Name: Eine Anleitung zum Erstellen und Verwenden von hiPSC Abgeleitet NPCs für das Studium der Neurologische Erkrankungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Differenzierung von neuronalen Vorläuferzellen aus hiPSCs zur Untersuchung neurologischer Erkrankungen. Diese Methode nutzt duale SMAD-Inhibitoren und lentivirale Transduktion für reproduzierbare Forschungsergebnisse.

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Kristen Brennand ist eine New Yorker Stammzellstiftung - Robertson Investigator. Das Brennand Laboratory wird durch einen Brain and Behavior Young Investigator Grant, das National Institute of Health (NIH) Grant R01 MH101454 und die New York Stem Cell Foundation unterstützt.

1. hiPSC Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen <ol><li> Wachsen und zu expandieren hiPSCs in menschlichen embryonalen Stammzellen (HES) Medien (Tabelle 1) co-kultiviert auf einem embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Schicht, bis große (aber subkonfluente) Kolonien über eine Embryoidkörper (EB) Zwischen bereit für neuronale Differenzierung (Abbildung 2). Routine hiPSC Kulturbedingungen sind an anderer Stelle beschrieben, 16,17; kurz, wachsen hiPSCs in HES Medien auf einem MEF Feeder-Schicht bis zur Konfluenz, dann enzymatisch Gang mit Kollagenase (1 mg / ml in DMEM) und erweitern etwa 1: 3 alle 7 Tage. </li><li> Um Poly-L-Ornithin / Laminin beschichteten Platten, Kleider Platten mit 10 in sterilem Wasser für Kunststoffoberflächen (50 g / ml für Glasoberflächen) vorzubereiten g / ml Poly-L-Ornithin und Inkubation bei Raumtemperatur für 3-24 Stunden. Mindestens einmal für 3-24 h Waschen mit sterilem Wasser und anschließend mit 5 g / ml Laminin in sterilem PBS bei RT. HINWEIS: Wenn in Plastik verpackt, Platten kannfür bis zu sechs Monate bei -20 ° C gelagert. </li><li> An Tag 1, enzymatisch heben subkonfluenten hiPSCs (im allgemeinen auf MEFs aufgezogen oder hiPSCs in definierten Medien wie TeSR 18 auf Matrigel gezüchtet) von der Platte als große Kolonien mit 1 mg / ml Collagenase IV in DMEM / F12. HINWEIS: Nach 1-2 h Inkubation bei 37 ºC wurden Kolonien werden in die Schüssel zu schweben. </li><li> Behutsam hiPSC Kolonien (durch Absetzen, nicht Zentrifugation) 1-2x mit DMEM / F12, Resuspension in 2 ml / Vertiefung von N2 / B27 Medien (Tabelle 1) und die Übertragung auf nicht-haftenden Schalen mit 6 Vertiefungen (kombinieren 3-Brunnen in 1 -gut) 19. HINWEIS: Über Nacht wird Kolonien schwebenden sphärischen Cluster zu bilden als &quot;Embryoid Bodies&quot; (EVG). Erwarten erhebliche Zelltod. </li><li> Am Tag 2, Neigung Platten und ermöglichen EVG zu begleichen. Medien vorsichtig heraus und einmal abwaschen mit DMEM / F12, um Schmutz zu entfernen. Vorschub mit N2 / B27 Medien mit Dual SMAD-Hemmer (0,1 M LDN193189 und 10M SB431542) 12 ergänzt </sup&gt;. </li><li> An den Tagen 3-7, wird neuralization im Rahmen der dualen SMAD Inhibierung auftreten; überprüfen Sie, ob EVG sind rund, aber nicht zystische. Futter EVG jeden zweiten Tag mit N2 / B27 Medien mit 0,1 M LDN193189 und 10M SB431542 ergänzt. </li><li> An den Tagen 7-14 nach Beschichtung von EVG an Poly-L-Ornithin / Laminin beschichteten Platten, überprüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, dass neuronale Rosetten beginnen, innerhalb von wenigen Tagen erscheinen (gekennzeichnet als runde Clustern Neuroepithelzellen mit apikal-basal Polarität; Abbildung 1). Weiter zur adhärenten EVG jeden zweiten Tag mit N2 / B27 Medien mit 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 und 1 g / ml Laminin ergänzt ernähren. </li></ol> 2. Harvest of Neural Rosetten HINWEIS: Wir empfehlen, dass neuronale Rosetten enzymatisch unter Verwendung von Neural Rosette Selektionsreagenz 20 oder ähnliche Selektionsreagenz geerntet werden. Obwohl neuronale Rosetten manuell in 6-Well-Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Platte, thi abgeholt werdens Methode nimmt eine umfassende Ausbildung zu meistern, und, abhängig von Benutzer Geschick, kann eine zweite Runde der Kommissionierung am Tag 20 zu bereichern für NPCs und Abbau nicht-neuronalen Zelltypen erfordern. <ol><li> Für enzymatische Auswahl an neuronalen Rosetten am Tag 14, absaugen Medien aus halten EVG und 1 ml neuronalen Rosette Selektionsreagenz pro Vertiefung für eine 6-Well-Platte. Bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Mit einem Pipetman P1000, entfernen Enzym aus jeder Vertiefung. 1 ml DMEM / F12 pro Napf waschen. </li><li> Mit P1000, sammeln Sie die 1 ml DMEM / F12 und schnell vertreiben die DMEM / F12 zurück in den Brunnen, damit Lösen der Rosetten von der Platte. Sammeln Sie die Rosetten in ein Falcon-Röhrchen. </li><li> Pipette weitere 1 ml DMEM / F12 und schnell in derselben Wanne auszustoßen, um verbleibende Rosetten abzulösen. (Verreiben Sie nicht. Versuchen Sie, nicht zu brechen Rosette Aggregate). Sammeln Sie die neuronale Rosetten in gleichen Falcon-Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.4 wie nötig. Wenn Rosetten nicht leicht zu lösen, fügen moWieder Enzym und wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 2,1 bis 2,4) </li><li> Spin-Zellen bei 300 xg für 3 min. Saugen Sie die Wäsche, und wieder auszusetzen Rosetten in 2 ml NPC Medien (Tabelle 1). Übertragungszellen (1: 1) in eine Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete 6-Well-Platte. </li><li> Von 15 bis 21 Tagen werden die neuronalen Rosetten zu erweitern; Feed Rosetten jeden zweiten Tag mit NPC Medien. </li><li> Bewerten Sie die Qualität der neuronalen Rosetten und sicherzustellen, dass Flach Fibroblasten-ähnlichen Zellen nicht in der Kultur erweitert. HINWEIS: Wenn nicht-Rosetten bestehen bleiben, kann der NPC Kultur manchmal durch manuelle Kommissionierung geborgen werden, die Auswahl nur die besten der aufgenommenen Rosetten in Accutase. Distanzieren 15 min bei 37 ° C. Pellet, waschen und Platte in NPC Medien auf 24-Well-Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Platte. </li></ol> 3. Ausbau der neuronalen Vorläuferzellen HINWEIS: hiPSC NSC können entweder Matrigel- oder Poly-L-Ornithin / Laminin beschichteten Platten gezüchtet werden. Wir verwenden in der Regel Matrigel-Platten, da sie schneller und bereit sein zu geringeren Kosten. <ol><li> Auf Matrigel-beschichteten Platten herzustellen, schnell auftauen und Resuspendieren eine 1mg gefrorenes Aliquot Matrigel in 24 ml kaltes DMEM / F12 und sofort verteilen 2 ml zu jeder Vertiefung der zwei Sechs-Well-Platten. Inkubieren für wenigstens 1 Stunde bei 37 ºC. HINWEIS: Matrigel muss nur angesaugt werden, nicht gewaschen, unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Feed-NPCs jeden zweiten Tag und zu warten mit sehr hoher Dichte oder sie spontan zu Neuronen zu differenzieren. HINWEIS: Obwohl etablierten NPCs werden in der Regel im Verhältnis 1: 4 pro Woche kann sehr niedrigen Durchgang NPCs aufgeteilt werden 1: 2 so selten wie einmal alle zwei Wochen. </li><li> So teilen Sie zunächst absaugen Medien und 1 ml warmem Accutase (1X) pro Vertiefung 6-Well-Platte. Bei 37 ° C für 10-15 min. </li><li> Abgelösten Zellen übertragen Sie leicht in ein 15 ml Röhrchen mit DMEM / F12 mit so wenig mechanischer Belastung wie möglich. Zellen titriert niemals während der Enzym. Pellet-Zellen durch Spinning bei 1.000 × g für 5 min. </li><li> Saugen Sie das Waschen und resuspendieren NPCs in ~ 1 ml NPC Medien pro Original auch der 6-Well. HINWEIS: Erwarten Sie, dass ein konfluenter Vertiefung einer 6-Well-Gericht hat 5-10 Million Zellen; Dies kann durch Zählen einer 10l Aliquot von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers vor dem Wiederbeschichtungs bestätigt werden. </li><li> Nach Resuspension, Wiederplatte NPCs als NPCs, Neuronen oder Neurosphären. Um NPCs halten Platte etwa 1-2 Millionen Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. Die Effizienz der Neurosphären-Bildung zwischen den Experimenten und Zelllinien variieren, aber im allgemeinen erfolgt am besten, wenn die zwischen 200.000 und 1.000.000 Zellen pro Loch einer nicht-haftenden Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät; wenn Verklumpung der Neurosphären, reduzieren die Anzahl der Zellen ausgesät. Um zu Neuronen zu differenzieren, Platte etwa 200.000 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ersetzt NPC Medien mit Neuron Medien. </li><li> Immunhistochemisch validieren jede etablierte NPC Linie. Sobald genügend Zellmaterial wurde expanded, Label NPCs mit Antikörpern für NESTIN und SOX2. Geprüftes NPC Leitungen sollten auch in Neuronen für 4-6 Wochen differenzieren und mit Antikörpern für III-Tubulin-und MAP2ab markiert. <ol><li> Fix Zellen in 4% Paraformaldehyd in PBS bei 4 ° C für 10 min. Permeabilisieren NSC bei RT für 15 min in 1,0% Triton in PBS, und dann wird der Block in 5% Eselserum mit 0,1% Triton bei RT für 30 min. </li><li> Inkubation mit dem primären Antikörper in 5% Eselserum mit 0,1% Triton, über Nacht bei 4 ° C. HINWEIS: Wir empfehlen folgende Antikörper: Ziegen-Anti-Sox2, 1: 200; Maus-anti-Mensch-Nestin, 1: 200; Kaninchen-anti-βIII-Tubulin, 1: 500; Maus-Anti-βIII-Tubulin, 1: 500; Maus-Anti-MAP2ab, 1: 200. (Abbildung 2). </li><li> Nach einem Waschen mit PBS, inkubiert Sekundärantikörper Zellen mit der entsprechenden konjugierten Sekundärantikörper, um Ziege, Maus oder Kaninchen bei 1: 300, im in 5% Eselserum mit 0,1% Triton für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur. Um Kerne, Flecken Zellen mit 0,5 &amp; mgr; g / ml DAPI (4 &#39;visualisieren, 6-Diamino-2-phenylindol) und montieren Sie mit Vectashield. </li></ol></li></ol> 4. NPC Transduction <ol><li> Verwenden spinfection (Zentrifugation von Zellkulturplatten in Gegenwart von Virus bei 1.000 × g für 1 Stunde), um den Prozentsatz der transfizierten Zellen 21 erhöhen. Absaugen Medien und ersetzen mit dem entsprechenden Überexpression (oder Kontrolle) Lentiviren (oder Retroviren), auf die gewünschte Multiplizität der Infektion (MOI) (in der Regel 1 bis 10), in NPC Medien verdünnt titriert. Verwenden von 1,5 ml pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen (oder eines geeignet skalierten Volumen für andere Typen von Gewebekulturplatten). Spin bei 1.000 xg und 37 ° C für 1 Stunde in einer Plattenzentrifuge. HINWEIS: Im Idealfall transduzieren NPCs mit lentiviralen oder retroviralen Vektoren in 1-2 Tagen der Spaltung. Ob mit kommerziellen oder Labor vorbereitet Viren, kann es hilfreich sein, entsprechend titrieren Chargen des Virus im Voraus durch serielle Verdünnung ist. (Abbildung 3). </li><li> Um cel reduzierenzellulären Tod ersetzen Medien innerhalb von 8 h spinfection. HINWEIS: Viral Integration und Expression des Transgens sollte innerhalb von 24 Stunden nach Reportergen Fluoreszenz nachweisbar sein. (Wenn der Virus fehlt ein fluoreszierendes Reporter, das ist schwieriger zu beurteilen; erfolgreiche Transfektion kann am besten durch Immunoblot, Immunhistochemie oder qPCR zur Überexpression Produkte überprüft werden.) Voll Ausdruck kann 3-7 Tage; wiederholt spinfections mit zusätzlichen Virus benötigt, um den Prozentsatz der transfizierten Zellen erhöhen. Wiederkehrende spinfections kann täglich erfolgen, muss aber nicht so häufig. Im Idealfall, wenn mit einer fluoreszierenden Reporter,&gt; 80% der Zellen sollten gekennzeichnet werden. </li></ol> 5. Neurosphere Migration Assay HINWEIS: Neurospheres spontan bilden, nach der enzymatischen Spaltung von NPC (durch eine Art und Weise identisch zu der in NPC Expansion verwendet - Schritte 3,3-3,6), wenn die Zellen in Suspension in NPC Medien kultiviert werden. <ol><li> Kurz gesagt, wachsen distanzierend NPCs in NPC Medien für 48 Stunden in nichthaftende Platten, um Neurosphären zu erzeugen. (Abbildung 4). </li><li> Für Neurosphäre Migration, bereiten Sie frisches Matrigel Platten mit kaltem NPC Medien, anstatt DMEM, in einer 96-Well-Platte, 1-2 Stunden vor der Neurosphäre sammeln. Matrigel saugen Sie nicht aus den Vertiefungen. </li><li> Wie ursprünglich für embryonale Stammzellen abgeleiteten Neurosphären 22 veröffentlicht wurde, manuell NPC-derived Neurosphären holen unter dem Mikroskop nach einmaligem Waschen in NPC Medien, um Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen eines Neurosphäre zu jeder Vertiefung einer Matrigel-beschichtete 96-Well-Platte. </li><li> Hinzufügen eines zusätzlichen 0,5 mg Matrigel, in kaltem NPC Medium verdünnt, um die Neurosphären in jeder 96-Well-Platte. </li><li> Manuell Zentrierung jeder einzelnen Neurosphären in der Mitte des Bohrlochs unter Verwendung einer Pipettenspitze. HINWEIS: Es ist wichtig, Neurosphären von ähnlicher Größe wählen, um die Variabilität der Ergebnisse zu reduzieren. </li><li> Lassen Sie die Migration auf 48 Stunden auftreten und dann fix Zellen with 4% Paraformaldehyd und Fleck mit gewünschten immunhistochemischen Markern. </li><li> Wenn radiale Migration zu bestimmen ist, fotografieren Neurosphären in ihrer ganz mit einem 4x Mikroskopobjektiv. Schließen alle Neurospheres Kontaktieren der Kante des Bohrlochs oder eine zweite Neurosphäre aus der Analyse. HINWEIS: Bei der Umlagerung für länger als 48 Stunden, wird der resultierende radiale Migration wahrscheinlich zu groß, um sein Bild mit einem 4-fach Objektiv. </li><li> Messen durchschnittlichen Migration von jeder Neurosphären mit NIH ImageJ Software (Abbildung 5). Dies kann entweder unter Verwendung der unten beschriebenen Analyseverfahren durchgeführt werden: <ol><li> Radial-Migration: <ol><li> Manuelles Spuren den Rand der am weitesten wandernden Zellen mit dem Freihandauswahlwerkzeug verwenden Sie dann die Maßnahme (Strg + M) Funktion, um den Bereich der sich ergebende Form zu berechnen. Vor der Messung der Bereich, um sicherzustellen, dass Area liegt in der Set-Messungen Fenster unter der Registerkarte Analysieren finden überprüft. Verwenden Sie dieWert der Bereichsmessung und der Gleichung für die Fläche eines Kreises (A = &amp; pgr; r 2), um den Radius (äußeren) bestimmen. </li><li> Verfolgen Sie die Kante des Originals Neurosphäre, messen Sie den Bereich und die Berechnung der Radius (innen) in der gleichen Weise. Berechne den radialen Migration als die Differenz zwischen dem äußeren und inneren Radien. </li></ol></li><li> Greatest Zellmigration: <ol><li> Messen Sie den Abstand von den fünf am weitesten Zellen bewegt von der Kante der inneren Neurosphären mit dem geradlinigen Auswahlwerkzeug, gefolgt von der Maßnahme (Strg + M) Funktion. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben Methoden, mit denen zu unterscheiden hiPSCs in NPCs, ein neuronales Zelltyp, in dem ein erheblicher Anteil der Gen-Signatur von hiPSC abgeleiteten Neuronen erhalten bleibt und das kann als Näherungswert für die Entwicklungswege potenziell einen Beitrag zur Pathogenese der Erkrankung dienen 8 beschrieben, 11. Darüber, wie wir detailliert haben, sind NPCs ein robust replikativen und einfach transduzierten neuronalen Bevölkerung, die unserer Meinung nach für molekulare und biochemische Untersuchungen d...

Genexpressionsstudien von Neuronen in vitro aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) von uns 1 differenziert und andere 2,3 zeigen, dass hiPSC Neuronen ähnlich fetalen anstatt Erwachsenen Hirngewebe. Derzeit kann hiPSC basierte Modelle geeigneter für das Studium der Prädisposition statt später Merkmale, neurologischen Erkrankungen. Wir haben bereits berichtet, dass ein signifikanter Anteil der Gen-Signatur von Schizophrenie hiPSC abgeleiteten Neuronen bei Schizophrenie hiPSC neurale Vorläuferzellen (NPC) konserviert, was darauf hinweist, dass NPC eine nützliche Zelltyp für die Untersuchung der molekularen Wege beiträgt, Schizophrenie 1 sein . Wir und andere haben anomale Migration, erhöhten oxidativen Stress und reaktive Sauerstoffspezies, Sensibilität für Unterschwellenumweltbelastungen und einer Beeinträchtigung der Funktion der Mitochondrien bei der Schizophrenie hiPSC NPCs 1,4-6, sowie verringerte neuronale c berichtetVernetzungsoptionen und synaptische Funktion in der Schizophrenie hiPSC Neuronen 5,7-10. Wenn die molekularen Faktoren, die aberrant Migration und / oder oxidativer Stress bei Schizophrenie hiPSC NSC ebenfalls Grundlage der reduzierten neuronalen Konnektivitäts bei Schizophrenie hiPSC abgeleiteten Neuronen könnte NSC ein robustes und hoch replikativen neuronalen Population mit denen die Mechanismen der Erkrankung verantwortlich studieren. Darüber hinaus, weil man schnell erzeugen große Mengen von Zellen und müssen warten nicht Wochen oder Monate für die neuronale Reifung sind NPC basierte Assays geeignet für die Untersuchung von größeren Patientenkohorten und sind empfänglicher für Hochdurchsatz-Screening. Wir glauben, dass hiPSC NPCs können als Näherungswert für die Entwicklungswege potenziell einen Beitrag zur Pathogenese der Erkrankung dienen, wie bereits in so unterschiedlichen Erkrankungen wie Schizophrenie 1 und Huntington-Krankheit 11 gezeigt. Um NPCs aus hiPSCs, erste neuronale Differenzierung inProduktion von Dual-SMAD Hemmung (0,1 mM und 10 mM LDN193189 SB431542) 12 durchgeführt. Durch Antagonisierung BMP und TGF-Signalisierung mit dieser kleinen Moleküle wird Endoderm und Mesoderm Spezifikation blockiert, die Beschleunigung der neuronalen Differenzierung und die zur Bildung von sichtbaren neuronalen Rosetten innerhalb einer Woche nach Beschichtung. Neuronale Muster tritt früh in diesem Prozess, die vermutlich während der Periode des neuronalen Rosettenbildung und unmittelbar danach. In Ermangelung anderer Hinweise, diese primitiven Nervenzellen gehen von einer vorderen Stirnhirn ähnlichen Schicksal 13. Unmittelbar nach neuronalen Rosettenbildung und während NPC zu beobachtende Erweiterung sind Vorderhirn NPCs mit FGF2 8,14 kultiviert. Sie verfügen über Dual-Linie Potenzial und kann zu neuronalen Populationen von 70-80% III-Tubulin-positiven Neuronen und 20-30% saure Gliafaserprotein (GFAP) -positiven Astrozyten (Abbildung 1) zu unterscheiden. Der Großteil der Vorderhirn hiPSC Neuronen VGLUT1-positiveUnd so sind vermutlich glutamatergen, obwohl etwa 30% der Neuronen GAD67-positive (GABA) 8. NPCs werden regelmäßig mehr als zehnmal in vitro passagiert und gleichzeitig die konsistente Differenzierung Profile und ohne anfall Karyotyp Anomalien. Gruppen Passagieren NPCs mehr als 40-mal 15, aber wir finden, dass über zehn Passagen, NPCs zeigen eine erhöhte Neigung zu Astrozyten Differenzierung ausgewiesen. NPCs gut vertragen mehrere gefrier taut und wechselte als Neurosphären, indem Sie einfach die Kultivierung in nicht-haftenden Platten wachsen werden. NPCs werden effizient durch virale Vektoren transduziert und ermöglicht eine schnelle Auswertung der molekularen und zellulären Konsequenzen der genetischen Störung und einfach erweiterbar, um ausreichend Material für biochemische Untersuchungen ergeben. Darüber hinaus, da virale Vektoren erlauben robuste Überexpression und / oder Zuschlagskrankheitsrelevanter Gene, entweder Kontroll- oder Patienten gewonnen neural Zellen, kann man diese Plattform nutzen, um die Wirkung der genetischen Hintergrund auf diesen Manipulationen zu testen. Obwohl nicht für die synaptische oder aktivitätsbasierten Assays erfordern ausgereifte Neuronen geeignet, kann NPCs eine praktische Alternative für viele einfache molekulare oder biochemische Analysen von Patienten stammende Nervenzellen sein.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#11330</td><td>für HES-Medien</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#10565</td><td>für neuronale</td></tr><tr><td>Medien KO-Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>#10828</td><td>Muss auf Chargen getestet werden</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#11140</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#17502-048</td><td>Muss auf Charge getestet</td></tr><tr><td>werden B27-RA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#12587-010</td><td>Muss auf Charge getestet</td></tr><tr><td>werden FGF2</td><td>Life Technologies</td><td>#13256-029</td><td>Resuspension in PBS + 1% BSA</td></tr><tr><td></td><td>LDN193189 Stemgent</td><td>#04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>#04-0010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>#450-02</td><td>Resuspendierung in PBS + 0,1% BSA</td></tr><tr><td>GDNF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;#450-10</td><td>Resuspendierung in PBS + 0,1 % BSA</td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclisch-AMP</td><td>Sigma</td>&<td>nbsp;#D0627</td><td>Resuspendierung in PBS + 0,1 % BSA</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>#A0278</td><td>Resuspendierung in H20</td></tr><tr><td>STEMdiff Neuralrosettenauswahl Reagenz</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>&nbsp;#05832</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>#17104019</td><td></td></tr><tr><td>CF1 mEFs</td><td>Millipore</td><td>#PMEF-CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, natürliche Maus 1 mg</td><td>Life Technologies</td><td>#23017-015</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD</td><td>#354230</td><td>Resuspendieren Sie auf Eis in kaltem DMEM bei 10 mg/ml, verwenden Sie 1 mg pro zwei 6-Well-Plattenäquivalenten</td></tr><tr><td>Mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten mit extrem geringer Bindung</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sox2&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>schüchtern; 17320</td><td>Verwendung bei 1:200</td></tr><tr><td>Maus Anti-Mensch Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>Verwendung bei 1:200</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-&Beta; III-Tubulin</td><td>Covance</td><td>PRB&shy; 435P</td><td>Nutzung bei 1:500</td></tr><tr><td>Maus Anti-&Beta; III-Tubulin</td><td>Covance</td><td>MMS&shy; 435P</td><td>Verwendung bei 1:500</td></tr><tr><td>Maus Anti-MAP2AB</td><td>Sigma</td><td>M1406</td><td>Verwendung bei 1:200</td></tr><tr><td>Plattenzentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Coulter Allegra X-14 (mit SX4750 Plattenträger)</td><td></td></tr></tbody></table>

eine anleitung zum erstellen und verwenden von hipsc abgeleitet npcs für das studium der neurologische erkrankungen

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Postmortale Untersuchungen neurologischer Erkrankungen sind nicht ideal, um die zugrunde liegenden Ursachen für die Entstehung von Krankheiten zu identifizieren, da viele Krankheiten eine lange Periode des Fortschreitens der Krankheit vor dem Auftreten von Symptomen beinhalten. Da Fibroblasten von Patienten und gesunden Kontrollpersonen effizient in humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) umprogrammiert und anschließend zu neuralen Vorläuferzellen (NPCs) und Neuronen für die Untersuchung dieser Krankheiten differenziert werden können, ist es nun möglich, die Entwicklungsereignisse zu rekapitulieren, die vor dem Auftreten der Symptome bei Patienten auftraten. Wir stellen eine Methode vor, mit der hiPSCs effizient in NPCs differenziert werden können, die nicht nur in der Lage sind, sich weiter in funktionelle Neuronen zu differenzieren, sondern auch robust passageiert, eingefroren oder überführt werden können, um als Neurosphären zu wachsen, was ein schnelles genetisches Screening ermöglicht, um die molekularen Faktoren zu identifizieren, die zelluläre Phänotypen beeinflussen, einschließlich Replikation, Migration, oxidativer Stress und/oder Apoptose. Patienteneigene hiPSC-NPCs sind eine einzigartige Plattform, die sich ideal für die empirische Untersuchung der zellulären oder molekularen Folgen der Manipulation der Genexpression eignet.

Neural Rosetten können morphologisch durch ihre charakteristische Aussehen als runde Clustern Neuroepithelzellen mit apikal-basal Polarität (Abbildung 1) identifiziert werden, mit einem Hellfeldmikroskop. Obwohl NPCs sind in der Regel bei sehr hohen Zelldichte kultiviert, unmittelbar im Anschluss an Passagieren, leicht pyramidenförmige Soma und Neuriten bipolare Struktur sichtbar (Abbildung 1D). Validiert NSC exprimieren NESTIN und SOX2 in der Mehrzahl der Zellen, jedoch III-Tubulin-Fär...

Dieses Protokoll beschreibt, wie neurale Vorläuferzellen von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen unterschieden werden können, um eine robuste und replikative neuronale Zellpopulation zu erhalten, die zur Identifizierung der Entwicklungswege verwendet werden kann, die zur Krankheitspathogenese bei vielen neurologischen Erkrankungen beitragen.

Eine Anleitung zum Erstellen und Verwenden von hiPSC Abgeleitet NPCs für das Studium der Neurologische Erkrankungen

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neuronale Vorläuferzellen oder NPCs aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen oder hiPSCs als Plattform zur Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die zu neurologischen Erkrankungen beitragen, zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem hiPSCs zunächst mithilfe von dualen SMAD-Inhibitoren zu neuralen Rosetten differenziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, diese neuralen Rosetten zu gewinnen und sie zu expandierbaren NPC-Populationen heranwachsen zu lassen.Als nächstes erfolgt die lentivirale Transduktion mit einer Spin-Infektion. Dieser Schritt zur Verbesserung der Effizienz wird verwendet, um die Genexpression zu modulieren. Der letzte Schritt besteht darin, die NPCs in Suspension zu kultivieren, sodass sie spontan Neurophären bilden.Schließlich kann diese Plattform zur Untersuchung einer Vielzahl zellulärer Phänotypen eingesetzt werden. Zum Beispiel zur Messung des Effekts genetischer Eingriffe auf die Neuro-Migration. Diese Methode kann Einblicke in zelluläre Mechanismen wie die Migration liefern.Sie kann auch zur Untersuchung anderer biologischer Prozesse wie Replikation, oxidativem Stress, Apoptose und Neuritauswuchs angewendet werden. Die Differenzierung menschlicher induzierter pluripotenter Stammzellen oder hochgradiger PSCs führt zur Bildung sichtbarer neuraler Rosetten, die sich als runde Zellverbände aus neuroepithelialen Zellen mit apikobasaler Polarität charakterisieren und die enzymatische Selektion neuraler Rosetten am Tag 14 ermöglichen. Entfernen Sie das Medium von den anhaftenden Embryoidkörpern oder EBs und geben Sie je nach Vertiefung einer sechswelligen Platte ein Milliliter Neuralrosetten-Selektionsreagenz hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Nach einer Stunde. Entfernen Sie mit einer P-1000-Pipette vorsichtig das Enzym aus jedem Brunnen und geben Sie je einen Milliliter D-M-E-M-F 12 pro Brunnen hinzu. Zum Waschen der Rosetten sammeln Sie den einen Milliliter D-M-E-M-F 12 und spritzen ihn schnell wieder in den Brunnen zurück, wodurch die Rosetten von der Platte gelöst werden.Sammeln Sie die Rosetten in einem Falcon-Röhrchen. Pipettieren Sie ein weiteres Mal ein Milliliter D-M-E-M-F 12 und geben Sie es schnell in dasselbe Bohrloch, um die verbleibenden Rosetten zu lösen. Versuchen Sie dabei nicht, die Rosettenaggregate aufzubrechen. Sammeln Sie die neuronalen Rosetten im selben Falcon-Röhrchen.Wenn die Rosetten nicht leicht ablösen, sobald alle neuralen Rosetten gesammelt wurden, kann mehr Enzym zugegeben und dieses Verfahren wiederholt werden. Zentrifugieren Sie das Falcon-Röhrchen bei 300 G für drei Minuten. Aspirieren Sie die Waschflüssigkeit und resuspendieren Sie den Pellet.Suspendieren Sie die Rosetten in zwei Milliliter Neural-Progenitor-Zell-Medium. Überführen Sie die Zellen in eine mit Poly-L-Ornithin beschichtete Sechswellplatte und kultivieren Sie sie eine Woche lang bei 37 Grad Celsius. In diesem Labor werden Neural-Progenitor-Zellen oder NPCs auf Matrigel-Platten kultiviert, alle zwei Tage frisch versorgt und in sehr hoher Dichte gehalten.Um die NPCs zu trennen, aspirieren Sie zuerst das Medium und geben dann ein Milliliter warmes Accutase pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten. Überführen Sie die abgelösten Zellen vorsichtig mit möglichst geringer mechanischer Belastung in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das D-M-E-M-F 12 enthält. Pipettieren Sie die Zellen nicht auf und ab, während sie im Enzym sind. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 ×g für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren die NPCs.Bei etwa einem Milliliter NPC-Medium pro ursprünglichem Brunnen einer Sechs-Loch-Platte werden fünf bis zehn Millionen Zellen pro konfluentem Brunnen einer Sechs-Loch-Platte nach Resuspension und Zellzählung erwartet. Rekultivieren Sie die NPCs mit etwa einer bis zwei Millionen Zellen pro Brunnen einer Sechs-Loch-Platte, um die NPCs zu erhalten. Die Effizienz der Neurosphärenbildung variiert zwischen Experimenten und Zelllinien, gelingt aber gewöhnlich am besten, wenn zwischen 200.000 und einer Million Zellen pro Brunnen einer sechsbrüchigen nichtadhärenten Platte ausgesät werden. Falls es zu Klumpenbildung kommt, reduzieren Sie die Anzahl der ausgesäten Zellen. Idealweise erfolgt dies innerhalb von ein bis zwei Tagen nach dem Teilen.Die NP-NPCs sollten mit lentiviralen oder retroviralen Vektoren transduziert werden, um den Prozentsatz transfizierter Zellen zu erhöhen. Verwenden Sie eine Spin-Infektion. Aspirieren Sie das Medium aus jedem Well und ersetzen Sie es durch die entsprechenden Überexpressions- oder Kontrolllentiviren bzw. -retroviren, die auf die gewünschte Multiplizität der Infektion eingestellt und verdünnt wurden.Im NPC-Medium 1,5 Milliliter pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte bei 1000 × g und Raumtemperatur eine Stunde lang in einem Plattenzentrifugenrotor zentrifugieren. Nach der Zentrifugation die Platte zur Verringerung des Zelltods zurück in den Inkubator stellen. Das Medium innerhalb von acht Stunden nach der Zentrifugationsinfektion erneuern.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die aus NPCs abgeleiteten Neurosphären einmal in NPC-Medium waschen, um zellulären Abfall zu entfernen. Kippen Sie die Platte in einem Winkel von 45 Grad und lassen Sie die Neurosphären absinken; anschließend entfernen Sie so viel Medium wie möglich, ohne die Neurosphären abzusaugen. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium.Als Nächstes heben Sie die aus NPCs abgeleiteten NEUROSPHÄREN unter dem Mikroskop manuell mit einer P-200-Pipette auf und geben jeweils eine Neurosphäre in jede Vertiefung einer mit Matrigel beschichteten 96-Loch-Platte. Es ist wichtig, Neurosphären ähnlicher Größe auszuwählen, um die Variabilität der Ergebnisse zu verringern. Geben Sie zusätzlich 0,5 Milligramm Matrigel, verdünnt in kaltem NPC-Medium, zu den Neurosphären in jeder 96-Loch-Platte hinzu.Positionieren Sie mithilfe einer Pipettenspitze jede einzelne Neuroosphäre manuell in der Mitte der Vertiefung. Lassen Sie die Migration der Neurosphären für 48 Stunden stattfinden. Nach Fixierung und Färbung der Zellen mit den gewünschten immunhistochemischen Markern fotografieren Sie die Neurosphären vollständig mit einem Forex-Mikroskopobjektiv. Zur Messung der radialen Migration verwenden Sie die Image-J-Software.Verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug, um die Kante der am weitesten migrierten Zellen manuell nachzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass im Fenster „Messungen festlegen“ unter der Registerkarte „Analysieren“ die Option „Fläche“ aktiviert ist. Verwenden Sie anschließend die Messfunktion, um die Fläche der resultierenden Form zu berechnen.Verwenden Sie den Wert der Flächenmessung und die Gleichung für die Fläche eines Kreises, um den äußeren Radius auf die gleiche Weise zu bestimmen, indem Sie den Rand der ursprünglichen Neurosphäre nachzeichnen. Messen Sie die Fläche und berechnen Sie den inneren Radius. Berechnen Sie die gesamte radiale Migration als Differenz zwischen äußerem und innerem Radius.Diese Bilder zeigen die Stadien der neuronalen Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (PSCs), beginnend bei den PSCs über Embryoidkörper, neurale Rosetten, neuronale Vorläuferzellen (NPCs) bis hin zu Neuronen. Validierte NPCs exprimieren den NPC-Marker Nestin sowie den Transkriptionsfaktor SOX2 in den meisten Zellen. Die Färbung für Beta-3-Tubulin ist außerdem in allen NPC-Populationen sichtbar. NPCs exprimieren zudem den Transkriptionsfaktor PAC6 und den Marker für Vorfahren der Großhirnrinde.TBR zwei, jedoch keine Mittelhirnmarker wie LMX1A und FOXA2. NPCs können sich zu 70–80 % beta-3-Tubulin-positiven Neuronen (grün dargestellt) und zu 20–30 % glialen fibrillären sauren Proteinen (GFAP)-positiven Astrozyten (rot dargestellt) differenzieren, bei hochwertigen hiPSCs. Hochwertige NPCs exprimieren Nestin und SOX2 in den meisten Zellen, während niedrigwertige NPCs Bereiche von SOX2-negativen und Nestin-negativen Zellen aufweisen. Vier Wochen alte Neuronen, die sich aus hochwertigen NPCs differenziert haben, exprimieren MAP2AB und beta-3-Tubulin.Nach erfolgreicher Transduktion mit einem hochtitrigen lentiviralen oder retroviralen Vektor sind mehr als 80 % der Zellen mit dem fluoreszenten Reporter markiert. Die Einbeziehung des Vektors in die Neurosphären-Generierung führt zu einer Population von Neurosphären relativ homogener Größe, die etwa eine Woche lang gesund in Kultur gehalten werden können.Bei regelmäßiger Fütterung tritt eine robuste Neurosphären-Migration in gesunden Neurosphären auf, wie diese Hellfeldaufnahmen vor und nach 48 Stunden Migration in Matrigel nach der Entwicklung veranschaulichen. Diese Technik eröffnete für Forscher im Bereich Schizophrenie die Möglichkeit, die neuronale Migration in aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Nervenvorläuferzellen (NPCs) zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Retroviren potenziell gefährlich sein kann und sämtliche Zellkulturarbeiten unter Biosicherheitsstufe zwei plus (BSL-2+) Bedingungen durchgeführt werden sollten, wenn Viren potenziell vorhanden sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

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