Eine Anleitung zum Erstellen und Verwenden von hiPSC Abgeleitet NPCs für das Studium der Neurologische Erkrankungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neuronale Vorläuferzellen oder NPCs aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen oder hiPSCs als Plattform zur Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die zu neurologischen Erkrankungen beitragen, zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem hiPSCs zunächst mithilfe von dualen SMAD-Inhibitoren zu neuralen Rosetten differenziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, diese neuralen Rosetten zu gewinnen und sie zu expandierbaren NPC-Populationen heranwachsen zu lassen.

Als nächstes erfolgt die lentivirale Transduktion mit einer Spin-Infektion. Dieser Schritt zur Verbesserung der Effizienz wird verwendet, um die Genexpression zu modulieren. Der letzte Schritt besteht darin, die NPCs in Suspension zu kultivieren, sodass sie spontan Neurophären bilden.

Schließlich kann diese Plattform zur Untersuchung einer Vielzahl zellulärer Phänotypen eingesetzt werden. Zum Beispiel zur Messung des Effekts genetischer Eingriffe auf die Neuro-Migration. Diese Methode kann Einblicke in zelluläre Mechanismen wie die Migration liefern.

Sie kann auch zur Untersuchung anderer biologischer Prozesse wie Replikation, oxidativem Stress, Apoptose und Neuritauswuchs angewendet werden. Die Differenzierung menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen oder hochgradiger PSCs führt zur Bildung sichtbarer neuraler Rosetten, die sich als runde Zellverbände aus neuroepithelialen Zellen mit apikobasaler Polarität charakterisieren und die enzymatische Selektion neuraler Rosetten am Tag 14 ermöglichen. Entfernen Sie das Medium von den anhaftenden Embryoidkörpern oder EBs und geben Sie je nach Vertiefung einer sechswelligen Platte ein Milliliter Neuralrosetten-Selektionsreagenz hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.

Nach einer Stunde. Entfernen Sie mit einer P-1000-Pipette vorsichtig das Enzym aus jedem Brunnen und geben Sie je einen Milliliter D-M-E-M-F 12 pro Brunnen hinzu. Zum Waschen der Rosetten sammeln Sie den einen Milliliter D-M-E-M-F 12 und spritzen ihn schnell wieder in den Brunnen zurück, wodurch die Rosetten von der Platte gelöst werden.

Sammeln Sie die Rosetten in einem Falcon-Röhrchen. Pipettieren Sie ein weiteres Mal ein Milliliter D-M-E-M-F 12 und geben Sie es schnell in dasselbe Bohrloch, um die verbleibenden Rosetten zu lösen. Versuchen Sie dabei nicht, die Rosettenaggregate aufzubrechen. Sammeln Sie die neuronalen Rosetten im selben Falcon-Röhrchen.

Wenn die Rosetten nicht leicht ablösen, sobald alle neuralen Rosetten gesammelt wurden, kann mehr Enzym zugegeben und dieses Verfahren wiederholt werden. Zentrifugieren Sie das Falcon-Röhrchen bei 300 G für drei Minuten. Aspirieren Sie die Waschflüssigkeit und resuspendieren Sie den Pellet.

Suspendieren Sie die Rosetten in zwei Milliliter Neural-Progenitor-Zell-Medium. Überführen Sie die Zellen in eine mit Poly-L-Ornithin beschichtete Sechswellplatte und kultivieren Sie sie eine Woche lang bei 37 Grad Celsius. In diesem Labor werden Neural-Progenitor-Zellen oder NPCs auf Matrigel-Platten kultiviert, alle zwei Tage frisch versorgt und in sehr hoher Dichte gehalten.

Um die NPCs zu trennen, aspirieren Sie zuerst das Medium und geben dann ein Milliliter warmes Accutase pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Überführen Sie die abgelösten Zellen vorsichtig mit möglichst geringer mechanischer Belastung in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das D-M-E-M-F 12 enthält. Pipettieren Sie die Zellen nicht auf und ab, während sie im Enzym sind. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 ×g für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren die NPCs.

Bei etwa einem Milliliter NPC-Medium pro ursprünglichem Brunnen einer Sechs-Loch-Platte werden fünf bis zehn Millionen Zellen pro konfluentem Brunnen einer Sechs-Loch-Platte nach Resuspension und Zellzählung erwartet. Rekultivieren Sie die NPCs mit etwa einer bis zwei Millionen Zellen pro Brunnen einer Sechs-Loch-Platte, um die NPCs zu erhalten. Die Effizienz der Neurosphärenbildung variiert zwischen Experimenten und Zelllinien, gelingt aber gewöhnlich am besten, wenn zwischen 200.000 und einer Million Zellen pro Brunnen einer sechsbrüchigen nichtadhärenten Platte ausgesät werden. Falls es zu Klumpenbildung kommt, reduzieren Sie die Anzahl der ausgesäten Zellen. Idealweise erfolgt dies innerhalb von ein bis zwei Tagen nach dem Teilen.

Die NP-NPCs sollten mit lentiviralen oder retroviralen Vektoren transduziert werden, um den Prozentsatz transfizierter Zellen zu erhöhen. Verwenden Sie eine Spin-Infektion. Aspirieren Sie das Medium aus jedem Well und ersetzen Sie es durch die entsprechenden Überexpressions- oder Kontrolllentiviren bzw. -retroviren, die auf die gewünschte Multiplizität der Infektion eingestellt und verdünnt wurden.

Im NPC-Medium 1,5 Milliliter pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte bei 1000 × g und Raumtemperatur eine Stunde lang in einem Plattenzentrifugenrotor zentrifugieren. Nach der Zentrifugation die Platte zur Verringerung des Zelltods zurück in den Inkubator stellen. Das Medium innerhalb von acht Stunden nach der Zentrifugationsinfektion erneuern.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die aus NPCs abgeleiteten Neurosphären einmal in NPC-Medium waschen, um zellulären Abfall zu entfernen. Kippen Sie die Platte in einem Winkel von 45 Grad und lassen Sie die Neurosphären absinken; anschließend entfernen Sie so viel Medium wie möglich, ohne die Neurosphären abzusaugen. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium.

Als Nächstes heben Sie die aus NPCs abgeleiteten NEUROSPHÄREN unter dem Mikroskop manuell mit einer P-200-Pipette auf und geben jeweils eine Neurosphäre in jede Vertiefung einer mit Matrigel beschichteten 96-Loch-Platte. Es ist wichtig, Neurosphären ähnlicher Größe auszuwählen, um die Variabilität der Ergebnisse zu verringern. Geben Sie zusätzlich 0,5 Milligramm Matrigel, verdünnt in kaltem NPC-Medium, zu den Neurosphären in jeder 96-Loch-Platte hinzu.

Positionieren Sie mithilfe einer Pipettenspitze jede einzelne Neuroosphäre manuell in der Mitte der Vertiefung. Lassen Sie die Migration der Neurosphären für 48 Stunden stattfinden. Nach Fixierung und Färbung der Zellen mit den gewünschten immunhistochemischen Markern fotografieren Sie die Neurosphären vollständig mit einem Forex-Mikroskopobjektiv. Zur Messung der radialen Migration verwenden Sie die Image-J-Software.

Verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug, um die Kante der am weitesten migrierten Zellen manuell nachzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass im Fenster „Messungen festlegen“ unter der Registerkarte „Analysieren“ die Option „Fläche“ aktiviert ist. Verwenden Sie anschließend die Messfunktion, um die Fläche der resultierenden Form zu berechnen.

Verwenden Sie den Wert der Flächenmessung und die Gleichung für die Fläche eines Kreises, um den äußeren Radius auf die gleiche Weise zu bestimmen, indem Sie den Rand der ursprünglichen Neurosphäre nachzeichnen. Messen Sie die Fläche und berechnen Sie den inneren Radius. Berechnen Sie die gesamte radiale Migration als Differenz zwischen äußerem und innerem Radius.

Diese Bilder zeigen die Stadien der neuronalen Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (PSCs), beginnend bei den PSCs über Embryoidkörper, neurale Rosetten, neuronale Vorläuferzellen (NPCs) bis hin zu Neuronen. Validierte NPCs exprimieren den NPC-Marker Nestin sowie den Transkriptionsfaktor SOX2 in den meisten Zellen. Die Färbung für Beta-3-Tubulin ist außerdem in allen NPC-Populationen sichtbar. NPCs exprimieren zudem den Transkriptionsfaktor PAC6 und den Marker für Vorfahren der Großhirnrinde.

TBR zwei, jedoch keine Mittelhirnmarker wie LMX1A und FOXA2. NPCs können sich zu 70–80 % beta-3-Tubulin-positiven Neuronen (grün dargestellt) und zu 20–30 % glialen fibrillären sauren Proteinen (GFAP)-positiven Astrozyten (rot dargestellt) differenzieren, bei hochwertigen hiPSCs. Hochwertige NPCs exprimieren Nestin und SOX2 in den meisten Zellen, während niedrigwertige NPCs Bereiche von SOX2-negativen und Nestin-negativen Zellen aufweisen. Vier Wochen alte Neuronen, die sich aus hochwertigen NPCs differenziert haben, exprimieren MAP2AB und beta-3-Tubulin.

Nach erfolgreicher Transduktion mit einem hochtitrigen lentiviralen oder retroviralen Vektor sind mehr als 80 % der Zellen mit dem fluoreszenten Reporter markiert. Die Einbeziehung des Vektors in die Neurosphären-Generierung führt zu einer Population von Neurosphären relativ homogener Größe, die etwa eine Woche lang gesund in Kultur gehalten werden können.

Bei regelmäßiger Fütterung tritt eine robuste Neurosphären-Migration in gesunden Neurosphären auf, wie diese Hellfeldaufnahmen vor und nach 48 Stunden Migration in Matrigel nach der Entwicklung veranschaulichen. Diese Technik eröffnete für Forscher im Bereich Schizophrenie die Möglichkeit, die neuronale Migration in aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Nervenvorläuferzellen (NPCs) zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Retroviren potenziell gefährlich sein kann und sämtliche Zellkulturarbeiten unter Biosicherheitsstufe zwei plus (BSL-2+) Bedingungen durchgeführt werden sollten, wenn Viren potenziell vorhanden sind.