Eine Anleitung zum Erstellen und Verwenden von hiPSC Abgeleitet NPCs für das Studium der Neurologische Erkrankungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Neuro-Vorläuferzellen oder NPCs aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen oder hohen PSCs zu generieren, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die zu neurologischen Erkrankungen beitragen. Dies wird erreicht, indem zunächst hohe PSCs mit dualen SMAD-Inhibitoren in neuronale Rosetten differenziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, diese neuronalen Rosetten zu ernten und sie zu erweiterbaren N PC-Populationen heranwachsen zu lassen.

Als nächstes lentivirale Transduktion mit einer Spin-Infektion. Schritte zur Verbesserung der Effizienz werden verwendet, um die Genexpression zu manipulieren. Der letzte Schritt besteht darin, die NPCs in Suspension zu züchten, so dass sie spontan Neurosphären bilden.

Letztendlich kann diese Plattform verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Phänotypen zu testen. Zum Beispiel die Messung der Auswirkungen genetischer Manipulation auf die Neuromigration. Diese Methode kann jedoch Einblicke in zelluläre Mechanismen wie die Migration geben.

Es kann auch angewendet werden, um andere biologische Prozesse wie Replikation, oxidativen Stress, Apoptose und Neuritenwachstum zu untersuchen. Die Differenzierung von human-induzierten pluripotenten Stammzellen oder hohen PSCs führt zur Bildung von sichtbaren neuralen Rosetten, die als runde Cluster von Neuroepithelzellen mit aico-basaler Polarität für die enzymatische Selektion der neuralen Rosetten am Tag 14 charakterisiert sind. Aspirieren Sie das Medium aus den adhärenten Embryokörpern oder Ebs und fügen Sie einen Milliliter Reagenz zur Auswahl des Neuralrosets pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu, die eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert wird.

Nach einer Stunde. Verwenden Sie eine P 1000-Pipette, um das Enzym vorsichtig aus jeder Vertiefung zu entfernen, und fügen Sie einen Milliliter D-M-E-M-F 12 pro Vertiefung hinzu. Um die Rosetten zu waschen, den einen Milliliter D-M-E-M-F 12 auffangen und schnell wieder in die Vertiefung ausstoßen, so dass sich die Rosetten von der Platte lösen.

Sammeln Sie die Rosetten in ein Falkenröhrchen, pipettieren Sie einen weiteren Milliliter D-M-E-M-F 12 und stoßen Sie es schnell in dieselbe Vertiefung aus, um die restlichen Rosetten zu lösen. Versuchen Sie nicht, die Rosettenaggregate nicht aufzubrechen. Sammeln Sie die Neuralrosetten in derselben Falkenröhre

Es kann mehr von dem Enzym hinzugefügt und dieser Vorgang wiederholt werden, wenn sich die Rosetten nicht leicht lösen, wenn alle neuralen Rosetten gesammelt wurden. Drehen Sie die Falcon-Tube drei Minuten lang bei 300 g. Saugen Sie die Wäsche und die Wiederbelebung an.

Suspendieren Sie die Rosetten in zwei Millilitern neuralen Vorläuferzellmedien. Übertragen Sie die Zellen in eine mit Poly-L-Ornithin-Laminat beschichtete sechswandige Platte und wachsen Sie eine Woche lang bei 37 Grad Celsius. In diesem Labor werden neurale Vorläuferzellen oder NPCs auf Matrigelplatten gezüchtet, jeden zweiten Tag gefüttert und in einer sehr hohen Dichte gehalten.

Um die NPCs zu spalten, aspirieren Sie zuerst das Medium und fügen Sie dann einen Milliliter warmes Accutane pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu, die 10 bis 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Übertragen Sie die abgelösten Zellen vorsichtig und mit möglichst geringer mechanischer Belastung in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das D-M-E-M-F-12 enthält. Tritrieren Sie die Zellen nicht, während sich das Enzym befindet, indem Sie die Zellen nach der Zentrifugation fünf Minuten lang bei 1000 G drehen, den Überstand aspirieren und die NPCs resuspendieren.

In etwa einem Milliliter NPC-Medium pro ursprünglicher Vertiefung einer Sechs-Well-Platte werden nach Resuspension und Zellzählung fünf bis 10 Millionen Zellen pro konfluenter Vertiefung einer Sechs-Well-Platte erwartet. Tauschen Sie die NPCs-Platte etwa ein bis 2 Millionen Zellen pro Well einer Sechs-Well-Platte aus, um die NPCs zu erhalten. Die Effizienz der Neurosphärenbildung variiert zwischen Experiment und Zelllinie, tritt aber in der Regel am besten auf, wenn zwischen 200.000 und eine Million Zellen pro Vertiefung einer sechswandigen nicht adhärenten Platte sitzen. Wenn eine Verklumpung auftritt, reduzieren Sie die Anzahl der sitzenden Zellen idealerweise innerhalb von ein bis zwei Tagen nach der Teilung.

Die NP-NPCs sollten mit lentiviralen oder retroviralen Vektoren transduziert werden, um den Anteil der transfizierten Zellen zu erhöhen. Verwenden Sie Spin-Infektionen. Aspirieren Sie die Medien aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie sie durch die entsprechende Überexpression oder Kontrolle von Lentiviren oder Retroviren, die auf die gewünschte Infektionsvielfalt titerisiert werden.

In NPC-Medien: Verwenden Sie 1,5 Milliliter pro Vertiefung einer Sechs-Well-Plattendrehung bei 1000 g und Raumtemperatur für eine Stunde in einer Plattenzentrifuge. Legen Sie die Platte nach dem Schleudern wieder in den Inkubator, um den Zelltod zu reduzieren. Tauschen Sie das Medium innerhalb von acht Stunden nach der Spin-Infektion aus.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die von NPC abgeleiteten NEUROSPHÄREN einmal in NPC-Medien waschen, um Zelltrümmer zu entfernen. Kippen Sie die Platte in einem Winkel von 45 Grad und lassen Sie die Neurosphären sich absetzen und entfernen Sie dann so viel Medium wie möglich, ohne die Neurosphären zu aspirieren. Ersetzen Sie es durch frische Medien.

Als nächstes entnehmen Sie die NPC-abgeleiteten NEUROSPHÄREN manuell unter einem Mikroskop mit einer P 200-Pipette und übertragen eine Neuros-Kugel in jede Vertiefung einer mit Matrigel beschichteten 96-Well-Platte. Es ist wichtig, Neurosphären ähnlicher Größe auszuwählen, um die Variabilität der Ergebnisse zu reduzieren. Geben Sie zusätzlich 0,5 Milligramm Matri-Gel, verdünnt in kaltem NPC-Medium, zu den Neurosphären in jeder 96-Well-Platte.

Zentrieren Sie mit einer Pipettenspitze jede einzelne Neurosphäre manuell in der Mitte der Vertiefung und lassen Sie die Migration der Neurosphäre 48 Stunden lang stattfinden. Nachdem Sie die Zellen fixiert und mit den gewünschten immunhistochemischen Markern gefärbt haben, fotografieren Sie die Neurosphären in ihrer Gesamtheit mit einem Forex-Mikroskopobjektiv. Um die radiale Migration zu messen, verwenden Sie die Software image J.

Verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um die Kante der am weitesten wandernden Zellen manuell nachzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass dieser Bereich im Fenster "Maße einstellen" auf der Registerkarte "Analysieren" aktiviert ist. Verwenden Sie dann die Funktion "Messen", um die Fläche der resultierenden Form zu berechnen.

Verwenden Sie den Wert des Flächenmaßes und die Gleichung für die Fläche eines Kreises, um den äußeren Radius auf die gleiche Weise zu bestimmen, zeichnen Sie den Rand der ursprünglichen Neurosphäre nach. Messen Sie die Fläche und berechnen Sie den Innenradius. Berechnen Sie die gesamte radiale Migration als Differenz zwischen dem äußeren und dem inneren Radius.

Diese Bilder zeigen die Stadien der neuronalen Differenzierung mit hohem PSC von hohen PSCs zu Embryokörpern, neurale Rosetten, NPCs und Neuronen, die validierte NPCs exprimieren, die NPC-Marker-Nesting und den neuronalen Stammzelltranskriptionsfaktor SOX zwei in den meisten Zellen. Die Beta-3-Tubulin-Färbung ist auch in allen NPC-Populationen sichtbar. NPCs exprimieren auch den neuronalen Stammzelltranskriptionsfaktor PAC sechs und den vier Brainin-Vorläufermarker.

TBR zwei, aber nicht Mittelhirnmarker wie LMX one A und FOX A zwei NPCs können auf 70 bis 80 % Beta drei Tubulin-positive Neuronen in grün und 20 bis 30 % gliale fibrilläre saure Protein-positive Astrozyten in rot differenzieren, hochwertige hohe PSC. NPCs exprimieren Neston und SOX 2 in den meisten Zellen, während NPCs von geringer Qualität negative SOX-Felder von SOX zwei haben und nur in negativen Zellen nisten. Die vier Wochen alten Neuronen, die sich von hochwertigen NPCs unterscheiden, Express Map 2, AB und Beta drei turbulent

Nach erfolgreicher Transduktion mit einem lentiviralen oder retroviralen Vektor mit hohem Titer. Mehr als 80 % der Zellen werden durch den fluoreszierenden Reporter markiert. Die Sphärengenerierung der Vektor-Neurosphäre ergibt eine Population von Neurosphären von relativ homogener Größe, die in Kultur etwa eine Woche lang gesund bleiben kann.

Bei regelmäßiger Fütterung von Neuronen verläuft die Sphärenmigration in gesunden Neurosphären robust, wie diese Hellfeldbilder vor und nach 48 Stunden Migration im Matrigel nach seiner Entwicklung veranschaulichen. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Schizophrenie, um die Neuromigration in humanen induzierten NPCs aus PL-Stammzellen zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Retrovirus potenziell gefährlich sein kann und alle Gewebekulturarbeiten unter BL zwei plus-Bedingungen durchgeführt werden sollten, wenn möglicherweise ein Virus vorhanden ist.