Mausgehirn mit Einzelzellauflösung zu analysieren.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsneurowissenschaft zu beantworten, beispielsweise wann bestimmte neuronale Schaltkreise gebildet werden und wie sie während der embryonalen Entwicklung organisiert sind. Die Methode kann außerdem verwendet werden, um neuronale Schaltkreise in adulten Mäusen nachzuverfolgen. Insbesondere lässt sie sich einsetzen, um synaptische Aktivität zwischen genetisch identifizierten Neuronen zu analysieren, und sie kann genutzt werden, um zu untersuchen, wie unterschiedliche experimentelle Bedingungen einen neuronalen Schaltkreis im Zeitverlauf modulieren können.Beginnen Sie mit einer frisch euthanasierten trächtigen Maus. Reinigen Sie die Bauchseite mit 70 % Ethanol und führen Sie anschließend einen vertikalen Schnitt durch, um die Embryonen freizulegen. Entfernen Sie die Embryonenkette und überführen Sie sie in eine Schale mit eisgekühltem PBS.Entfernen Sie die einzelnen Embryonen mit abgerundeten Pinzetten. Trennen Sie die einzelnen Embryonen in Lösung mit feinen Scheren und Pinzetten und entfernen Sie dabei zusätzliches Gewebe, sobald die Embryonen vollständig gereinigt sind. Entnehmen Sie von jedem Embryo eine kleine Schwanzprobe und geben Sie diese in ein Röhrchen mit Lysepuffer, um DNA zur Geschlechtsbestimmung und Genotypisierung zu gewinnen.Überführen Sie dann das Embryo in frisch hergestelltes, eiskaltes 4 % PFA auf Eis. Nach der Aufbereitung jedes Embryos lassen Sie diese je nach Größe mindestens 1,5 Stunden unter Rühren in dem PFA inkubieren. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist.Die fixierten Gewebe dreimal mit eiskaltem PBS jeweils mindestens fünf Minuten lang waschen. Danach die Embryonen in eine 30 %ige Saccharoslösung bei vier Grad Celsius überführen. Wenn die Gewebe vollständig in der Lösung gesunken sind, mit der Kryoschnittechnik fortfahren.Zunächst beschriften Sie eine Kryoschablone mit einem dauerhaften alkoholresistenten Marker. Danach bereiten Sie eine Mischung aus zerkleinertem Trockeneis in 100 % Ethanol in einem Eisbehälter vor und kühlen damit etwa 10 Minuten lang einen Glasbecher mit Isopentan ab. Währenddessen entnehmen Sie die Gewebe aus der Saccharoselösung und tupfen den überschüssigen Saccharosergehalt mit einem handelsüblichen Laborabwischmittel ab.Überführen Sie das Gewebe anschließend in eine vorab beschriftete Kryoschale. Verwenden Sie ausreichend OCT, um das Gewebe vollständig zu bedecken. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen im OCT, insbesondere in der Umgebung des Gewebes.Als Nächstes orientieren Sie das Gewebe mit federleichten Entomologietupfern, um minimale Schäden zu verursachen. Gefrieren Sie die Kryoschablonen in dem gekühlten Iso-Pentan-Bad ein, gegebenenfalls ohne Spritzer zu verursachen. Die gefrorenen Schablonen können verpackt und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, um die Schablonen später zu schneiden.Schneiden Sie sie in Serienschnitte mit einer Dicke von 14 Mikrometern in Serien zu je fünf. Sammeln Sie jeweils fünf Schnitte auf einer Super-Frost-plus-Glasobjektträger. Wenn Sie die Lösung für dieses Protokoll vorbereiten, achten Sie darauf, das Tween 20 langsam zum TNT-Puffer hinzuzufügen, der frisch hergestellt werden muss.Dann die Lösung langsam auf- und abwärts durchspülen, um sie zu mischen. Beim Zubereiten des TNB-Puffers das Blockier-Reagenz unter Rühren langsam in kleinen Portionen hinzufügen. Danach die Lösung in einem Wasserbad auf 55 Grad Celsius erwärmen.Die Lösung wird trüb. Beginnen Sie nun mit der Arbeit an den Geweben, indem Sie mit einem Skalpell das überschüssige OCT um die Gewebeschnitte herum entfernen. Markieren Sie anschließend die Grenzen jedes Schnitts mit einem Pap-Pen.Lassen Sie die Objektträger auf Raumtemperatur kommen. Anschließend waschen Sie sie dreimal mit jeweils fünfminütiger Dauer in frischer, bei Raumtemperatur befindlicher XPBS-Pufferlösung. Danach hemmen Sie die endogene Peroxidase-Aktivität, indem Sie die Objektträger für eine halbe Stunde in eiskaltem Methanol mit 0,3 % Wasserstoffperoxid inkubieren.Danach dreimal mit PBS bei Raumtemperatur waschen, wobei jede Waschung fünf Minuten dauert. Anschließend die Objektträger 10 Minuten in PBST inkubieren, um die Gewebe zu permeabilisieren. Danach die Objektträger dreimal mit TNT waschen.Blocken Sie das Gewebe nun in einer feuchten Kammer mit ausreichend TNB, um jeden Objektträger zu bedecken. Lassen Sie den Blockvorgang eine halbe Stunde bei Raumtemperatur durchführen. Achten Sie darauf, dass die Objektträger nicht austrocknen.Nach dem vollständigen Abtropfen des Blockierpuffers die Probe mit dem Primärantikörper in TNB bedecken, um den Detektor zu binden. Zwei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Zum Entfernen des Primärantikörpers die Probe dreimal mit TNT bei Raumtemperatur waschen, jeweils fünf Minuten pro Waschgang.Während dieser Waschschritte vorsichtige Agitation anwenden. Anschließend die Schnitte eine Stunde lang in der Sekundärantikörper-Lösung inkubieren. Danach bei Raumtemperatur drei TNT-Waschschritte durchführen, um den nicht gebundenen Sekundärantikörper zu entfernen.Danach die Gewebe in einer befeuchteten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer Verdünnung von 1:100 abgerücktem mit Hamin konjugiertem Pferderadischenperoxidase in TNB inkubieren, während die Objektträger in TNT gewaschen werden. Nach der Inkubation eine frische Verdünnung der TSA-Lösung herstellen. Nun die frisch hergestellte TSA-Verdünnung genau 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf die Gewebe auftragen.Die exakte Inkubationsdauer für TSA ist entscheidend. Verarbeiten Sie daher nicht zu viele Objektträger gleichzeitig. In einem Arbeitsschritt können bis zu 10 Objektträger bearbeitet werden.Zusätzliche Objektträger können bis zur Verarbeitung in TNT-Waschpuffer warten, nach einer weiteren Runde von Waschschritten. Inkubieren Sie die Gewebe mit einem bis 500 Alexa Fluor 546 markierten Sekundärantikörper in TNB für 30 Minuten.Entfernen Sie bei Raumtemperatur das abgespülte Habitankonjugat durch drei weitere TNT-Bäder. Führen Sie dann die Kernfärbung durch, indem Sie 5 %ige BIS-Benzolösung in PBS bei Raumtemperatur 10 Minuten lang auftragen. Entfernen Sie die BIS-Benzofärbung durch drei TNT-Spülungen. Danach montieren Sie die Objektträger mit Fluoro Mount G und führen Sie die Analyse durch.Mithilfe des beschriebenen Protokolls wurde die Reifung der neuronalen Schaltkreise, die die reproduktive Achse regulieren, in Mäusen mit den Allelen R 26 BIZ und R 26 GTT analysiert. Die Expression der Transgene wurde durch Cre-abhängige Rekombination in embryonalen Kisspeptin-Neuronen des arcuaten Nukleus aktiviert, wobei eine kisspeptinspezifische Cre-Treiberlinie verwendet wurde. Doppelte Immunfluoreszenz für Kisspeptin in Grün und BL in Rot von einem kiss. IC R 26 BIZ.Maus zeigt eine Aktivierung von BL in der KISS IC R 26 GTT Maus. Die Doppel-Immunfluoreszenz zeigt KISSPEPTIN in grün und GTT, das durch den Cree-Treiber in rot aktiviert wurde. Diese und andere Diagnosen zeigten, dass die Transgene in E 18,5 experimentellen Embryonen funktionsfähig waren. Seine Pepin-Neuronen im arcuatischen Kern wurden bereits dabei beobachtet, mit GNRH zu kommunizieren.Neuronen wiesen kein Z auf, das auf die CRE-exprimierenden Kisspeptin-Neuronen beschränkt war, während BL transsynaptisch auf vorgeschaltete und nachgeschaltete Neuronen übertragen wurde. Einige, aber nicht alle, GNRH-Neuronen enthielten bl.Daher ist nur eine Teilmenge der embryonalen GNRH-Neurone synaptisch mit Kisspeptin-Neuronen des arcuaten Kerns verbunden. Die GNRH-Neurone enthielten keinen retrograden Tracer. GTT zeigt, dass diese Neurone stromabwärts von Kisspeptin-Neuronen liegen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie an einem Tag durchgeführt werden, indem dieser Vorgehensweise gefolgt wird. Andere Methoden wie die duale Immunfluoreszenz können genutzt werden, um die biochemische Natur verbundener Neuronen zu identifizieren. Diese Technik sollte den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und der Entwicklungsbiologie den Weg ebnen, neuronale Vernetzungen mit Einzelzellauflösung sowohl während der Entwicklung als auch bei adulten Tieren zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise bei Mäusen dargestellt werden kann.

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Forschung

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